2024 50 4 310 317PlantProtection 收稿日期 2 0 2 3 0 6 0 7 修訂日期 2 0 2 3 0 7 3 1 基金項目 上海市西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè) 滬農(nóng)科產(chǎn)字 2 0 2 2 第1號 上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)所揭榜掛帥 生科 J B 2 0 2 3 2 通信作者E m a i l f u m i n g d a i 1 6 3 c o m 西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選 曾 蓉1 徐麗慧1 陳灝嵐2 成 瑋3 高 萍1 高士剛1 宋志偉1 戴富明1 1 上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所 上海市設(shè)施園藝重點實驗室 上海 2 0 1 4 0 3 2 上海市浦東新區(qū) 農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 上海 2 0 1 3 2 3 3 上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 上海 2 0 1 7 9 9 摘要 2 0 2 2年在上海市浦東新區(qū)西瓜上發(fā)生一種深褐色 不規(guī)則至近圓形斑的葉部病害 采用組織分離法對病害 樣本進行分離 分離物S H C C C 0 1經(jīng)柯赫氏法則驗證具有較強致病性 根據(jù)分離物的菌落特征 分生孢子形態(tài) 生 物學特征以及基于核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r I T S 組蛋白基因 h i s t o n e His 真核翻譯 延伸因子1 t r a n s l a t i o n e l o n g a t i o n f a c t o r 1 TEF1 和肌動蛋白 a c t i n Act 基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析等 將病原 菌鑒定為瓜類尾孢Cercosporacitrullina 1 0種殺菌劑對該病原菌的毒力測定試驗結(jié)果表明 氟啶胺 己唑醇 氟環(huán) 唑 戊唑醇等4種藥劑對病原菌的抑菌活性較高 其E C 5 0分別為0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3 1 8 9 0 2 g m L 這些結(jié) 果為西瓜尾孢葉斑病的防控和殺菌劑登記提供了重要依據(jù) 關(guān)鍵詞 西瓜 瓜類尾孢 多基因序列聯(lián)合分析 毒力測定 中圖分類號 S 4 3 6 5 文獻標識碼 A DOI 1 0 1 6 6 8 8 j z w b h 2 0 2 3 2 7 9 Identificationofthepathogencausingleafspotonwatermelonand fungicidescreeninginvitro ZENGRong1 XULihui1 CHENHaolan2 CHENGWei3 GAOPing1 GAOShigang1 SONGZhiwei1 DAIFuming1 1 Eco EnvironmentProtectionResearchInstitute ShanghaiKeyLaboratoryofProtectedHorticultureTechnology ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences Shanghai 2 0 1 4 0 3 China 2 PudongDistrictAgro technologyExtension Center Shanghai 2 0 1 3 2 3 China 3 ShanghaiAgro technologyExtensionCenter Shanghai 2 0 1 7 9 9 China Abstract AkindofwatermelonleafspotdiseasewasfoundinPudongdistrict Shanghai Theisolateswere obtainedfromdiseasedsamplesbytissueisolationmethod PathogenicityoftheisolateSHCCC0 1wasverifiedby Koch spostulates Thepathogenwasidentifiedbymorphology biologicalcharacteristics