基金項(xiàng)目 本研究由河南省科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) 210602020 資助 引用格式 SongX Y ShiX B WangL M ChenT andChengS X 2024 TranscriptomicanalysisofinteractionbetweenArabidopsis thalianaandNSsprotein oftomato spottedwilttospovirus Fenzi Zhiwu Yuzhong Molecular Plant Breeding 22 17 5622 5629 宋 曉宇 史曉斌 王利敏 陳彤 程森祥 2024 擬南芥和番茄斑萎病毒NSs蛋白互作的轉(zhuǎn)錄組分析 分子植物育種 22 17 5622 5629 研究報(bào)告 ResearchReport 擬南芥和番茄斑萎病毒NSs蛋白互作的轉(zhuǎn)錄組分析 宋曉宇 1 史曉斌 2 王利敏 1 陳彤 1 程森祥 1 1河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心 鄭州 450000 2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 長沙 410000 通信作者 chsxchem 摘 要 為了研究番茄斑萎病毒NSs蛋白在番茄斑萎病毒與植物互作中發(fā)揮的作用 本研究以轉(zhuǎn)NSs基因 擬南芥和生態(tài)型擬南芥為研究對象 使用Illumina RNA seq測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序 利用生物信息學(xué)方法 分析NSs對植物轉(zhuǎn)錄水平影響 結(jié)果顯示 轉(zhuǎn)基因和生態(tài)型擬南芥共有1258個差異表達(dá)基因 其中966個 差異表達(dá)基因富集到Gene Ontology GO 主要涉及細(xì)胞組分 代謝過程和酶活性等功能 517個差異表達(dá)基 因富集到KEGG通路中 NSs主要降低了苯丙烷生物合成 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 植物病原體相互作用等通路 基因的表達(dá) 這些通路都與植物防御病原微生物侵染相關(guān) 101個差異表達(dá)基因被鑒定為轉(zhuǎn)錄因子 分屬于 39個轉(zhuǎn)錄因子家族 包括調(diào)控苯丙烷生物合成的MYB家族和調(diào)控生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)AUX IAA轉(zhuǎn)錄因子家 族 研究發(fā)現(xiàn) NSs蛋白與擬南芥的互作是一個復(fù)雜的過程 NSs影響了擬南芥的次生代謝 激素調(diào)節(jié) 防御 反應(yīng)等多項(xiàng)生物功能 這為后續(xù)深入研究NSs在番茄斑萎病毒與宿主植物互作中發(fā)揮的作用以及番茄斑萎 病毒的防治提供參考依據(jù) 關(guān)鍵詞 番茄斑萎病毒 NSs 互作 轉(zhuǎn)錄組測序 Transcriptomic Analysis of Interaction between Arabidopsis thaliana and NSsProteinofTomatoSpottedWiltTospovirus SongXiaoyu 1 Shi Xiaobin 2 WangLimin 1 ChenTong 1 ChengSenxiang 1 1 High 2 Institute of Plant Protection Hunan Academy of AgriculturalSciences Changsha 410000 Correspondingauthor chsxchem DOI 10 13271 j mpb 022 005622 Abstract In order to study the role of NSs protein in the interaction mechanism between tomato spotted wilt to spovirusand plants this studytook transgenicArabidopsis thalianaexpressingNSs gene and wild typeArabidopsis thaliana as experimental materials and used the Illumina RNA seq sequencing platform for transcriptome sequ encing and analyzed the effects of NSs on gene expression and function by bioinformatics methods The results showed thatthere were 1258differentiallyexpressed genes DEGs between transgenic and wild typeArabidopsis Among them 966 