40 3 679 689 中國生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2024 年 6 月 收稿日期 2023 08 04 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)青 年基金 32202385 臨沂大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目 LYDX2020BS032 臨沂大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 X202210452276 作者簡介 張絲雨 女 本科生 E mail 2237381657 通信作者 博士 講師 E mail liubinghua12345 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2024 02 024 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1對番茄灰霉病的防治效果 及全基因組分析 張絲雨 高文靜 張丙翠 楊 吉 劉煥珊 劉炳花 臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院 臨沂 276000 摘要 為了研究甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果 采用 NKG 1 發(fā)酵液處理番茄灰霉 菌 觀察番茄灰霉菌菌絲生長狀態(tài) 測定菌絲干重 抑菌率 調(diào)查其對番茄離體葉片 苗期灰霉病防治效 果 結(jié)果顯示甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 顯著抑制番茄灰霉菌菌絲的生長和產(chǎn)孢 對番茄離體葉片灰霉 病防治效果達(dá) 80 00 對苗期番茄灰霉病的防治效果達(dá) 73 14 通過對 NKG 1 全基因組進(jìn)行分析預(yù)測 發(fā)現(xiàn)該菌含有 12 個(gè)次級代謝產(chǎn)物基因簇 其中脂肽類抗生素表面活性素和豐原素具有抑菌作用 且豐原 素已被證實(shí)具有強(qiáng)烈的抗真菌活性 本研究為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 防治番茄灰霉病的應(yīng)用和解析 防病機(jī)理提供了重要的理論基礎(chǔ) 關(guān) 鍵 詞 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 番茄灰霉病 全基因組 NKG 1 中圖分類號 S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1005 9261 2024 03 0679 11 Control Effect of Bacillus methylotrophicus NKG 1 on Tomato Gray and Its Genome Wide Analysis ZHANG Siyu GAO Wenjing ZHANG Bingcui YANG Ji LIU Huanshan LIU Binghua College of Agriculture and Forestry Linyi University Linyi 276000 China Abstract To investigate control effect of Bacillus methylotrophicus NKG 1 on tomato gray mold dry weight of B cinerea and inhibition rate and control efficacy of NKG 1 on tomato gray mold were investigated after treatment with the fermentation broth of NKG 1 The results showed that NKG 1 significantly inhibited the hyphae growth and spore production of B cinerea The control efficacy of NKG 1 against gray mold on tomato leaves in vitro was 80 00 and that on tomato plant at seedling stage was 73 14 By analyzing and predicting the whole genome of NKG 1 it was found that the NKG 1contained 12 secondary metabolite gene clusters Among them lipopeptide antibiotics surfactant and fengycin have antibacterial effects Fengycin has been proved to have strong antifungal activity The above results provide an important theoretical basis for application of B methylotrophicus NKG 1 to control tomato gray mold and are helpful to analyze the biological control mechanism of B methylotrophicus NKG 1 Key words Bacillus methylotrophicus tomato gray mold whole genome NKG 1 