北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 nullnull null null null nullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnull nullnullnullnull null null null nullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnull 收 稿日期 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基金項目 北京農(nóng)學(xué)院科技創(chuàng)新 火花行動 支持計劃 第一作者 甘珂珂 碩士研究生 主要從事果實發(fā)育分子生物學(xué)研究 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull 劉憲奪 助理農(nóng)藝師 主要從事無公害農(nóng)產(chǎn)品種植 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull 通信作者 黃蕓 博士 副教授 主要從事果實發(fā)育研究 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnull 紅 顏 草莓短縮莖再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立 甘 珂珂 null 劉 憲奪 null 賈 燕 null 沈 元月 null 黃 蕓 nullnull null 北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 null農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室 北京 nullnullnull null 北京佳銘偉業(yè)科技發(fā)展有限公司 北京 nullnullnull 摘 要 目 的 為了獲得 紅顏 草莓再生及遺傳轉(zhuǎn)化植株 方 法 以八倍體 紅顏 草莓 Fragaria null ananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 組培苗短縮莖為試驗材料 將草莓長日照開花抑制基因 FaTFL1 和 FaSOC1 的靶點 構(gòu)建至 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基因編輯載體 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 中 通過建立 紅顏 草莓短縮莖再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得 FaTFL1 和 FaSOC1 基因編輯植株 結(jié) 果 紅 顏 草莓短縮莖不經(jīng)過愈傷誘導(dǎo) 可直接誘導(dǎo)形成不定芽 整個 再生周期 null 個月左右 通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件 建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的短縮莖遺傳轉(zhuǎn)化體系 通過擴增 nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull 載體中的 Cas9 基因?qū)z傳轉(zhuǎn)化獲得的草莓植株進行鑒定 陽性率 nullnullnull nullnullnull 結(jié) 論 成功建立了一種以八倍 體 紅顏 草莓組培苗短縮莖為外植體的高效再生體系以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系 關(guān)鍵詞 紅顏 草莓 短縮莖 再生 遺傳轉(zhuǎn)化 中圖分類號 nullnullnullnullnull nullnull 文章編號 nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 文獻標(biāo)志碼 null Establishment of regeneration and genetic transformation system of Benihoppe strawberry shortened stem nullnullnull nullnullnull null nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnull nullnull null null null nullnullnullnull null nullnullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull Abstract nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Fragarianullananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull FaTFL1 nullnullnull FaSOC1 nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullFaTFL1 nullnullnull FaSOC1 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull Agrobacterium tumefaciens nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Cas9 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Keywords nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 紅 顏 草莓 Fragarianullananassa nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull 屬于薔薇科草莓屬 具有生長適應(yīng)能力強 休眠時間淺 自然坐果能力強 果形大 品質(zhì)好等特 點 栽培草莓品種大多數(shù)為八倍體 具有高度的雜 合性和復(fù)雜性 null 森 林草莓是二倍體 其基因組較 小且已完成測序 容易轉(zhuǎn)化 null 前人大多以二倍體 nullnull 北 京 農(nóng) 學(xué) 院 學(xué) 報 第 nullnull 卷 森林草莓為遺傳轉(zhuǎn)化研究對象 但是森林草莓與八 倍體栽培草莓 在性狀特點和經(jīng)濟價值上有所區(qū) 別 紅顏 草莓是中國主要的栽培品種 占栽培面 積的 nullnullnull以上 null 因此 使用 紅顏 草莓為再生及 遺傳轉(zhuǎn)化材料更具產(chǎn)業(yè)意義 草莓再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法中 葉盤是最廣泛 使用的外植體 null 但葉盤再生周期長 工作量大 效 率低 草莓短縮莖包括新莖 根狀莖 新莖指的是 當(dāng)年萌發(fā)或者 null 年生的短縮莖 節(jié)間排列緊密而短 縮 雖然加粗的生長比較旺盛 但是伸長生長卻非 常緩慢 草莓的新莖通常長有密集的輪生葉片 并 在葉腋處簇生腋芽 第二年這些新莖將會變成根 狀莖 并且未發(fā)育的腋芽也會隨之發(fā)育成為根狀莖 上的隱芽 當(dāng)草莓植株的地上部分遭受到破壞時 這些隱芽可以迅速發(fā)育成為新莖 null 短縮莖是草 莓長葉 生根 形成花序的重要部位 分化能力強 劉振使用草莓試管苗基部作為外植體 屬于草莓短 縮莖部位 建立草莓再生體系 分化培養(yǎng)基為 nullnull nullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull null 就此以 紅顏 草莓短縮莖為試驗材料 建立了一種高效的以八倍 體 紅顏 草莓組培苗短縮莖為試驗材料的再生體 系以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系 