DEGs were enriched in Gene Ontology GO Their functions were mainly referred to cell com ponents metabolic processes and enzyme activities 517 DEGs were enriched in KEGG pathway it was showed that NSs reduced the expression of genes in the pathways such as phenylpropanoid biosynthesis plant hormone signal transduction and plant pathogen interaction These pathways are all related to the defense of plants against pathogenic microorganisms 101 DEGs were identified as transcription factors belongingto 39 transcription factor families including the MYB family that regulates phenylpropanoid biosynthesis and the AUX IAA transcription factor family that regulates auxin signal transduction Through the study it is found that the interaction between 分子植物育種 2024年 第22卷 第17期 第5622 5629頁 MolecularPlantBreeding 2024 Vol 22 No 17 5622 5629 NSs protein and Arabidopsis is a complicated process NSs influences the secondary metabolism hormone regula tion defense response andotherbiological functionsofArabidopsis Thislaysthefoundation for the in depth study of the role of NSs in the interaction between tomato spotted wilt tospovirus and host plants and the control of tomato spottedwilt tospovirus Keywords Tomatospotted wilt tospovirus NSs Interaction Transcriptome 番茄斑萎病毒 tomato spotted wilt tospovirus TSWV 屬于番茄斑萎病毒科 Tospoviridae 正番茄斑 萎病毒屬 Orthotospovirus 李云洲等 2018 野外條 件下 TSWV 只能通過薊馬 主要是西花薊馬 Frankliniella occidentalis 以持久增殖性方式進(jìn)行傳 播 TSWV可以侵染超過1 100種植物 包括番茄 Lycopersicon esculentum 辣椒 Capsicum annuum 煙草 Nicotianatabacum 大豆 Glycine max 等 Roten berget al 2015 被TSWV感染后 植物葉片褪綠皺 縮 極易脫落 果實(shí)出現(xiàn)黃色暗斑 植株發(fā)育遲緩 普遍矮化 嚴(yán)重影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量 Zhao and Rosa 2020 隨著西花薊馬在全球的蔓延 TSWV造 成的危害也日益嚴(yán)重 因此TSWV被評為世界上最 具危害的植物病毒之一 Turina et al 2016 TSWV 自1986年傳入中國 目前已在中國西南 華南 華 北 西北等地區(qū)大面積發(fā)生 對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影 響 李云洲等 2018 NSs Non structure small 是TSWV編碼的非結(jié) 構(gòu)蛋白 在TSWV的感染 復(fù)制和傳播過程中發(fā)揮重 要作用 Takeda et al 2002 來自幾種番茄斑萎病毒 屬病毒的NSs蛋白顯示通過結(jié)合siRNA和dsRNA 來抑制RNA沉默 并且NSs的N 末端和C 末端 結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗NA沉默抑制活性是重要的 Bucher et al 2003 西花薊馬幼蟲可以獲取編碼截短N(yùn)Ss蛋 白的TSWV 但成蟲中病毒的積累量很低 無法傳播 病毒 說明NSs在西花薊馬持續(xù)感染和傳播TSWV 的過程中必不可少 Margaria et al 2014 NSs通過 直接與植物茉莉酸信號傳導(dǎo)的調(diào)控因子MYC2相互 作用 