andmultilocus phylogeneticanalysisbasedontheinternaltranscribedspacer ITS histone His translationelongationfactor 1 TEF1 andactin Act Theresultsshowedthatthepathogenofthewatermelonleafspotdiseasewas Cercosporacitrullina Amongthetentestedfungicides fluazinam hexaconazole epoxiconazoleandtebuconazole showedstronginhibitiontohyphalgrowthofC citrullinaisolateSHCCC0 1withtheEC5 0valueof0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3and1 8 9 0 2 g mL respectively Theseresultsprovideimportanttheoreticalbasisforcontrolof watermelonCercosporaleafspotdiseaseandregistrationoffungicides Keywords watermelon Cercosporacitrullina multilocusphylogeneticanalysis toxicity 西瓜Citrulluslanatus為一年生蔓生草本植 物 果實甘甜多汁 營養(yǎng)豐富 深受消費者喜愛 西瓜 生長周期短 經(jīng)濟價值高 深受種植戶喜愛 據(jù) F A O統(tǒng)計 2 0 2 1年我國西瓜種植面積為1 4 1萬h m 2 左右 產(chǎn)量約為6 1 0 1萬t w w w f a o o r g 上海市 西瓜常年種植面積約為2 0 0 0 h m 2 不僅是上海市郊 區(qū)農(nóng)業(yè)致富的重要產(chǎn)業(yè) 也是品牌農(nóng)業(yè) 休閑農(nóng)業(yè) 生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要載體 西瓜在生長過程中會受到多 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選 種病害的侵襲 常發(fā)的病害有蔓枯病 白粉病 炭疽 病 葉斑病等 這些病害嚴重影響西瓜的產(chǎn)量和 品質(zhì) 2 0 2 2年7月 本研究組在上海市浦東新區(qū)調(diào)查 時發(fā)現(xiàn) 多個農(nóng)戶的種植大棚中出現(xiàn)一種癥狀相似 的葉部病害 嚴重時整葉枯黃 影響植株光合作用和 正常生長 田間株發(fā)病率5 0 以上 為明確引起該 病害的病原菌 本研究對典型癥狀病樣進行組織分 離 純化 培養(yǎng) 并結(jié)合病原菌形態(tài) 生物學特征 致 病性 多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析對分離物進行鑒定 以明確引起上海市西瓜葉斑病的病原菌種類 并開 展了藥劑室內(nèi)毒力測定 以期為該病害的防控提供 參考 1 材料與方法 1 1 材料 病樣 于上海市浦東新區(qū)公平村西瓜種植戶采 集有典型病害癥狀的西瓜葉片 瓊脂 葡萄糖 二甲基亞砜等生化試劑購自中國 醫(yī)藥集團有限公司 2 TaqM a s t e r M i x L o t P 1 1 2 0 1 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司 2 k p l u s D N A M a r k e r購自北京全式金生物技術(shù)有 限公司 1 0種供試殺菌劑原藥及來源 9 8 氟啶胺原藥 江西禾田科技有限公司 9 5 4 己唑醇原藥 江蘇 七洲綠色化工股份有限公司 9 8 氟環(huán)唑原藥 江 蘇七洲綠色化工股份有限公司 9 7 戊唑醇原藥 江蘇七洲綠色化工股份有限公司 9 7 咪鮮胺原 藥 上海悅聯(lián)化工有限公司 9 8 嘧菌酯原藥 山東 京博農(nóng)化科技股份有限公司 9 8 氟吡菌酰胺原藥 拜耳股份公司 9 5 2 苯醚甲環(huán)唑原藥 上海生農(nóng) 生化制品股份有限公司 9 6 9 異菌脲原藥 江西 禾益化工股份有限公司 9 8 氟唑菌酰胺原藥 巴 斯夫歐洲公司 1 2 試驗方法 1 2 1 癥狀觀察 2 0 2 2年7月 在上海市浦東新區(qū)公平村西瓜種 植戶 觀察西瓜葉斑病危害癥狀及程度等 1 2 2 病原菌的分離與純化 將有典型癥狀的發(fā)病初期葉片洗凈 在自來水 下沖洗2 h 按組織分離法分離病原菌 1 在病健交 界處剪取直徑6 8 