番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一種常見的真菌性病害 其病原菌不僅侵染番茄葉 片和莖稈造成葉片病斑和莖部腐爛 而且還會(huì)侵染果實(shí)導(dǎo)致番茄果實(shí)腐爛 1 在我國番茄種植已成為蔬菜 產(chǎn)業(yè)的重要組成部分 番茄灰霉病在全國番茄種植區(qū)均有發(fā)生 一旦發(fā)病后傳播速度極快 對番茄產(chǎn)量和 680 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 40 卷 品質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生極大的影響 通常會(huì)造成番茄減產(chǎn) 20 50 嚴(yán)重時(shí)可達(dá) 60 以上甚至?xí)?dǎo)致絕產(chǎn) 2 番 茄灰霉病的防治通常以化學(xué)防治為主 但由于灰霉菌具有繁殖速度快 遺傳變異大和適合度高的特性 傳 統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的大量使用不僅會(huì)誘發(fā)灰霉菌的耐藥性還會(huì)造成殘留問題 對生態(tài)環(huán)境和人類健康都造成了 極大地危害 3 4 近年來 國家和人們對食品安全和生態(tài)環(huán)境越來越重視 對無公害 綠色 有機(jī)果蔬的需 求也大幅增加 這使得對人畜無害 自然環(huán)境污染小 不易產(chǎn)生抗藥性的生物農(nóng)藥逐漸成為預(yù)防 治療和 控制番茄灰霉病和其他植物病蟲害重要而有效的途徑 5 然而當(dāng)前我國生物農(nóng)藥市場占有率不足 10 無 論是種類還是數(shù)量都無法滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求 因此開發(fā)和推廣應(yīng)用新的生物農(nóng)藥產(chǎn)品迫在眉睫 6 目前 市面上作為灰霉病殺菌劑的生物農(nóng)藥的活性成分微生物有 枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis 解 淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 巨大芽胞桿菌 Bacillus megatherium 熒光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens 哈茨木霉菌 Trichoderma harzianum 等 芽胞桿菌類殺菌劑是防治灰霉病的主要生防產(chǎn)品 7 10 貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis 5YN8 能夠顯著防治番茄灰霉病 11 貝萊斯芽胞桿菌 WZ 37 的發(fā)酵粗 提液對番茄灰霉病的防治效果到達(dá) 68 5 12 枯草芽胞桿菌 HMB19198 發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果達(dá) 到 70 20 接近于化學(xué)農(nóng)藥的防效 13 李鳳碩 14 研究結(jié)果表明 枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌其混菌 組合為 1 2 時(shí)噴施番茄植株 發(fā)現(xiàn)番茄植株超氧化物歧化酶和氧化物酶的含量均顯著提高 番茄植株對灰 霉病的抗病能力增強(qiáng) 發(fā)病率顯著降低 利用芽胞桿菌防治植物病害雖然取得了一定的進(jìn)展 但目前許多 具有生防潛力的芽胞桿菌在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中存在不穩(wěn)定 見效慢的情況 原因之一與芽胞桿菌生防機(jī)制不 明確有關(guān) 15 為真正解決芽胞桿菌在植物病害防治中的穩(wěn)定性和高效性問題 對芽胞桿菌防治植物病害的 作用機(jī)制研究就必不可少 16 目前關(guān)于芽胞桿菌的防病機(jī)理主要集中在抗生作用 誘導(dǎo)抗病性 空間和營養(yǎng)競爭 定殖 溶菌作 用等方面 其中抗生作用被認(rèn)為是最主要的防病機(jī)理 17 抗生作用是芽胞桿菌作為生防菌防治植物真菌病 害的重要機(jī)制之一 芽胞桿菌可通過產(chǎn)生脂肽類抗生素 水解酶等多種胞外代謝物質(zhì)導(dǎo)致植物病原真菌菌 絲畸形 菌絲端破裂 原生質(zhì)濃縮以及抑制孢子萌發(fā) 18 已有大量研究發(fā)現(xiàn) 芽胞桿菌抗真菌活性主要?dú)w 因于非核糖體合成途徑產(chǎn)生的脂肽類抗生素 19 20 抗細(xì)菌活性主要?dú)w因于非核糖體合成途徑產(chǎn)生的脂肽類 抗生素和核糖體合成途徑產(chǎn)生的細(xì)菌素 21 非核糖體合成途徑產(chǎn)生的脂肽類抗生素在芽胞桿菌在防治植物 真菌病害中起到關(guān)鍵作用 22 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 Bacillus methylotrophicus NKG 1 是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所從采自長 白山土壤樣品中分離獲得的一株具有廣譜抑菌活性和對植物具有顯著促生作用的生防菌株 23 24 本研究通 過測定甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉菌的抑菌率 生物量和生長形態(tài)的影響以及苗期番茄灰霉 病的防治試驗(yàn)來說明其對番茄灰霉病的防治效果 通過對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組進(jìn)行分析 