降低植物單萜類揮發(fā)物的生物合成 從而減弱 植物對西花薊馬的防御 間接促進(jìn)TSWV的傳播 Wu et al 2019 NSs同時被鑒定為基于Tsw辣椒 抗性的無毒效應(yīng)蛋白 可在抗性植物中引發(fā)過敏反 應(yīng) de Rondeet al 2013 但目前尚鮮見NSs對植物 轉(zhuǎn)錄水平影響的報(bào)道 高通量測序技術(shù)因其靈敏度高 覆蓋度廣 價(jià)格 便宜等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于植物研究 特別是植物 病 毒的互作研究 賈昌路等 2015 通過RNA Seq技術(shù) 研究分析TSWV侵染苗期辣椒后基因表達(dá)的變化 發(fā)現(xiàn)苯丙烷生物合成通路中基因顯著上調(diào) 說明被 感染的辣椒啟動了防御反應(yīng) 番茄褪綠斑病毒 tomato zonate spot orthotospovirus TZSV 與TSWV 同屬正番茄斑萎病毒屬病毒 通過高通量測序分析 TZSV侵染煙草葉片后的轉(zhuǎn)錄組變化 發(fā)現(xiàn)TZSV影 響了煙草葉綠體發(fā)育 植物病原體相互作用和次生 代謝等通路 Huanget al 2017 通過分析黃瓜花葉 病毒 cucumber mosaic virus CMV 抗感辣椒品種的 轉(zhuǎn)錄組差異 發(fā)現(xiàn)抗病辣椒材料JJ101中植物病原體 相互作用 植物激素信號傳導(dǎo)等通路基因表達(dá)上調(diào) 說明辣椒對CMV的防御是多通路共同作用的復(fù)雜 過程 雷陽等 2021 本研究以轉(zhuǎn)NSs基因擬南芥和生態(tài)型擬南芥為 研究對象 通過高通量測序技術(shù) 篩選出差異表達(dá)基 因 進(jìn)行生物信息學(xué)分析 并隨機(jī)選取差異表達(dá)基因 進(jìn)行qPCR以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性 為深入研 究NSs在TSWV 植物相互作用中發(fā)揮的作用以及 TSWV的防治提供參考依據(jù) 1結(jié)果與分析 1 1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 將轉(zhuǎn)基因和生態(tài)型擬南芥樣品進(jìn)行高通量測 序 分別平均產(chǎn)生56 821 971和49 431 901條原始 序列 Rawreads 通過對不合格的序列進(jìn)行過濾 分 別平均得到55 536 561和48 357 159條有效序列 Cleanreads Q20均大于98 Q30均大于94 GC 含量也處于正常水平 表1 所有數(shù)據(jù)均表明測序數(shù) 據(jù)質(zhì)量較高 可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析 1 2差異表達(dá)基因分析 通過差異表達(dá)基因火山圖 圖1 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因 和生態(tài)型擬南芥共有1 258個差異表達(dá)基因 其中 1 054個差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá) 83 78 204個差 異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá) 16 22 下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量明 顯多于上調(diào)表達(dá)基因 擬南芥和番茄斑萎病毒NSs蛋白互作的轉(zhuǎn)錄組分析 Transcriptomic AnalysisofInteraction betweenArabidopsis thalianaandNSsProtein ofTomatoSpottedWiltTospovirus 5623 分子植物育種 MolecularPlantBreeding 表1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量信息 Table 1 Information ofsequencingdata quality 樣品名稱 Sample name CK1 CK2 CK3 NSs1 NSs2 NSs3 原始序列 Rawreads 57816 340 52642 352 60007 222 45453 056 53856 772 48985 876 有效序列 Cleanreads 56654 990 51464 426 58490 268 44581 936 52887 520 47602 020 有效堿基數(shù)目 Gb Clean bases Gb 8 50 7 72 8 77 6 69 7 93 7 14 測序錯誤率 Errorrate 0 02 0 02 0 02 0 02 0 02 0 02 Q20占比 Q20 98 04 98 08 98 10 98 18 98 11 98 19 Q30占比 Q30 94 48 94 58 94 66 94 76 94 