m m的圓形病斑 用2 次氯酸 鈉浸泡消毒2 3 m i n 然后用滅菌水清洗3次 在無 菌的培養(yǎng)皿內(nèi)晾干 均勻放置在含有5 0 g m L氯 霉素和5 0 g m L鏈霉素的P D A培養(yǎng)基上 2 6 黑 暗培養(yǎng) 挑取邊緣菌絲到新的P D A培養(yǎng)基上 待分 離物產(chǎn)生孢子后 挑取單個孢子進行分離純化 分離 物5 保存 1 2 3 分離物的形態(tài)學及生物學特性 參考方中達 1 的方法對分離物S H C C C 0 1進 行形態(tài)學鑒定 在2 6 下黑暗培養(yǎng) 觀察其在P D A 培養(yǎng)基上的菌落特征以及菌絲和分生孢子的顯微 形態(tài) 同時觀察光照對分離物色素產(chǎn)生的影響 先 2 6 全黑暗培養(yǎng)7 d 然后全光照培養(yǎng) 光強度 5 0 0 l x 光源高度4 0 c m 3 d 觀察光照對紅色素產(chǎn) 生的影響 參考方中達 1 的方法測試菌落生長適宜溫度 用打孔器在活化的菌落邊緣取直徑6 m m的菌餅 接種在P D A培養(yǎng)基中央 設(shè)置培養(yǎng)溫度范圍1 8 3 4 溫度梯度2 黑暗培養(yǎng)7 d后 用十字交叉法 測量菌落直徑 試驗重復(fù)4次 1 2 4 致病性測定 將分離物S H C C C 0 1接種于直徑9 0 m m的 P D A平板上 2 0 m L培養(yǎng)基 皿 2 6 黑暗培養(yǎng) 1 0 d后 取2個平板的所有培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一 起置于勻漿杯中 加1 0 0 m L無菌水 高速組織搗 碎儀1 0 0 0 0 r m i n勻漿2 m i n 菌懸液終濃度調(diào)至 O D 6 0 0 n m 1 5 用手持噴霧器均勻噴霧接種2 3 葉期 早佳一號 西瓜苗2 0株 噴施等量無菌水的 早佳一號 西瓜苗2 0株為對照 在透光的塑料箱 內(nèi)保濕 在2 6 L D 1 2 h 1 2 h條件下生長 每日觀察記錄植株發(fā)病情況 接種7 d后從發(fā)病植 株的葉片發(fā)病部位重新分離病原菌 進行柯赫氏法 則驗證 1 2 5 病原菌多基因聯(lián)合鑒定 將分離物S H C C C 0 1在P D A培養(yǎng)基上2 6 培 養(yǎng)7 d后 挑取少量菌絲 參考H a r j u的方法提取真 菌基因組D N A 2 對分離物分別選擇核糖體內(nèi)部 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s I T S 引物 I T S 1 5 T C C G T A G G T G A A C C T G C G G 3 I T S 4 113 2 0 2 4 5 T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C 3 3 組蛋白 基因 h i s t o n e g e n e His 引物h i s f 5 G C A G G T C C A C T G G T G G C A A G G 3 h i s r 5 A T G G T G A C A C G C T T G G C G T G G A 3 4 真核生物翻譯延伸 因子1 t r a n s l a t i o n e l o n g a t i o n f a c t o r TEF1 引 物E F 1 7 2 8 F 5 C A T C G A G A A G T T C G A G A A G G 3 E F 1 9 8 6 R 5 T A C T T G A A G G A A C C C T T A C C 3 5 肌動蛋白基因 a c t i n g e n e Act 引物A C T 5 1 2 F 5 A T G T G C A A G G C C G G T T T C G C 3 A C T 7 8 3 R 5 T A C G A G T C C T T C T G G C C C A T 3 6 進 行D N A片段擴增和測序 引物合成及測序委托生 工生物工程 上海 股份有限公司完成 P C R擴增 體系 2 5 L 2 TaqM a s t e r M i x 1 2 5 L 上 下 游引物 1 0 m o l L 各0 5 L 模板D N A 1 L d d H 2 O補充體積至2 5 0 L P C R反應(yīng)程序參考 各引物出處文獻 以暹羅假尾孢Pseudocercosporathailandica C P C 1 0 5 4 7 為外群參考序列 將分離物的序列與 已經(jīng)發(fā)表的I T S His TEF1 Act序列經(jīng)C l u s t a l x 1 8 3 7 做完全比對 并將兩端截齊 