預(yù)測 初步探究了其防病機(jī)制 本研究將有助于解析甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 的生防機(jī)制 為下一步 在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 防治番茄灰霉病提供理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 1 1 1 供試菌株 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 番茄灰霉菌 B05 10 均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究 所農(nóng)用抗生素課題組提供 1 1 2 供試種子 番茄種子為中蔬四號 1 1 3 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 蒸餾水定容至 1000 mL 分 裝至三角瓶 121 滅菌 30 min 用于芽胞桿菌 NKG 1 的培養(yǎng) PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g 煮沸 30 min 后過濾留濾液加入葡萄糖 20 g 瓊脂 15 20 g 蒸餾水定容至 1000 mL 分裝三角瓶 121 滅菌 30 min 用于番茄灰霉菌的培養(yǎng) 1 2 菌株和番茄苗的培養(yǎng) 1 2 1 芽胞桿菌無菌發(fā)酵液的制備 將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NKG 1 菌液按體積比 2 的比例接種至 LB 培 養(yǎng)基 28 220 r min 的條件下振蕩培養(yǎng)約 48 h 至菌液濃度達(dá)到 1 10 8 cfu mL 將培養(yǎng)好的菌液離心取 第 3 期 張絲雨等 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果及全基因組分析 681 上清后用直徑為 0 22 m 的濾膜過濾 得到 NKG 1 的無菌發(fā)酵液 1 2 2 番茄灰霉菌的培養(yǎng) 采用直徑為 5 mm 的打孔器將番茄灰霉菌制成菌餅 將菌餅置于 PDA 培養(yǎng)基平 板中央 23 培養(yǎng)至番茄灰霉菌均產(chǎn)孢并且菌絲鋪滿整個(gè)培養(yǎng)基平板 1 2 3 番茄苗的種植 采用溫湯浸種的方法處理番茄種子 冷卻至室溫后 將種子均勻地放置于培養(yǎng)皿中 28 的恒溫進(jìn)行催芽 將已萌發(fā)的番茄種子種植于營養(yǎng)土 蛭石和珍珠巖 3 1 1 的塑料花盆中 將種植的 番茄苗置于溫室培養(yǎng) 生長環(huán)境條件如下 溫度為 25 20 光 暗 相對濕度控制在 70 左右 光周 期為 18 h 6 h 光 暗 1 3 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑制效果 在 PDA 培養(yǎng)基中添加甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 無菌發(fā)酵液 其濃度分別為體積比 0 5 1 2 5 10 以不添加芽胞桿菌發(fā)酵液的 PDA 培養(yǎng)基作為對照 在 PDA 培養(yǎng)基平板中央接種直徑為 5 mm 的番茄灰霉菌 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 待對照組灰霉菌長滿平板后 觀察各個(gè)試驗(yàn)組灰霉菌的生長情況 試 驗(yàn)重復(fù) 3 次 測量每組番茄灰霉菌生長直徑 計(jì)算 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌生長的抑制率 抑制率 對照菌組落直徑 處理組菌落直徑 對照菌落直徑 100 1 4 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌菌絲生長的影響 配置不含瓊脂的液體 PDA 培養(yǎng)基 將 NKG 1 發(fā)酵液按 0 5 1 5 10 的體積比添加至液體 PDA 培養(yǎng)基中 不添加發(fā)酵液的培養(yǎng)基作為對照 在液體培養(yǎng)基中接種直徑為 5 mm 的番茄灰霉菌菌餅 置于 搖床中 在 23 120 r min 的條件下震蕩培養(yǎng) 5 d 將培養(yǎng) 5 d 的番茄灰霉菌經(jīng)濾紙過濾后放入烘箱 90 烘至恒重 試驗(yàn)重復(fù) 3 次 稱量各組番茄灰霉菌的菌絲干重 1 5 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌菌絲形態(tài)的影響 在 PDA培養(yǎng)基中添加體積比為 1 的芽胞桿菌 NKG 1發(fā)酵液 以不添加芽胞桿菌 NKG 1發(fā)酵液的 PDA 培養(yǎng)基作為對照 在 PDA 培養(yǎng)基平板中央接種直徑為 5 mm 的番茄灰霉菌 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 待對照組 灰霉菌產(chǎn)孢且菌絲長滿平板后 取適量未經(jīng)處理的番茄灰霉菌和含有 1 的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā) 酵液的培養(yǎng)基培養(yǎng)的番茄灰霉菌菌絲制成臨時(shí)玻片 置于放大相同倍數(shù) 10 10 顯微鏡下 觀察菌絲形 態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài) 1 6 