61 94 85 GC含量 GCcontent 46 24 46 59 45 86 46 22 46 03 46 52 圖1轉(zhuǎn)基因和生態(tài)型擬南芥的差異表達(dá)基因火山圖 Figure 1 Volcanoplot for differentially expressed genes between NSsandWT 1 3差異表達(dá)基因的GO富集分析 通過Gene Ontology GO 數(shù)據(jù)庫 共966個差異 表達(dá)基因獲得2 060個GO功能注釋 分屬生物過 程 分子功能和細(xì)胞組分三部分 其中 生物過程共 有1 194個功能注釋 57 96 包括碳水化合物代謝 過程 Carbohydrate metabolic process 細(xì)胞多糖代謝 過程 Cellular polysaccharide metabolic process 等GO 項(xiàng) 分子功能共有601個功能注釋 29 17 包括外 部密封結(jié)構(gòu) External encapsulating structure 細(xì)胞壁 Cell wall 等GO項(xiàng) 細(xì)胞組分共有265個功能注釋 12 86 包括水解酶活性 Hydrolase activity 作 用于糖基鍵的水解酶活性 Hydrolaseactivity actingon glycosyl bonds 等GO項(xiàng) 本研究僅展示富集最顯著 的30個GO項(xiàng) 圖2 1 4差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG 數(shù)據(jù)庫 517個差異表達(dá)基因共映射到89個 KEGG信號通路 差異表達(dá)基因參與較多的信號通路 包括苯丙烷生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo) Plant hormone signal transduction 和植物病原體相互作用 Plant pathogen interaction 其中苯丙烷生物合成信號通路中 PLA1 C4H OMT1 FAH1等12個基因下調(diào) AT2G37130基因上調(diào) 植物 激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路中MAT3 MTO3 ACS11 ACS8 等17個基因下調(diào) DET2 SAUR32和AT1G77920基 因上調(diào) 植物病原體相互作用信號通路中 CNGC9 TCH3 CAM8 MEK1等14個基因全部下調(diào) 1 5差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子分析 使用iTAK軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子 分析 共鑒定出101個轉(zhuǎn)錄因子 屬于39個轉(zhuǎn)錄因 子家族 其中 9個差異表達(dá)基因?qū)儆谡{(diào)控苯丙烷生 物合成的MYB家族 5個屬于調(diào)控生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 的AUX IAA轉(zhuǎn)錄因子家族 圖3 1 6差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證 隨機(jī)選取8個差異表達(dá)基因 進(jìn)行qPCR以驗(yàn) 證RNA seq結(jié)果可靠性 所有qPCR的趨勢均與 RNA seq的趨勢相同 說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有較 高的準(zhǔn)確性和可靠性 圖4 2討論 苯丙烷代謝是植物最重要的次生代謝途徑之 一 產(chǎn)生的類黃酮 木質(zhì)素等化合物 是植物應(yīng)答生 物脅迫的重要途徑 其中苯丙氨酸解氨酶 L pheny lalanineammonialyase PAL 肉桂酸 4 羥化酶 cin namate 4 hydroxylase C4H 和4 香豆酰輔酶A連接 酶 4 coumarate CoA ligase 4CL 是苯丙烷合成信號 通路中的限速酶 在大豆中 通過基因編輯技術(shù)增加 異黃酮的含量 能夠增強(qiáng)葉片對大豆花葉病毒 soy abean mosaic virus SMV 的抗性 Zhang et al 2020 佛手瓜中較高的苯丙氨酸解氨酶活性和木質(zhì)素 對 香豆酸含量 使其對瓜蠅侵染產(chǎn)生抗性 Shivashankar etal 2015 苯丙烷合成信號通路中MYB轉(zhuǎn)錄因子 提高菊花中4CL CCR1等基因的轉(zhuǎn)錄水平 能夠增 5624 擬南芥和番茄斑萎病毒NSs蛋白互作的轉(zhuǎn)錄組分析 Transcriptomic AnalysisofInteraction betweenArabidopsis thalianaandNSsProtein ofTomatoSpottedWiltTospovirus 加木質(zhì)素的生物合成 