引文格式 劉爽 唐銳 譚丹 等 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果 J 云南農(nóng)業(yè)大 學(xué)學(xué)報 自然科學(xué) 2024 39 1 54 63 DOI 10 12101 j issn 1004 390X n 202307024 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬 多肉植物黑腐病的生防效果 劉 爽 唐 銳 譚 丹 薛治峰 李夢杰 張廷萍 秦世雯 云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 資源植物研究院 云南 昆明 650500 摘要 目的 明確解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 對擬石蓮花屬 Echeveria 多肉植物黑腐病病原 菌 尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 的生防效果 方法 從小粒野生稻 Oryza minuta 根部分離和鑒定 了1株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株 測定其對擬石蓮花屬多肉植物品種血色羅密歐黑腐病菌F oxysporum KMEARM 2菌株和靜夜黑腐病菌F oxysporum KMJY6菌株的拮抗效果 產(chǎn)鐵載體和生物膜能力 定殖能力以及溫室防效 結(jié)果 OMR1 7菌株對2種黑腐病菌菌絲抑制率分別為57 15 和74 29 菌體抑 制率分別為84 82 和86 15 該菌株可造成2種黑腐病菌的侵染結(jié)構(gòu)畸形 產(chǎn)孢量減少 該菌株產(chǎn)鐵載體 相對量為80 98 具有較強(qiáng)的鐵元素競爭能力 且能夠產(chǎn)生生物膜 在血色羅密歐和靜夜植株的根 莖 葉 內(nèi)穩(wěn)定定殖 預(yù)防黑腐病菌的侵入和蔓延 OMR1 7菌株對血色羅密歐和靜夜黑腐病具有良好的生防效果 溫 室防效分別為80 08 和78 89 結(jié)論 研究結(jié)果將為擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生物防治提供微生物 菌種資源 為相關(guān)生防菌劑及制劑研發(fā)提供參考 關(guān)鍵詞 擬石蓮花屬 多肉植物黑腐病 尖孢鐮刀菌 解淀粉芽孢桿菌 生物防治 中圖分類號 S436 412 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1004 390X 2024 01 0054 10 Biocontrol Efficiency of Bacillus amyloliquefaciens OMR1 7 against Echeveria Black Rot Disease LIU Shuang TANG Rui TAN Dan XUE Zhifeng LI Mengjie ZHANG Tingping QIN Shiwen College of Agriculture Institute of Resource Plants Yunnan University Kunming 650500 China Abstract Purpose To clarify the biocontrol effects of Bacillus amyloliquefaciens OMR1 7 aga inst Fusarium oxysporum causing black rot disease in Echeveria succulent plants Methods The endophytic bacterial strain OMR1 7 isolated from the root tissues of Oryza minuta was identified as B amyloliquefaciens in this study The antagonistic effects of B amyloliquefaciens OMR1 7 against F oxysporum KMEARM 2 on E agavoides cv Romeo and F oxysporum KMJY6 on E derenber gii cv Purpus the pathogens causing black rot disease in succulent plants of the genus Echeveria was evaluated Furthermore its ability to produce iron carriers and biofilms colonization capacity 收稿日期 2023 07 18 修回日期 2024 01 29 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期 2024 03 05 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 32060593 云南省基礎(chǔ)研究計劃面上項(xiàng)目 202101AT070021 云南大 學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 KC22223012 ZC 22222674 作者簡介 劉爽 1998 女 湖北黃岡人 在讀碩士研究生 主要從事植物病害生物防治研究 E mail ls199805182021 通信作者 Corresponding author 秦世雯 1988 女 貴州貴陽人 博士 副教授 