相關(guān)序列信息見 表1 使用S e q u e n c e M a t r i x 1 8 0軟件 8 按I T S His TEF Act順序連接成多基因聯(lián)合序列 基于鄰 接法 n e i g h b o r j o i n i n g N J 9 設(shè)置自展值 b o o t s t r a p s 為1 0 0 0 用M E G A 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 1 0 表1 本研究所用菌株及其序列信息 Table1 Strainsandtheirsequenceinformationusedinthisstudy 種 S p e c i e s 分離物 I s o l a t e 寄主 H o s t 來源地 R e g i o n G e n B a n k登錄號 G e n B a n k a c c e s s i o n n o I T SHisTEF1 Act Cercosporacitrullina 瓜類尾孢I V F C L 0 1 Citrulluslanatus 西瓜中國M Z 4 2 0 1 9 9 M Z 4 3 7 9 8 7 M Z 4 3 7 9 8 4 M Z 4 3 7 9 9 0 C citrullina 瓜類尾孢H G 2 1 0 4 1 4 0 2 Lagenariasiceraria 葫蘆中國M Z 4 3 2 7 4 3 M Z 4 3 7 9 9 8 M Z 4 3 7 9 9 6 M Z 4 3 7 9 9 4 C olivascens 馬兜鈴尾孢C B S 2 5 3 6 7 Aristolochiaclematitis 歐洲馬兜鈴羅馬尼亞N R 1 1 1 7 7 3 J X 1 4 2 6 5 3 J X 1 4 3 3 9 1 J X 1 4 3 1 4 5 C kikuchii 菊池尾孢C B S 1 2 8 2 7 Glycinesoja 野大豆日本N R 1 1 9 6 1 6 D Q 8 3 5 1 6 1 D Q 8 3 5 0 8 8 D Q 8 3 5 1 0 7 C beticola 甜菜尾孢C P C 1 1 5 5 7 Betavulgaris 甜菜意大利N R 1 2 1 3 1 5 A Y 8 4 0 3 9 2 A Y 8 4 0 4 9 4 A Y 8 4 0 4 5 8 C apii 芹菜尾孢C B S 1 1 6 4 5 5 Apiumgraveolens 芹菜德國N R 1 1 9 5 2 5 A Y 8 4 0 3 8 4 A Y 8 4 0 4 8 6 A Y 8 4 0 4 5 0 C pseudochenopodii 藜尾孢C C T U 1 1 7 6 Chenopodiumalbum 藜伊朗N R 1 4 7 2 7 8 K J 8 8 6 1 9 6 K J 8 8 6 3 5 7 K J 8 8 6 0 3 3 C corchori 黃麻尾孢M U C C 5 8 5 Corchorusolitorius 長蒴黃麻日本N R 1 2 0 1 7 2 J X 1 4 2 6 0 4 J X 1 4 3 3 4 2 J X 1 4 3 0 9 6 C alchemillicola 羽衣草尾孢C P C 5 2 5 9 Alchemillamollis 柔毛羽衣草新西蘭N R 1 1 1 7 6 9 J X 1 4 2 5 4 1 J X 1 4 3 2 7 9 J X 1 4 3 0 3 3 C fagopyri 蕎麥尾孢C B S 1 3 2 6 2 3 Fagopyrumesculentum 蕎麥韓國N R 1 4 7 2 6 3 J X 1 4 2 6 1 4 J X 1 4 3 3 5 2 J X 1 4 3 1 0 6 C delaireae 常春藤尾孢C B S 1 3 2 5 9 5 Delaireaodorata 內(nèi)藤菊南非N R 1 4 7 2 6 1 J X 1 4 2 6 0 7 J X 1 4 3 3 4 5 J X 1 4 3 0 9 9 C pileicola 冷水花尾孢C B S 1 3 2 6 0 7 Pileapumila 透莖冷水花韓國N R 1 4 7 2 6 4 J X 1 4 2 6 5 5 J X 1 4 3 3 9 3 J X 1 4 3 1 4 7 C sojina 大豆尾孢C B S 1 3 2 6 1 5 G soja 野大豆韓國N R 1 4 7 2 6 5 J X 1 4 2 6 8 1 J X 1 4 3 4 1 9 J X 1 4 3 1 7 3 C apiicola 芹菜尾孢C B S 1 1 6 4 5 7 Apiums p 芹屬植物委內(nèi)瑞拉N R 1 1 9 5 2 6 A Y 8 4 0 4 0 1 A Y 8 4 0 5 0 3 A Y 8 4 0 4 6 