進(jìn)而降低了蚜蟲在菊花上的 繁殖率 An et al 2019 當(dāng)受到病原微生物侵染時 植物往往會激活苯丙烷生物合成途徑進(jìn)行防御 抗 病品種辣椒中苯丙氨酸解氨酶 PAL 和肉桂酰輔酶 圖4差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證 Figure 4ValidationofdifferentialexpressiongenesbyqPCR 圖2轉(zhuǎn)基因和生態(tài)型擬南芥的差異表達(dá)基因的GO功能富集分析 注 1 多糖代謝過程 2 細(xì)胞葡聚糖代謝過程 3 葡聚糖代謝過程 4 細(xì)胞多糖代謝過程 5 細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生 6 細(xì)胞碳 水化合物代謝過程 7 GTP酶活性的調(diào)節(jié) 8 碳水化合物代謝過程 9 氨基聚糖分解代謝過程 10 細(xì)胞壁大分子分解代謝過 程 11 類固醇生物合成過程 12 類固醇代謝過程 13 胞質(zhì)分裂 14 細(xì)胞壁大分子代謝過程 15 水解酶活性的調(diào)節(jié) 16 細(xì)胞 壁 17 外部封裝結(jié)構(gòu) 18 質(zhì)外體 19 作用于糖基鍵的水解酶活性 20 木葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性 21 水解O 糖基化合物的水解酶 活性 22 細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合 23 轉(zhuǎn)移糖基的轉(zhuǎn)移酶活性 24 水解酶活性 25 微管結(jié)合 26 纖維素合酶活性 27 纖維素合酶 UDP形成 活性 28 3 羥基 5 類固醇脫氫酶活性 29 類固醇脫氫酶活性 30 作用于供體的CH OH基團(tuán) NAD或NADP 作為受體的類固醇脫氫酶活性 Figure 2 GOfunctionalclassificationofdifferentialexpression genesbetweenNSsandWT Note 1 Polysaccharide metabolic process 2 Cellular glucan metabolic process 3 Glucan metabolic process 4 Cellular polysaccha ride metabolic process 5 Cell wall organization or biogenesis 6 Cellular carbohydrate metabolic process 7 Regulation of GTPase activity 8 Carbohydrate metabolic process 9 Aminoglycan catabolic process 10 Cell wall macromolecule catabolic process 11 Steroid biosynthetic process 12 Steroid metabolic process 13 Cytokinesis 14 Cell wall macromolecule metabolic process 15 Reg ulation ofhydrolase activity 16 Cell wall 17 External encapsulating structure 18 Apoplast 19 Hydrolase activity acting on glyco syl bonds 20 Xyloglucan xyloglucosyl transferase activity 21 Hydrolase activity hydrolyzing O glycosyl compounds 22 Ytoskele tal protein binding 23 Transferase activity transferring glycosyl groups 24 Hydrolase activity 25 Microtubule binding 26 Cellu losesynthaseactivity 27 Cellulosesynthase UDP forming activity 28 3 beta hydroxy delta5 steroiddehydrogenaseactivity 29 Ste roid dehydrogenase activity 30 Steroid dehydrogenaseactivity actingontheCH OHgroup ofdonors NADorNADPasacceptor 圖3 NSs與WT差異表達(dá)基因所屬轉(zhuǎn)錄因子家族組成 Figure3Transcriptionfactorsfamilycompositionofdifferentially expressedgenesbetweenNSsandWT A還原酶 cinnamoyl CoAreductase1 CCR1 調(diào)控基因 比感病品種中更早被激活 并且表達(dá)量更高 Li et al 2020 在接種山茶刺盤孢 