主要從事植物病原物 致病機(jī)制研究 E mail shiwenqin 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 自然科學(xué) 2024 39 1 54 63 Journal of Yunnan Agricultural University Natural Science E mail ynauzkxb and greenhouse efficacy were also determined Results The hyphal growth suppressive rates and colony inhibition rates of this antagonistic bacterium against these two pathogens were determined to be 57 15 74 29 and 84 82 86 15 respectively Due to the antagonistic effect of B amylolique faciens OMR1 7 these two pathogens produced abnormal hyphae and decreased sporulation B am yloliquefaciens OMR1 7 produced siderophores with a relative yield of 80 98 indicating the strong competition for iron This strain formed biofilms to colonize in the root stem and leaf tissues of plants which could prevent the invasion and spread of F oxysporum Furthermore the biocontrol ef ficiency of B amyloliquefaciens OMR1 7 against pathogens of E agavoides cv Romeo and E der enbergii cv Purpus black rot disease in the greenhouse was determined to be 80 08 and 78 89 respectively Conclusion The results will provide the biocontrol microbial resource which can develop the microbial fungicide for preventing black rot disease in Echeveria succulent plants Keywords Echeveria black rot disease of succulent plant Fusarium oxysporum Bacillus amyloli quefaciens biological control 多肉植物是一類營養(yǎng)器官肥厚的觀賞植物 品種繁多 易栽培 深受全球消費(fèi)者喜愛 1 多 肉植物是中國云南省 云花 產(chǎn)業(yè)的重要組成部分 截至2021年 云南多肉植物生產(chǎn)面積超67 hm2 產(chǎn)量超3 000萬盆 2 景天科 Crassulaceae 擬石 蓮屬 Echeveria 是近年來熱門的多肉植物種類 具有蓮花狀樁型 品種繁多 葉色和花色美麗 被廣泛應(yīng)用于室內(nèi)盆栽 城市綠化及園林景觀 中 黑腐病是多肉植物生產(chǎn)和家庭種植過程中的 主要病害之一 在全球多肉種植地均有發(fā)生 給 多肉植物產(chǎn)業(yè)造成了一定的損失 3 該病引起多 肉植物的水層組織和維管束組織腐爛和萎蔫 造 成葉片出現(xiàn)透明水漬狀病斑并脫落 莖部呈黑腐 癥狀 最終導(dǎo)致植株枯萎死亡 4 研究發(fā)現(xiàn) 擬 石蓮屬黑腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 能夠危害血色羅密歐 E agavoides cv Romeo 5 靜夜 E derenbergii cv Purpus 6 彩 虹 Echeveria cv Rainbow 7 東云 E agavoides 8 和紫珍珠 Echeveria cv Perle von N rnberg 9 等 品種 尖孢鐮刀菌作為全球防控難度最大的土傳病 原真菌之一 能夠在無寄主的情況下長期存活于 土壤中 而現(xiàn)有的化學(xué)藥劑和農(nóng)業(yè)防治手段無法 將其根除 3 多肉植物黑腐病的防治主要采取化 學(xué)防治手段 由于多肉植物多用于家庭種植 對 其化學(xué)藥劑的毒性有較高要求 生物防治是使用 生物拮抗劑 細(xì)菌 真菌等 通過 以菌治菌 達(dá) 到防病和促進(jìn)寄主生長的目標(biāo) 10 生防菌劑具有 綠色 環(huán)保 對人體安全等特點(diǎn) 是理想的多肉 植物黑腐病防治手段 然而 多肉黑腐病的生物 防治研究目前還處于空白 本研究從小粒野生稻 Oryza minuta 根部分離鑒定了1株解淀粉芽孢桿 菌 Bacillus amyloliquefaciens OMR1 7菌株 通 過測定其拮抗效果 產(chǎn)鐵載體和生物膜能力 定 殖能力和溫室防效 以期明確其對擬石蓮屬多肉 品種血色羅密歐和靜夜的生防效果 為多肉植物 黑腐病的生物防治提供菌種資源 1 材料與方法 1 1 供試材料 供試植物品種 小粒野生稻 由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 