7 Pseudocercosporathailandica 暹羅假尾孢C P C 1 0 5 4 7 Acaciamangium 馬占相思泰國A Y 7 5 2 1 5 6 A Y 7 5 2 2 7 9 D Q 8 3 5 1 0 2 A Y 7 5 2 2 1 7 213 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選 1 2 6 室內(nèi)藥劑毒力測定 采用菌絲生長抑制法 具體步驟參考劉欣 等 1 1 曾蓉等 1 2 的方法 測試1 0種殺菌劑原藥對分 離物S H C C C 0 1的室內(nèi)毒力 將供試菌株在P D A 平皿上2 6 黑暗培養(yǎng)7 d后 在菌落邊緣打取直徑 6 m m的菌餅 菌絲面朝下接入含有藥劑的P D A平皿 中央 所有藥劑用二甲基亞砜 D M S O 溶解成相應(yīng) 濃度后加入P D A平皿 設(shè)置不同濃度梯度 氟啶胺 和己唑醇濃度設(shè)置為0 0 5 0 1 0 5 1 0 2 0 g m L 和5 0 g m L 氟環(huán)唑和戊唑醇濃度設(shè)置為0 1 0 5 1 0 2 0 5 0 g m L和1 0 0 g m L 咪鮮胺 嘧菌酯和氟吡菌酰胺濃度設(shè)置為0 5 1 0 5 0 1 0 0 2 0 0 g m L和5 0 0 g m L 苯醚甲環(huán)唑 異 菌脲和氟唑菌酰胺濃度設(shè)置為1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 g m L和3 0 0 0 g m L 以上藥劑均使用 D M S O溶解 以添加1 0 0 L D M S O的P D A平皿為 對照 每個處理重復(fù)4次 2 6 黑暗培養(yǎng)7 d后 用 十字交叉法測量菌落直徑 用如下公式計算菌絲生 長抑制率 菌絲生長抑制率 對照菌落直徑 處理菌落 直徑 對照菌落直徑 6 m m 1 0 0 試驗數(shù)據(jù)使用W P S O f f i c e 2 0 2 3進行處理 線 性回歸采用D P S 7 0 5進行分析 1 3 計算線性方程 斜率 s l o p e 標準誤 S E 卡方值 2 自由度 df 抑制中濃度 E C 5 0 9 5 置信限 2 結(jié)果與分析 2 1 田間癥狀 在夏秋季西瓜設(shè)施大棚內(nèi) 病原物主要侵染西 瓜葉片 表現(xiàn)為發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)直徑1 2 m m 大小深褐色不規(guī)則或近圓形斑點 濕度高時發(fā)病部 位擴大至1 0 m m或更大斑 病斑褐色 中心部位灰 白色 病斑周圍時有黃色 有典型的尾孢病害 蛙眼 狀圓斑 嚴重時整葉枯死 嚴重影響西瓜正常生長 圖1 在調(diào)查中發(fā)現(xiàn) 上海市主栽西瓜品種 早佳 一號 大都易感病 株發(fā)病率高于5 0 圖1 西瓜葉斑病田間癥狀 Fig 1 SymptomsofCercosporaspotonwatermeloninfield 2 2 病原菌形態(tài)及生物學特性 組織分離后5 d組織塊周圍長出灰褐色菌落 菌落邊緣菌絲白色 取菌落邊緣純化后 待分離物產(chǎn) 生孢子后 挑取單個孢子進行分離純化 對5個病 樣進行分離 共獲得2 0個分離物 命名為S H C C C 0 1 S H C C C 2 0 這些分離物的菌落形態(tài)特征 生長速 度基本一致 本研究選取了分離物S H C C C 0 1進行 后續(xù)的試驗 分離物S H C C C 0 1菌絲在P D A培養(yǎng)基上生長 較慢 緊貼培養(yǎng)基生長 在黑暗條件下 正面白色或 灰色 背面灰褐色或暗褐色 圖2 在光照培養(yǎng)條件 下 菌落四周會產(chǎn)生鮮紅色或暗紅色色素 圖3 圖2 分離物SHCCC01在PDA上的菌落形態(tài) 26 黑暗培養(yǎng)7d Fig 2 ColoniesofisolateSHCCC01onPDAplate incubatedat26 indarkforsevendays 313 2 0 2 4 圖3 分離物SHCCC01在PDA上產(chǎn)生的紅色素 26 黑暗培養(yǎng)7d 接著連續(xù)光照3d Fig 3 RedpigmentofisolateSHCCC01onPDAplate incubatedat26 indarkforsevendays followed bycontinuouslighteningforthreedays 西瓜葉斑病菌菌絲生長最適宜溫度是 2 6 在該溫 度下在P D A上培養(yǎng)7 d菌落直徑為2 2 6 m m 培養(yǎng) 1 4 d后菌落直徑為4 0 2 m m 在1 8 和3 4 時 分 離物生長速度緩慢 在P