Colletotrichum camelliae 后 茶樹抗病品種中苯丙氨酸解氨酶 PAL 相關(guān)基因 表達(dá)上調(diào) 并且肉桂醇脫氫酶 cinnamyl alcohol dehy drogenase CAD 相關(guān)基因的表達(dá)量要顯著高于感病 5625 分子植物育種 MolecularPlantBreeding 品種 Wanget al 2016 以上都體現(xiàn)了苯丙烷生物合 成途徑與植物抗性的相關(guān)性 本研究發(fā)現(xiàn)苯丙烷合成 信號通路中PAL1 C4H等12個基因均下調(diào)表達(dá) 說 明NSs可以通過抑制丙烷合成降低部分次生代謝產(chǎn) 物的積累 進(jìn)而影響植物對病原微生物的防御 生長素是一種重要的植物激素 其主要功能是 促進(jìn)植物生長 同時其含量的變化也影響植物的抗 病性 王美紅等 2018 黎家和李傳友 2019 丁香假 單胞菌 Pseudomonas syringae 在感染擬南芥過程中 自身會產(chǎn)生生長素抑制擬南芥防御并直接促進(jìn)細(xì)菌 毒力基因的表達(dá) Djami Tchatchou etal 2020 過表 達(dá)的CsGH3 6基因能夠抑制晚錦橙生長素信號基因 表達(dá)和生長素積累 使得柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種 Xanthomonas citri subsp citri Xcc 造成的病斑面積 和病情指數(shù)顯著減少 鄒修平等 2019 生長素 吲 哚乙酸蛋白家族 Aux IAAs 是生長素信號傳導(dǎo)的主 要轉(zhuǎn)錄因子 在生長素濃度較低時 Aux IAA蛋白與 生長素響應(yīng)因子 ARFs 結(jié)合 抑制生長素相關(guān)基因 的轉(zhuǎn)錄活性 當(dāng)生長素水平升高時 Aux IAA蛋白會 被泛素 蛋白酶體系途徑降解 ARF得以與靶DNA 結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄 從而激活下游基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 因此Aux IAA蛋白成為許多病原體激活生長素信號 傳導(dǎo)的靶點(diǎn) 宋順等 2018 丁香假單胞菌的III型效 應(yīng)子AvrRpt2通過促進(jìn)Aux IAA蛋白的降解來激活 生長素途徑 促進(jìn)了細(xì)菌生長和疾病癥狀加重 Cui et al 2013 煙草花葉病毒 tobaccomosaicvirus TMV 的復(fù)制蛋白與AUX IAA蛋白相互作用破壞其核定 位 從而影響生長素介導(dǎo)的基因調(diào)控和促進(jìn)疾病 發(fā)展 Collum et al 2016 通過擬南芥KEGG通路分 析 在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)現(xiàn)NSs降低了 多個編碼Aux IAAs蛋白的基因 IAA6 IAA7 IAA19 SHY2和PAP2 的表達(dá) 推測Aux IAAs相關(guān)基因表 達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)生長素的信號傳導(dǎo) 進(jìn)而降低植物 的抗病性 在與病原微生物的共同進(jìn)化中 植物逐漸形成 一套天然免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的侵染 其中部 分鈣調(diào)蛋白 calmodulin CaM 參與了植物對病原體 的免疫反應(yīng) 尹倩倩等 2016 在被煙草蝕紋病毒 tobacco etch virus TEV 侵染的煙草葉片中 鈣調(diào)蛋 白rgs CaM regulator of gene silencing CaM 會大量 表達(dá)并結(jié)合病毒沉默抑制子促使其降解 起到對煙 草蝕紋病毒二級防御的作用 Nakaharaetal 2012 大 麗輪枝菌 Verticillium dahliae 誘導(dǎo)陸地棉MYB轉(zhuǎn) 錄因子 GhMYB108 表達(dá) 與鈣調(diào)蛋白GhCML11相 互作用并形成正反饋調(diào)節(jié)回路 從而減輕了大麗輪 枝菌的病害 Cheng et al 2016 本研究發(fā)現(xiàn)植物病 原體相互作用信號通路中 鈣調(diào)蛋白基因 TCH3 CAM2 CAM8和CAM9 下調(diào)表達(dá) 除此之外 參與 CDPK途徑 CNGC9 MAPK級聯(lián)途徑 MEK1 效應(yīng) 子觸發(fā)免疫過程 SGT1A HSP81 2 HSP81 3 以及病 程相關(guān)蛋白家族 PR1 的基因 這些防御相關(guān)基因也 均下調(diào)表達(dá) 表明NSs抑制了植物的防御系統(tǒng) 先 前的研究表明 西花薊馬 雙斑葉螨 Tetranychusur ticae 等昆蟲對TSWV感染的植物有更高的寄主偏 好和繁殖能力 Marisetal 2004 Nachappaetal 