多年生稻生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供 擬 石蓮屬多肉植物血色羅密歐和靜夜購于云南昆明 一多肉植物商業(yè)大棚 供試病原菌 血色羅密歐黑腐病菌F oxys porum KMEARM 2 5 和靜夜黑腐病菌F oxyspor um KMJY6 6 均由云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)研究 室鑒定和提供 供試載體 GFP標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌OMR 1 7菌株所用遺傳轉(zhuǎn)化載體pGFP4 412由中國農(nóng) 業(yè)大學(xué)王埼教授惠贈 1 2 生防細(xì)菌的分離 采用組織分離法 11 從健康的小粒野生稻上剪 取根部組織 無菌水沖洗干凈表面污漬后用濾紙 吸干表面水分 根部組織經(jīng)75 酒精浸泡5 min 無菌水漂洗1次 2 5 次氯酸鈉浸泡3 min 無 菌水漂洗3次后 用無菌濾紙吸干表面水分 將 根部組織放入無菌研缽中 加入適量無菌水 研 第 1 期劉 爽 等 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果55 磨后對研磨液進(jìn)行梯度稀釋 吸取組織液100 L 涂布于LB固體培養(yǎng)基 12 上 同時吸取第3次漂 洗液100 L涂布于LB固體培養(yǎng)基 若無細(xì)菌生 長表明根部表面已徹底消毒 將以上平板置于37 黑暗培養(yǎng)1 3 d直至有菌落長出 挑取形態(tài)不同 的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化和保藏 1 3 生防菌株的鑒定 1 3 1 形態(tài)學(xué)鑒定 將OMR1 7菌株劃線培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基 37 培養(yǎng)24 h后觀察其單菌落形態(tài) 隨后進(jìn)行革蘭氏 染色并觀察其菌體形態(tài)特征 1 3 2 分子序列特征鑒定 利用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 提取OMR1 7菌株的DNA 利用16S rDNA引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和1492 R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 以及gyrA基 因引物gyrAF 5 CAGTCAGGAAATGCGTACGTC CTT 3 和gyrAR 5 CAAGGTAATGCTCCAGGC ATTGCT 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增片段經(jīng)電泳和 測序檢測后 在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對分 析 并提交至國家生物信息中心Genbase數(shù)據(jù)庫 軟件以鄰接法構(gòu)建16S rDNA和gyrA系統(tǒng)發(fā)育 樹 Bootstrap值設(shè)為1 000 1 4 拮抗效果的測定 1 4 1 菌絲抑制率的測定 采用平板對峙法 將5 mm2黑腐病菌KMJ Y6和KMEARM 2菌塊分別接種于PDA平板 13 中央 將OMR1 7菌株劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng) 基 37 培養(yǎng)24 h后 挑取單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基 28 180 r min振蕩培養(yǎng)12 h 制成1 108 CFU mL的菌懸液 將OMR1 7菌懸 液劃線接種于病原菌菌塊兩側(cè)2 5 cm處 設(shè)3次 重復(fù)試驗(yàn) 以僅接種病原菌菌塊的PDA平板為 對照 將PDA平板置于28 恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)6 d 待對照組菌絲長滿平板后 按公式計算 OMR1 7菌株對黑腐病菌的菌絲抑制率 抑制 率 對照菌落直徑 處理菌落直徑 對照菌落直 徑 100 1 4 2 菌體抑制率的測定 將OMR1 7菌懸液與融化 冷卻至約40 的 PDA培養(yǎng)基按體積比1 10混合 制成OMR1 7 毒板 將5 mm2黑腐病菌KMJY6和KMEARM 2菌塊接入毒板中心 設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn) 以PDA 平板為對照 將毒板和PDA平板置于28 恒溫 培養(yǎng)5 7 d 然后計算OMR1 7菌株對黑腐病菌 的菌體生長抑制率 計算公式同1 4 1節(jié) 1 5 生防菌株產(chǎn)鐵載體能力測定 1 5 1 產(chǎn)鐵載體定性分析 采用濾紙片法 將生防菌株接種于CAS培 養(yǎng)基 14 上 28 倒置培養(yǎng)2 3 d后觀察是否有透 明圈 以LB培養(yǎng)基為對照 透明圈和菌落圈直 徑的比值即為菌株產(chǎn)鐵載體能力 1 5 2 產(chǎn)鐵載體定量分析 取OMR1 7菌懸液100 L接種于1 mL CAS 培養(yǎng)液 28 C 180 r min振蕩培養(yǎng)48 h 離心后 取上清液300 L置于96孔板中 每個處理3個重 復(fù) 用酶標(biāo)儀 Molecular Devices SpectraMax i3 中國 