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果 1 6 1 離體葉片試驗(yàn) 摘取大小 規(guī)格和生長發(fā)育狀況一致的番茄葉片 放入載有濾紙片的干凈培養(yǎng)皿中 在葉片中央放置直徑為 5 mm 的番茄灰霉菌菌餅 24 h 后將稀釋 5 倍 10 倍 20 倍的芽胞桿菌 NKG 1 的 無菌發(fā)酵液均勻噴施于試驗(yàn)組的葉片 直至葉片全部潤濕 同時(shí)用相同體積的無菌水噴施對照組番茄葉片 待試驗(yàn)進(jìn)行到第 4 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)各組葉片的發(fā)病率和防治效果 1 6 2 番茄植株試驗(yàn) 當(dāng)番茄植株幼苗長到 4 葉 1 心時(shí) 將在 PDA 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 7 d 的番茄灰霉菌 孢子用無菌水從培養(yǎng)基上洗脫過濾 6000 r min 離心 5 min 倒掉上清液 收集灰霉菌孢子 采用 2 濃度 的蔗糖溶液重懸浮孢子使其濃度為 2 10 5 cfu mL 將番茄灰霉菌孢子懸浮液均勻地噴施番茄植株的葉片和 莖部 噴至葉片濕潤 接種后保持光照培養(yǎng)箱中的空氣相對濕度在 90 以上 噴施灰霉菌孢子懸浮液 24 h 后 將稀釋 5 倍 10 倍 20 倍的芽胞桿菌 NKG 1 的發(fā)酵液均勻噴施于試驗(yàn)組的葉片和莖部 直至葉片全 部潤濕 同時(shí)用相同體積的無菌水噴施對照組的番茄植株 試驗(yàn)重復(fù) 3 次 待植株發(fā)病后 分級調(diào)查各組 的發(fā)病情況 番茄灰霉病葉片分級標(biāo)準(zhǔn) 0 級為無病斑 1 級病斑面積占整個(gè)葉面積 5 以下 3 級病斑面 積占整個(gè)葉面積 6 10 5 級病斑面積占整個(gè)葉面積 11 20 7 級病斑面積占整個(gè)葉面積 21 50 9 級病斑面積占整個(gè)葉面積 50 以上 25 計(jì)算發(fā)病率 病葉率 病情指數(shù)和防治效果 病葉率 病 葉數(shù) 總?cè)~數(shù) 100 病情指數(shù) 各級病葉數(shù) 相對級數(shù)值 調(diào)查總?cè)~數(shù) 最高級代表值 100 發(fā)病率 發(fā)病植株數(shù) 總植株數(shù) 100 防治效果 對照組病情指數(shù) 處理組病情指數(shù) 對照病情指數(shù) 100 1 7 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組分析及基因功能注釋 提取甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組 DNA 進(jìn)行三代測序 使用 SMRT portal 軟件對 reads 進(jìn)行 組裝和比對 統(tǒng)計(jì) map 到最長序列的測序深度分布情況 將得到的初步組裝結(jié)果進(jìn)行比對分析 篩分染色 682 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 40 卷 體 并將染色體序列組裝成為一個(gè)線性基因組序列 即最終獲得 0 gap 完整圖序列 將預(yù)測得到的基因序 列與 COG Cluster of Orthologous Groups of proteins KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 等數(shù)據(jù)庫做 BLAST 比對 得到基因功能注釋結(jié)果 1 8 分析預(yù)測甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 次級代謝基因簇 利用次級代謝分析軟件 anti SMASH ThioFinder 等數(shù)據(jù)庫對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組序 列進(jìn)行分析 結(jié)合 StreptomeDB ClusterMine360 DoBISCUIT 等數(shù)據(jù)庫 預(yù)測甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組中次級代謝基因簇類型 位置及對應(yīng)產(chǎn)物 2 結(jié)果與分析 2 1 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑制效果 在 PDA 培養(yǎng)基上接種的番茄灰霉菌培養(yǎng) 5 d 時(shí) 對照組灰霉菌直徑到達(dá) 9 cm 添加 NKG 1 發(fā)酵液體 積比為 0 5 1 2 的培養(yǎng)基上灰霉菌的平均生長直徑分別為 1 67 1 37 1 30 cm 其抑菌率分別為 81 48 84 48 和 85 56 表 1 培養(yǎng)基中添加 NKG 1 發(fā)酵液體積比為 5 10 的番茄灰霉菌均為 0 50 cm 抑菌率 94 44 圖 1 表 1 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對灰霉菌抑菌率 Table 1 Bacteriostatic rate of different concentrations of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on B cinerea NKG 1 濃度 Concentration of NKG 1 菌落直徑 Colony diameter cm 抑菌率 Inhibition rate CK 9 00 0 00 a 0 00 0 5 1 67 0 12 b 81 