D A上培養(yǎng)7 d菌落直徑分 別為1 2 3 m m和9 0 m m 培養(yǎng)1 4 d菌落直徑分別 為2 2 8 m m和9 9 m m 在自然發(fā)病的葉片發(fā)病部位能觀察到分生孢子 梗和分生孢子的產(chǎn)生 其分生孢子梗多為簇生 基部 棕褐色 頂端淺褐色 直立或彎曲 有多個屈膝狀折 點 有多個隔膜 圖4 a 分生孢子無色 直或彎 短 小的孢子呈倒棍棒狀 基部平截 頂端近尖至鈍 有 3個以上隔膜 部分孢子有多達3 0余個隔膜 孢子 大小為 2 5 5 2 m 3 5 3 2 4 0 3 m 黑暗 條件下在P D A上培養(yǎng)1 4 d 會有少量分生孢子產(chǎn) 生 形態(tài)特征與葉片上相似 圖4 b e 這些特征 與郭蘭英等描述的侵染葫蘆科作物的瓜類尾孢 Cercosporacitrullina較相似 1 4 與葉云峰等在甜 瓜上發(fā)現(xiàn)的C citrullina形態(tài)特征等也相似 1 5 初 步判斷引起西瓜葉斑病的病原為尾孢菌 圖4 西瓜葉斑病菌分離物SHCCC01的形態(tài)特征 Fig 4 MorphologicalcharacteristicsofisolateSHCCC01causingleafspotonwatermelon 2 3 分離菌株對西瓜的致病性 2 0株2 3葉期 早佳一號 西瓜接種S H C C C 0 1 后7 d 被接種葉片出現(xiàn)壞死斑 中間灰白色 后期病 斑變大 整葉枯萎 與田間癥狀相似 而對照植株葉 片上無癥狀 圖5 從接種植株的發(fā)病部位重新進 行組織分離 得到了與S H C C C 0 1分離物形態(tài)特征 一致的分離物 進一步說明了S H C C C 0 1是引起西 瓜葉斑病的病原菌 2 4 分子生物學鑒定 利用I T S His TEF1 和Act4個基因序列的引 413 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選 圖5 西瓜葉斑病病原菌致病性試驗 Fig 5 PathogenicitytestofCercosporaisolateSHCCC01 物對西瓜葉斑病菌分離物 S H C C C 0 1進行P C R擴增 分別得到長度為5 3 6 3 9 1 3 0 8 2 2 5 b p的D N A片段 上傳到N C B I的G e n B a n k數(shù)據(jù)庫 獲得登錄號分別 為 O R 0 5 4 0 6 8 O R 0 8 8 0 5 1 O R 0 8 8 0 5 2 O R 0 8 8 0 5 3 在G e n B a n k數(shù)據(jù)庫中進行各序列B L A S T n 結(jié)果顯 示 菌株S H C C C 0 1的I T S序列與瓜類尾孢C cit rullina 辣椒尾孢C capsici 煙草尾孢C nicoti anae 甜菜尾孢C beticola 馬來尾孢C malayensis 芹菜尾孢C apii等諸多尾孢分離物的相似性都高 達1 0 0 His基因序列與數(shù)據(jù)庫中瓜類尾孢 C citrullina相似性都高于9 8 0 TEF1 基因序 列與瓜類尾孢C citrullina相似性都高于9 9 0 與其他尾孢種的相似性在9 8 0 左右 Act基因序 列與瓜類尾孢C citrullina相似性都高于9 9 0 與其他尾孢種的相似性在9 7 0 9 8 0 左右 分離物S H C C C 0 1的I T S His TEF1 和Act 4個基因序列與尾孢相應(yīng)序列的相似性最高 基于 I T S His TEF1 和Act4個基因聯(lián)合序列 經(jīng)N J 法構(gòu)建了分離物S H C C C 0 1的多基因系統(tǒng)進化樹 圖6 在該進化樹中 分離物S H C C C 0 1 S H C C C 0 3與瓜類尾孢C citrullina的2個分離物聚集 在一個分支 自展值為9 2 2 5 室內(nèi)藥劑毒力測定 應(yīng)用菌絲生長抑制法 測試1 0種藥劑對分離 物S H C C C 0 1的室內(nèi)毒力作用 結(jié)果顯示 表2 抑菌作用最好的是氟啶胺 己唑醇 氟環(huán)唑 戊唑 醇等4種藥劑 E C 5 0分別為0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3 1 8 9 0 2 g m L 其次為嘧菌酯 咪鮮胺 氟吡菌酰胺3種藥劑 其E C 5 0分別為1 1 7 0 1 2 1 2 4 4 8 0 2 1 2 6 2 5 g m L 試驗中 苯醚甲環(huán)唑 異 表2 8種殺菌劑對西瓜葉斑病菌SHCCC01菌絲生長的毒力測定 Table2 ToxicityofeightfungicidestomycelialgrowthofCercosporaisolateSHCCC01 