為運用基因工 程技術(shù)對草莓品質(zhì) 抗逆 抗病改良奠定基礎(chǔ) null 試驗材料與方法 1 1 植物材料 選用八倍體 紅顏 草莓 Fragaria nullananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 再生組培苗為試驗材料 培養(yǎng) 條件為 培養(yǎng)箱溫度 nullnullnullnullnull null 光周期為 nullnull null 光 nullnull null 暗 相對濕度 nullnullnullnullnullnullnull 1 2 菌株與載體 菌株 大腸桿菌 Escherichia coli E coli 菌株 nullnullnullnull 根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens 菌株 nullnullnullnull 由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所許操 老師實驗室制作并保存 載體 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 是由中國科學(xué)院遺傳與發(fā) 育生物學(xué)研究所許操老師課題組惠贈 載體由農(nóng)業(yè) 應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室保存 1 3 短縮莖再生方法 nullnullnullnullnull 選取短縮莖 取八倍體 紅顏 草莓無菌組 培苗 培養(yǎng) nullnullnullnullnull null 長勢一致 用剪刀剪掉葉片和 根系 用鑷子從短縮莖基部去掉多余的莖段 留取 null 個左右去掉葉片的莖段和短縮莖 nullnullnullnullnull 誘導(dǎo)不定芽 草莓植株放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 nullnullnullnull null培養(yǎng)室中培養(yǎng) null null 左右 長出不定芽 nullnullnullnullnull 生根培養(yǎng) 將不定芽轉(zhuǎn)移到芽生長及生根 培養(yǎng)基上 null 個月左右開始長根 null 個月左右可以長 成正常草莓植株 1 4 載體構(gòu)建 利用 紅顏 草莓 FaTFL1 和 FaSOC1 的基因信 息設(shè)計基因編輯模塊 高效多靶點基因編輯載體 系統(tǒng)是由組成型啟動子 nullnullnull 驅(qū)動 Cas9 表達(dá) 由夜香 樹黃曲葉病毒 CmYLCV Cestrum Yellow Leaf Curing 啟動子驅(qū)動多個 nullnullnullnull 表達(dá) 核糖核酸酶 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null 水解 nullnullnull 磷酸二酯鍵產(chǎn)生 多個 nullnullnullnull nullnullnullnullnull 基因編輯雙元轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建 通過基因編 輯系統(tǒng)網(wǎng)站 nullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 進行基因編 輯靶點設(shè)計 利用多靶點載體系統(tǒng)網(wǎng)站 nullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 設(shè)計引物表 null nullnullnullnullnull 目的片段擴增 采用 nullnull 高保真 nullnullnull 聚合 酶反應(yīng)體系擴增目的片段 表 null 用 于 擴 增 CmYLCV 啟動子的模板需要經(jīng)過 Bannull 酶切 擴增其 余片段的模板為 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 載體 nullnullnullnullnull nullnullnull 產(chǎn)物純化 擴增程序完畢 瓊脂糖凝膠 電泳檢測目的片段大小及質(zhì)量 nullnullnull 產(chǎn)物進行清潔 純化 nullnullnullnullnull nullnullnull 產(chǎn)物載體連接 nullnullnull 產(chǎn)物使用 nullnull 連接 酶邊切邊連反應(yīng)表 null 反應(yīng)程序 nullnull null nullnull null nullnull nullnullnullnull nullnull null nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 取 null nullnull 連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)入 nullnullnullnull 感受態(tài)中 nullnullnullnullnull nullnullnull 鑒定陽性克隆 使用引物 nullnullnullnullnull 和 nullnullnullnull 引物進行 nullnullnull 鑒定 陽性克隆進行測序 1 5 紅顏 草莓短縮莖遺傳轉(zhuǎn)化方法 nullnullnullnullnull 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建好的 FaTFL1nullFaSOC1null nullnullnullnull 載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 nullnullnullnull 農(nóng)桿菌 農(nóng)桿菌活 化后 將平板菌體用 nullnull 液體懸浮液 含 nullnullnull nullnull nullnull 重懸 使 OD nullnullnull 值為 nullnullnull 左右 以備侵染 nullnullnullnullnull 材料準(zhǔn)備 取八倍體 紅顏 草莓無菌組培 苗 培養(yǎng) nullnull null 左右 長勢一致 用剪刀剪掉葉片和 根系 nullnullnullnullnull 農(nóng)桿菌侵染 將剪好的短縮莖作為外植體 浸入農(nóng)桿菌重懸液中 振蕩侵染 nullnull nullnullnull 結(jié)束后用濾 紙 經(jīng)過高溫高壓滅菌的 吸去多余的重懸液 nullnullnullnull 年第 null 期 甘珂珂 等 紅顏 草莓短縮莖再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立 nullnull 表 1 引物序列和 PC 反應(yīng)體系 Tab 1 Primer sequences and reaction mixture of PC 名稱 序列 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 表 2 PC 反應(yīng)體系 Tab 2 eaction mixture of PC 目的片段擴增 nullnullnull 產(chǎn)物載體連接 試劑 體積 nullnullnull 試劑 體積 nullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull 載體 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 模板 nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 純化后的 nullnullnull 產(chǎn)物 nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 上游引物 null nullnull nullnull nullnullnull Sapnull 酶 nullnullnull 下游引物 null nullnull nullnull nullnullnull Bsanull 酶 nullnullnull n