48 1 12 c 1 1 37 0 15 c 84 81 1 07 b 2 1 30 0 10 c 85 56 1 26 b 5 0 50 0 00 d 94 44 0 00 a 10 0 50 0 00 d 94 44 0 00 a 注 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)在 0 05 差異顯著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 0 5 NKG 1 發(fā)酵液 Fermentation broth B 1 NKG 1 發(fā)酵液 Fermentation broth C 2 NKG 1 發(fā)酵液 Fermentation broth D 5 NKG 1 發(fā) 酵液 Fermentation broth E 10 NKG 1 發(fā)酵液 Fermentation broth 圖 1 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌的抑制效果 Fig 1 Inhibition effect of different concentrations of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on B cinerea 2 2 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌生物量的影響 番茄灰霉菌在液體 PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 d 后菌絲體平均干重達(dá)到 1 09 g 而在培養(yǎng)基中添加不同濃度 的 NKG 1 發(fā)酵液后菌絲體干重顯著降低 添加體積比為 0 5 1 2 和 5 的 NKG 1 發(fā)酵液后番茄灰 霉菌菌絲體平均干重分別為 0 53 0 36 0 17 和 0 02 g 圖 2 結(jié)果表明 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 可以顯著抑制番茄灰霉菌菌絲的生長 2 3 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌菌絲形態(tài)的影響 顯微鏡下觀察菌絲的生長和產(chǎn)孢狀況結(jié)果顯示 為未經(jīng)處理的番茄灰霉菌 菌絲體粗壯 顏色為深灰 色或黑色 其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)子實(shí)體飽滿 有些正在釋放黑色孢子 圖 3A B 1 NKG 1 發(fā)酵液處理后的菌 絲體纖細(xì) 顏色變淺為灰色或褐色 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)子實(shí)體瘦小且不產(chǎn)生黑色的孢子 圖 3C D 甲基營養(yǎng)型 芽胞桿菌 NKG 1 抑制菌絲的生長 影響菌絲的形態(tài)和產(chǎn)孢 第 3 期 張絲雨等 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果及全基因組分析 683 灰霉菌菌絲干重 The dry weigh t o f B cin e r e a g 圖 2 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 菌液處理番茄灰霉菌菌絲干重 Fig 2 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on hyphae dry weight of B cinerea A 未處理的番茄灰霉菌菌絲狀態(tài) Hyphae morphology of untreated B cinerea B 未處理的番茄灰霉菌子實(shí)體 Fruiting body of untreated B cinerea C 1 NKG 1 發(fā)酵液處理后的菌絲狀態(tài) Hyphae morphology of 1 NKG 1 fermentation broth treated B cinerea D 1 NKG 1 發(fā)酵液處理后的子實(shí)體 Fruiting body of 1 NKG 1 fermentation broth treated B cinerea 圖 3 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉菌菌絲形態(tài)的影響 Fig 3 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on hyphae morphology of B cinerea 2 4 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果 2 4 1 離體葉片試驗(yàn) 接種番茄葉片后未噴施 NKG 1 發(fā)酵液的離體葉片全部發(fā)病 發(fā)病率達(dá) 100 并且 葉片黃化嚴(yán)重 而噴施 NKG 1 發(fā)酵液后的離體葉片發(fā)病率顯著降低 葉片只有發(fā)病部位顏色發(fā)生變化 圖 4 噴施稀釋 5 倍 10 倍和 20 倍的 NKG 1 發(fā)酵液的離體葉片發(fā)病明顯減輕 防治效果分別為 80 00 66 67 53 33 表 2 表 2 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄離體葉片灰霉病防治效果 Table 2 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold of tomato leaves in vitro NKG 1 濃度 Concentration