殺菌劑 F u n g i c i d e 斜率 標準誤 S l o p e S E 卡方值 2 自由度 df 抑制中濃度 9 5 置信限 g m L E C 5 0 9 5 c o n f i d e n c e i n t e r v a l 9 8 氟啶胺T C f l u a z i n a m 9 8 T C 5 3 1 1 8 0 0 3 0 7 9 0 1 0 0 4 0 3 7 5 2 0 3 1 3 1 0 4 4 9 7 9 5 4 己唑醇T C h e x a c o n a z o l e 9 5 4 T C 5 1 9 8 7 0 0 3 6 8 8 8 5 2 6 4 0 5 7 5 4 0 4 7 7 1 0 6 9 4 0 9 8 氟環(huán)唑T C e p o x i c o n a z o l e 9 8 T C 4 8 7 2 6 0 0 5 8 0 9 0 2 6 6 4 1 4 7 2 3 1 0 4 6 8 2 0 7 0 8 9 7 戊唑醇T C t e b u c o n a z o l e 9 7 T C 4 8 8 8 8 0 0 2 9 5 9 4 7 7 8 4 1 8 9 0 2 1 3 5 1 7 2 6 4 3 2 9 7 咪鮮胺T C p r o c h l o r a z 9 7 T C 4 1 0 8 2 0 1 3 4 7 8 8 5 7 6 4 1 2 4 4 8 0 6 9 6 6 9 2 2 2 4 1 4 9 8 嘧菌酯T C a z o x y s t r o b i n 9 8 T C 4 1 5 9 1 0 0 9 7 8 8 8 7 8 6 4 1 1 7 0 1 2 7 6 1 6 4 1 7 9 7 6 7 9 8 氟吡菌酰胺T C f l u o p y r a m 9 8 T C 4 0 5 7 8 0 0 7 4 3 8 9 4 4 5 4 2 1 2 6 2 5 1 3 8 5 3 8 3 2 6 3 3 2 9 5 2 苯醚甲環(huán)唑T C d i f e n o c o n a z o l e 9 5 2 T C 2 4 4 9 9 0 3 5 8 6 7 0 1 9 8 4 1 7 8 1 8 7 6 1 1 2 7 0 5 1 2 8 1 7 1 5 8 513 2 0 2 4 圖6 基于ITS His TEF1 和Act多基因序列聯(lián)合構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 6 NJphylogenetictreebasedonITS His TEF1 andActsequences 菌脲和氟唑菌酰胺對分離物 S H C C C 0 1的抑制活性 較差 苯醚甲環(huán)唑E C 5 0為1 7 8 1 8 7 6 g m L 而異菌 脲和氟唑菌酰胺兩種藥劑在試驗中設(shè)置終濃度為 3 0 0 g m L時 仍未能測得有效的E C 5 0 3 結(jié)論與討論 本研究對采自上海市浦東新區(qū)的 早佳一號 西 瓜葉片上致病菌進行了分離 共獲得了2 0株培養(yǎng)形 態(tài)一致的分離物 經(jīng)過柯赫氏法則驗證 選取了分 離物S H C C C 0 1進一步進行了菌落形態(tài) 生物學特 性 致病性測定 并通過分子生物學方法獲得了該 分離物的I T S His TEF1 和Act的部分序列 通 過多基因序列聯(lián)合建立N J系統(tǒng)發(fā)育樹 綜合分析 結(jié)果表明 引起上海浦東新區(qū)西瓜葉斑病的分離物 S H C C C 0 1為瓜類尾孢C citrullina 引起西瓜葉部斑點癥狀的病害較多 有西瓜蔓 枯病 細菌性葉斑病 西瓜炭疽病 尾孢葉斑病 等 1 6 1 9 且這些病害僅通過癥狀難以確認病原 本 研究中在葉片上觀察到的癥狀與陳益果等 1 9 的描 述十分相似 通過分生孢子梗 分生孢子形態(tài) 病原 菌生物學特性和致病性等的鑒定 都和尾孢菌引起 的植物病害特征相吻合 然而 尾孢屬近緣種之間 的看家基因序列相似性高 僅憑單個基因序列信息 很難準確鑒定到種 I n g l i s等 2 0 C o n w a y 2 1 M o n t e n e g r o C a l d e r n等 2 2 也證實 僅通過I T S序列分 析無法區(qū)分大多數(shù)尾孢屬以下的分類 多基因聯(lián)合 建樹的方法是尾孢菌較常用的進化分類方法 G r o e n e w a l d等應(yīng)用I T S TEF1 Act和Cal基因序列 聯(lián)合建樹的方法將6 7株尾孢分離物分為甜菜尾孢 C beticola 芹菜尾孢C apii和C appiicola3 組 2 3 曾蓉等也應(yīng)用相同的方法成功地鑒定了引起 上海市茼蒿葉斑病的病原 1 2 