2013 在TSWV感染的辣椒上 西花薊馬幼蟲從卵中孵化 得更早 隨后在TSWV感染的植物上化蛹速度也更 快 Mariset al 2004 這些現(xiàn)象可能都與NSs對植物 防御系統(tǒng)的抑制有關(guān) 綜上所述 本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法 發(fā)現(xiàn) NSs能夠降低擬南芥苯丙烷生物合成 植物激素信 號轉(zhuǎn)導(dǎo) 植物病原體相互作用等信號通路相關(guān)基因 的表達(dá) 從而抑制植物對病原微生物的防御 TSWV 是對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成危害的植物病毒 NSs 蛋白作為其沉默抑制子在破壞植物免疫過程中也發(fā) 揮重要功能 分析NSs對植物轉(zhuǎn)錄水平影響能夠?qū)?進(jìn)一步研究NSs在TSWV 植物互作中發(fā)揮的作用 以及TSWV的防治提供思路 3材料與方法 3 1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用哥倫比亞生態(tài)型擬南芥和NSs轉(zhuǎn)基因 擬南芥均由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提 供 NSs轉(zhuǎn)基因擬南芥構(gòu)建方法 從云南昆明番茄植 株上分離 鑒定 并使用本氏煙 Nicotiana benthami ana 傳代的TSWV擴(kuò)增得到NSs基因 構(gòu)建pCambi a1301 NSs過表達(dá)載體 使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化哥倫 比亞生態(tài)型擬南芥 獲得陽性植株 經(jīng)PCR驗(yàn)證的 T 3 代轉(zhuǎn)基因純合株系 將生態(tài)型擬南芥和NSs轉(zhuǎn)基 因擬南芥在溫室中生長 條件控制在溫度 22 1 相對濕度 55 10 光照周期L D 14 h 10 h 盛花期 時取生態(tài)型和轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分用液氮速凍并 于 80 保存 每組樣品3個生物學(xué)重復(fù) 3 2轉(zhuǎn)錄組測序 首先提取樣品中的總RNA 提取的RNA質(zhì)量 需滿足高通量測序?qū)悠焚|(zhì)量的要求 檢測合格后 5626 擬南芥和番茄斑萎病毒NSs蛋白互作的轉(zhuǎn)錄組分析 Transcriptomic AnalysisofInteraction betweenArabidopsis thalianaandNSsProtein ofTomatoSpottedWiltTospovirus 表2 qPCR引物序列 Table2 PrimersequenceforqPCR 基因ID GeneID 836390 824355 835701 841717 821879 820793 818280 817599 835504 基因符號 Genesymbol TUBULIN 2 CAM9 HSP81 3 IAA6 IAA7 IAA19 PLA1 C4H OMT1 引物序列 5 3 Primersequence 5 3 F GAGCCTTACAACGCTACTCTGTCTGTC R ACACCAGACATAGTAGCAGAAATCAAG F CAAAGATTCCGATGGGTTCATC R CTGTCGAACACTCTGAATACCT F CTTCATTCACATCATTCCCGAC R AACACCAAACTGTCCAATCATG F GCGAAATATCAGTATGCGGATC R CAGTATCTAACGCTGATGAGGT F CAGGATCTTTCTGATGCATTGG R GCAGATTCATTAGCTTGCTCTC F CGCTGAGAAGGTTAATGATTCG R TCACTTTCACATACCCTAACCC F AGAGTATGAACAAAGGCACTGA R ATAAGTTCCTTCTGAAGTGCGA F GAAGTCTTTAATCGCCGTCTTC R TGAGATCATCTCCGACTTGAAG F GGCTTTAAAATCCGCCTTAGAG R CAGGATTTTTGGTCGGAAGTTT 使用Illumina的NEBNext Ultra TM RNA文庫構(gòu)建試 劑盒構(gòu)建cDNA文庫 然后使用Illumina測序平臺 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序 上述工作委托北京諾禾致源科技 股份有限公司進(jìn)行 3 3差異表達(dá)基因的篩選 將rawreads過濾除去帶有接頭 含有未檢出堿 基 低質(zhì)量的序列數(shù)據(jù) 得到cleanreads 使用HI SAT軟件將clean reads與參考基因組進(jìn)行對比 使 用HTSeq軟件進(jìn)行基因表達(dá)水平分析 使用DESeq 軟件進(jìn)行基因差異表達(dá)分析 p adjusted小于0 05的 基因即被視為差異表達(dá) 