of NKG 1 發(fā)病率 Incidence rate 防治效果 Control effect CK 100 00 0 00 a 0 00 5 20 00 0 00 d 80 00 0 00 a 10 33 33 3 28 c 66 67 2 33 b 20 46 66 2 61 b 53 33 3 32 c 注 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)在 0 05 差異顯著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 684 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 40 卷 A 無菌水對照 Sterile water control B 噴施稀釋 5 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 5 times C 噴施稀釋 10 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 10 times D 噴施稀釋 20 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 20 times 圖 4 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄離體葉片灰霉病防治效果 Fig 4 The effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold 2 4 2 番茄植株試驗(yàn) 噴施稀釋 5 倍 10 倍和 20 倍的 NKG 1 發(fā)酵液的番茄病葉率 病情指數(shù)和發(fā)病率均 顯著低于噴施無菌水的對照組 病情指數(shù)分別為 8 23 12 47 和 17 23 其防治效果分別達(dá)到 73 14 59 27 和 43 73 表 3 結(jié)果表明 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉病具有顯著的防治 效果 圖 5 表 3 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果 Table 3 Effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold NKG 1 濃度 Concentration of NKG 1 病葉率 Rate of diseased leaves 病情指數(shù) Disease index 發(fā)病率 Incidence rate 防治效果 Control effect CK 49 03 0 64 a 30 71 0 47 a 56 83 0 43 a 0 00 5 22 22 0 40 d 8 23 0 20 d 27 45 0 20 d 73 14 0 30 a 10 25 44 026 c 12 47 0 30 c 34 69 0 25 c 59 27 0 20 b 20 33 93 0 20 b 17 23 0 50 b 44 06 0 61 b 43 73 0 32 c 注 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)在 0 05 差異顯著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 無菌水對照 Sterile water control B 噴施稀釋 5 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 5 times C 噴施稀釋 10 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 10 times D 噴施稀釋 20 倍的 NKG 1 發(fā)酵液 Spray NKG 1 broth diluted 20 times 圖 5 不同濃度甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 發(fā)酵液對番茄灰霉病防治效果 Fig 5 Effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold 第 3 期 張絲雨等 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果及全基因組分析 685 2 5 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組測序結(jié)果 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組長 4197217 bp GC 含量為 47 06 結(jié)合 NR COG KEGG 以 及 GO 數(shù)據(jù)庫對全基因組進(jìn)行基因功能注釋 結(jié)果顯示全基因組共預(yù)測到 4432 個(gè)開放閱讀框 占整個(gè)基 因組長度的 89 77 對編碼基因 重復(fù)序列 非編碼 RNA 等進(jìn)行預(yù)測 獲取測序 NKG 1 基因組的組成 情況 基因組共編碼 87 個(gè) tRNA 總長度 6706 bp 9 個(gè) 5s rRNA 總長度 1035 bp 9 個(gè) 16s rRNA 總 長度 13842 bp 9 個(gè) 23s rRNA 總長度 26352 bp 和 10 個(gè) sRNA 總長度 1147 bp NKG 1 全基因組 序列已提交至 GenBank No CP024203 圖 6 圖 6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組圖譜 Fig 6 The Whole