本文也采用了相同的 方法成功將西瓜葉斑病病原鑒定到種 多基因序列 聯(lián)合建樹方法鑒定病原菌已經(jīng)成為植物病害的常用 研究手段之一 2 4 葉云峰等 2 5 藥劑篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn) 7 0 代森錳鋅 可濕性粉劑等藥劑對甜瓜尾孢葉斑病有較好的抑制 作用 本研究選取了1 0種殺菌劑原藥對分離物 613 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜葉斑病病原菌的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選 S H C C C 0 1進行毒力測定 結(jié)果顯示 殺菌劑原藥抑 菌活性大小為 氟啶胺 二硝基苯胺類 己唑醇 戊 唑醇 氟環(huán)唑 三唑類 咪鮮胺 咪唑類 嘧菌酯 甲氧基丙烯酸類 氟吡菌酰胺 吡唑酰胺類 苯 醚甲環(huán)唑 三唑類 氟唑菌酰胺 羧酰胺類 異菌 脲 二甲酰亞胺類 氟啶胺 己唑醇 戊唑醇 氟環(huán) 唑?qū)Ψ蛛x物S H C C C 0 1的抑制活性較強 E C 5 0值在 0 3 7 5 2 1 8 9 0 2 g m L之間 這些結(jié)果為后續(xù)西 瓜葉斑病防治藥劑田間藥效評價及藥劑種類的選擇 提供重要的技術(shù)支持 參考文獻 1 方中達 植病研究方法 M 3版 北京 中國農(nóng)業(yè)出版社 1 9 9 8 2 H A R J U S F E D O S Y U K H P E T E R S O N K R R a p i d i s o l a t i o n o f y e a s t g e n o m i c D N A B u s t n G r a b J O L B M C B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 4 1 8 D O I 1 0 1 1 8 6 1 4 7 2 6 7 5 0 4 8 3 W H I T E T B R U N S T L E E S e t a l A m p l i f i c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c M P C R p r o t o c o l s a g u i d e t o m e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s 1 9 9 0 4 C R O U S P W G R O E N E W A L D J Z R I S E D E J e t a l C a l o n e c t r i a s p e c i e s a n d t h e i rCylindrocladiumanamorphs s p e c i e s w i t h s p h a e r o p e d u n c u l a t e v e s i c l e s J S t u d i e s i n M y c o l o g y 2 0 0 4 5 0 4 1 5 4 3 0 5 J A K L I T S C H W M K O M O N M K U B I C E K C P e t a l Hypocreavoglmayriis p n o v f r o m t h e A u s t r i a n A l p s r e p r e s e n t s a n e w p h y l o g e n e t i c c l a d e i nHypocrea Trichoderma J M y c o l o g i a 2 0 0 5 9 7 6 1 3 6 5 1 3 7 8 6 C A R B O N E I K O H N L A m e t h o d f o r d e s i g n i n g p r i m e r s e t s f o r s p e c i a t i o n s t u d i e s i n f i l a m e n t o u s a s c o m y c e t e s J M y c o l o g i a 1 9 9 9 9 1 3 5 5 3 5 5 6 7 J E A N M O U G I N F T H O M P S O N J D G O U Y M e t a l M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t w i t h C l u s t a l X J T r e n d s i n B i o c h e m i c a l S c i e n c e s 1 9 9 8 2 3 1 0 4 0 3 4 0 5 8 V A I