3 4功能注釋 差異表達(dá)分析及轉(zhuǎn)錄因子分析 分別使用GOSeq軟件和KOBAS軟件對篩選得 到的表達(dá)差異基因進(jìn)行 GO 數(shù)據(jù)庫富集分析和 KEGG數(shù)據(jù)庫整合代謝途徑 Pathway 中差異表達(dá)基 因的統(tǒng)計(jì)富集 使用iTAK軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 3 5差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性 隨機(jī)選取8個差 異表達(dá)基因 使用qPrimerDB https biodb swu edu cn qprimerdb 進(jìn)行qPCR引物的設(shè)計(jì) 表2 Lu et al 2018 并且選取 TUBULIN 2作為內(nèi)參基因 Lilly et al 2011 Soucek et al 2017 使用兩步法qPCR 試劑盒 諾唯贊 中國 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 定量PCR 檢測試劑盒 諾唯贊 中國 進(jìn)行qPCR 采用2 Ct 法 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 計(jì)算出每個基因的相對表達(dá)水平 Livak and Schmittgen 2001 并將 qPCR 結(jié)果取 log 2 與RNA Seq得到的log 2 FC進(jìn)行比較 每組處理 3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù) Schmittgen and Li vak 2008 作者貢獻(xiàn) 宋曉宇是本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者和實(shí)驗(yàn)研究的執(zhí) 行人 完成數(shù)據(jù)分析 論文初稿的寫作 王利敏 陳彤 參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分析 史曉斌 程森祥是項(xiàng) 目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人 指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 數(shù)據(jù)分析 論文 寫作與修改 全體作者都閱讀并同意最終的文本 致謝 本研究由河南省科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資 金 210602020 資助 參考文獻(xiàn) An C Sheng L P Du X P Wang Y J Zhang Y Song A P Jiang J F Guan Z Y Fang W M Chen F D and Chen S 5627 分子植物育種 MolecularPlantBreeding M 2019 Overexpression of CmMYB15 provides chrysan themum resistance to aphids by regulating the biosynthesis oflignin Hortic Res 6 84 BucherE SijenT deHaanP Goldbach R and PrinsM 2003 Negative strand tospoviruses and tenuiviruses carry a gene for a suppressor of gene silencing at analogous genomic po sitions J Virol 77 2 1329 1336 Cheng H Q Han L B Yang C L Wu X M Zhong N Q Wu J H Wang F X Wang H Y and Xia G X 2016 The cotton MYB108formsapositivefeedbackregulationloopwithCM L11 and participates in the defense response against Verti鄄 cillium dahliae infection J Exp Bot 67 6 1935 1950 Collum T D Padmanabhan M S Hsieh Y C and Culver J N 2016 Tobaccomosaicvirus directedreprogrammingofaux in indole acetic acid protein transcriptional responses en hances virus phloem loading Proc Natl Acad Sci USA 113 19 E2740 E2749 Cui F H Wu S J Sun W X Coaker G Kunkel B He P and 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