genome map of B methylotrophicus NKG 1 2 6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 基因注釋結(jié)果 使用 BLAST 軟件 把菌株 NKG 1 的蛋白編碼基因 與 COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對 將菌株的基因和其相 對應(yīng)的功能注釋信息結(jié)合起來 得到注釋結(jié)果如圖 7 所示 共有 3448 個(gè)基因被注釋 其中有 320 個(gè)基因 功能未知 參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因最多 達(dá)到有 306 個(gè) 其次有 303 個(gè)基因與轉(zhuǎn)錄相關(guān) 圖 7 值得注意的是有 101 個(gè)基因功能被注釋為防御機(jī)制 111 個(gè)基因功能被注釋為次級代謝生物合成 運(yùn)輸和 分解代謝的功能 這些基因可能參與菌株 NKG 1 抑菌功能 使用 BLAST 軟件 把菌株 NKG 1 的氨基酸序列 與 KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對 把甲基營養(yǎng)型芽胞桿 菌 NKG 1 的基因和其相對應(yīng)的功能注釋信息結(jié)合起來 得到注釋結(jié)果如圖 8 共有 25 條 KEGG 注釋路徑 涉及 1204 個(gè)基因 其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑是參與基因數(shù)量最多的兩條途徑涉及的基因分 別有 203 和 118 個(gè) 分析結(jié)果還顯示有 22 個(gè)基因被注釋為萜類和大環(huán)內(nèi)酯類代謝途徑 10 個(gè)基因被注釋 為其他次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑 這兩條途徑中的基因可能參與菌株 NKG 1 抑菌功能 686 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 40 卷 圖 7 COG 注釋結(jié)果 Fig 7 Annotation result of COG 圖 8 KEGG 通路注釋結(jié)果 Fig 8 Annotation result of KEGG pathway 2 7 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 次級代謝基因簇預(yù)測結(jié)果 利用 anti SMASH ThioFinder 等數(shù)據(jù)庫對芽胞桿菌 NKG 1 全基因組序列進(jìn)行分析 分析得到全基因 組共包含 12 個(gè)次級代謝基因簇 基因簇種類包括 大環(huán)內(nèi)酯類 非核糖體肽類 細(xì)菌素類 萜烯類等 第 3 期 張絲雨等 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉病的防治效果及全基因組分析 687 具體次級代謝基因簇的堿基位 基因簇類型及預(yù)測化合物見表 4 其中 8 個(gè)基因簇預(yù)測到相應(yīng)的化合物 分別是表面活性素 surfactin butirosinA butirosinB 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 macrolactin H 大環(huán)內(nèi)酯類 抗生素 bacillaene 豐原素 fengycin 地非西丁 difficidin 兒茶酚型嗜鐵素 bacillibactin 溶 桿菌素 bacilysin 其中脂肽類抗生素表面活性素和豐原素在芽胞桿菌與抑菌防病相關(guān)次級代謝產(chǎn)物中 最為常見 據(jù)報(bào)道豐原素具有強(qiáng)烈的抑真菌活性 其對褐斑病 灰霉病和炭疽病等真菌病害具有很好的防 治作用 26 表 4 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 次級代謝產(chǎn)物基因簇預(yù)測結(jié)果 Table 4 Prediction of B methylotrophicus NKG 1 secondary metabolite gene clusters 序號 ID 在基因組中位置 Position in genome 基因簇類型 Gene cluster type 預(yù)測化合物 Putative compound 預(yù)測化合物類型 Type of putative compound 1 291188 320921 Thiopeptide 硫肽類 NPR 脂肽類 2 331742 396605 Nrps 非核糖體肽 surfactin 表面活性素 糖類 3 963112 1004356 PKS like 類聚酮和酶 butirosinA butirosinB 4 1089979 1107213 Terpene 萜烯類 5 1487288 1574183 transAT PKS transAT 型聚酮和酶 macrolactin H 大環(huán)內(nèi)酯類 6 1797163 1906776 transAT 型聚酮和酶 T3 型聚酮和酶 NRPS 非核糖體肽 bacillaene 大環(huán)內(nèi)酯類 非核糖體肽 7 1972923 2107496 NRPS 非核糖體肽 transAT 型聚酮和酶 fengycin 豐原素 非核糖體肽 8 2177203 2199086 Terpene 萜烯類 9 2282662 2323762 T3PKS T3 型聚酮和酶 10 2439346 2545526 transAT 型聚酮和酶類 transAT 型聚酮和酶 difficidin 地非西丁 大環(huán)內(nèi)酯類 非核糖體肽 11 3263855 3315645 NRPS 非核糖體肽 bacteriocin 細(xì)菌素 bacillibactin 兒茶酚型嗜鐵素 非核糖體肽 12 3849337 3890755 Other 其他 bacilysin 溶桿菌素 其它 3 討論 自 2015 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部開展化肥農(nóng)藥使用量零增長行動(dòng) 提出持續(xù)推進(jìn)農(nóng)藥減量增效 繼續(xù)保持農(nóng)藥 使用量負(fù)增長 倡導(dǎo)建立資源節(jié)約型和環(huán)境友好型的生態(tài)文明和綠色生產(chǎn) 27 芽胞桿菌作為生物農(nóng)藥目前 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已有廣泛使用 大量的實(shí)踐應(yīng)用證明其不僅可以直接作用于作物防病促生 還可以通過對土 壤進(jìn)行修復(fù) 改善土壤微生物環(huán)境 增加土壤肥力 從而減少作物病蟲害的發(fā)生 提高作物產(chǎn)量 28 本研 究所選用的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 能夠有效抑制番茄灰霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢進(jìn)而防治番茄灰霉病 對番茄苗上的灰霉病防治效果達(dá)到 73 14 接近化學(xué)農(nóng)藥的氟菌 肟菌酯 1000 倍液 13 對番茄灰霉病的防 治效果 通過抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示 NKG 1 發(fā)酵液顯著抑制番茄灰霉菌菌絲生長并且影響菌絲形態(tài)和孢子的 產(chǎn)生 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 通過抑制菌絲生長和產(chǎn)孢對番茄灰霉病具有很好的防治效果 具有良 好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 全基因組經(jīng)測序分析顯示該菌含有 12 個(gè)次級代謝產(chǎn)物基因簇 基因簇種 類包括 大環(huán)內(nèi)酯類 非核糖體肽類 細(xì)菌素類 萜烯類等 表面活性素 伊枯草素和豐原素是最為常見的 脂肽類抗生素 目前對這三類抗生素的研究主要集中在枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌而在甲基營養(yǎng)型芽胞 桿菌中相關(guān)報(bào)道較少 29 表面活性素的抗菌機(jī)制與其強(qiáng)大的表面活性相關(guān) 它可以插入脂質(zhì)雙層膜中 溶解 液體磷脂相 使膜溶解從而改變膜的通透性 具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌和病毒活性 對但真菌抑制作用較弱 30 枯 草芽胞桿菌 RB14 和 6051 產(chǎn)生的表面活性素分別能夠控制立枯絲核菌和熒光假單胞桿菌 31 32 豐原素具有 強(qiáng)烈的抗真菌活性和較弱的抗細(xì)菌和病毒活性 目前研究發(fā)現(xiàn)豐原素對褐斑病 灰霉病和炭疽病等真菌病 害具有顯著的抑菌活性 但是表面活性素對真菌病害沒有顯著的抑菌活性 26 33 本研究下一步計(jì)劃從豐原 688 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 40 卷 素的角度深入開展甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 對番茄灰霉菌的防病機(jī)理 為以后在農(nóng)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 NKG 1 防治番茄灰霉病提供理論基礎(chǔ) 參 考 文 獻(xiàn) 1 李寶聚 陳立芹 孟偉軍 等 濕度調(diào)控對番茄灰霉病菌侵染的影響 J 植物病理學(xué)報(bào) 2003 33 2 167 169 2 楊利敏 仝贊華 郭立華 等 番茄灰霉生防菌 CQ 的分子鑒定及其生防效果研究 J 中國生物防治學(xué)報(bào) 2015 31 6 956 960 3 姚士桐 陸志杰 金周浩 等 春季大棚番茄灰霉病發(fā)生規(guī)律及影響因子分析 J 中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2011 27 10 194 198 4 卜元卿 孔源 智勇 等 化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染及其防控對策建議 J 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào) 2014 16 2 19 25 5 王秋穎 粉紅粘帚霉引發(fā)的番茄抗灰霉病的抗病信號傳導(dǎo)通路分析 D 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 6 周蒙 中國生物農(nóng)藥發(fā)展的現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)與對策分析 J 中國生物防治學(xué)報(bào) 2021 37 1 184 192 7 Compant S Duffy B Nowak J et al Use of plant growth promoting bacteria for biocontr