檢測630 nm處的吸光度值 As 另取LB 培養(yǎng)基與CAS培養(yǎng)液等體積混勻 以其630 nm 處的吸光度值 Ar 作為參比值 根據(jù)公式SU 1 As Ar計算菌株產(chǎn)鐵載體的相對含量 SU 1 6 生防菌株產(chǎn)微生物膜能力的測定 1 6 1 產(chǎn)微生物膜定性分析 將OMR1 7菌株接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 離心后棄上清 用MSgg培養(yǎng)基 15 重懸菌體 在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入 MSgg培養(yǎng)基2 mL 然后加入 OMR1 7菌液5 L 設(shè)置3個重復(fù) 于 37 靜置培養(yǎng)72 h 以MSgg培養(yǎng)基中加入LB 培養(yǎng)基5 L為對照 觀察OMR1 7菌株的成膜 情況 1 6 2 產(chǎn)微生物膜定量分析 將OMR1 7菌株接種于LB培養(yǎng)基 28 180 r min培養(yǎng)48 h取出 每組設(shè)3個重復(fù) 吸取 取出后的菌液4 mL室溫靜止培養(yǎng)24 h 棄培養(yǎng) 液后用去離子水清洗 用1 結(jié)晶紫染色2 min 棄結(jié)晶紫溶液 水洗 風(fēng)干后用1 結(jié)晶紫染 色 吸出多余結(jié)晶紫 用蒸餾水漂洗 待風(fēng)干后 加入洗膜緩沖液 16 振蕩10 15 min后稀釋10 倍 用紫外分光光度計 島津 UV2600 日本 測 定570 nm處的吸光度值 1 7 GFP標(biāo)記OMR1 7菌株的構(gòu)建 將OMR1 7菌株接種于30 mL GM液體培養(yǎng) 基 17 中 28 180 r min培養(yǎng)16 h制成種子液 取種子液1 mL接種于100 mL GM液體培養(yǎng)基 中 28 180 r min培養(yǎng)至600 nm處的吸光度 56云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第 39 卷 值為0 7 取GM培養(yǎng)液1 mL 加至滅菌的1 5 mL 離心管中 冰浴10 min 4 8 000 r min離心 10 min 棄上清液 沉淀用200 L預(yù)冷的ETM 18 漂洗2次 制成OMR1 7菌株感受態(tài)細(xì)胞 取 pGFP4 412質(zhì)粒1 g加至100 L感受態(tài)細(xì)胞中 溫和混合后置于電擊杯 將電擊杯放入Gene Pulser Xcell電擊儀 Bio Rad 美國 進(jìn)行電擊 電 壓1 8 kV 電阻200 隨后加入RM培養(yǎng)基 19 1 mL 并轉(zhuǎn)移至滅菌的1 5 mL離心管 28 200 r min培養(yǎng)4 h 取100 L涂布于LB固體培 養(yǎng)基 含100 g L新霉素 28 倒置培養(yǎng)24 h 待長出轉(zhuǎn)化子后 挑取轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行PCR檢 測 檢測引物為gfp F 5 GCCTCTAGAATGAG TAAAGGAGAAGAACTTTTC 3 和gfp R 5 GC CAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC 3 1 8 OMR1 7菌株在多肉植物體內(nèi)定殖的觀察 采用灌根接種法 將GFP標(biāo)記的OMR1 7菌 株單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基28 180 r min 振蕩培養(yǎng) 制成1 108 CFU mL的OMR1 7 GFP 菌懸液 取25 mL分別接種于血色羅密歐和靜夜 植株 5 d后接種黑腐病菌孢子懸浮液40 mL 每 個處理設(shè)置10株植株 重復(fù)3次 28 d后取多 肉植物的根 莖和葉進(jìn)行冷凍切片 置于激光共 聚焦顯微鏡 Olympus FV3000 日本 下觀察 激 發(fā)光波長設(shè)置為488 nm 發(fā)射光波長為510 nm 1 9 多肉黑腐病溫室防效測定 將黑腐病菌接種于Bilai s培養(yǎng)基 20 中 28 180 r min振蕩培養(yǎng)5 d 用4層無菌紗布過濾菌 絲 制備成密度為1 106 mL 1的孢子懸浮液 將 OMR1 7菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中 28 180 r min振蕩培養(yǎng)12 h 制備成1 108 CFU mL的 OMR1 7菌懸液 分別選取大小一致的健康多肉品種血色羅密 歐和靜夜 采用灌根接種法 設(shè)置以下3個處 理 清水對照 接種黑腐病菌孢子懸浮液 40 mL 先接種OMR1 7菌液25 mL 5 d后接 種黑腐病菌孢子懸浮液40 mL 每個處理接種植 株10盆 每個處理重復(fù)3次 接種后的植株放 置于溫度為25 濕度為50 的溫室中 每天 觀察黑腐病發(fā)病癥狀 28 d后統(tǒng)計發(fā)病率和生防 效果 發(fā)病率 發(fā)病植株數(shù) 調(diào)查總株數(shù) 100 生防效果 處理 發(fā)病植株數(shù) 處理 發(fā)病植株 數(shù) 處理 發(fā)病植株數(shù) 100 2 結(jié)果與分析 2 1 OMR1 7菌株的鑒定 OMR1 7菌株在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后單 菌落呈圓形 淡黃色 半透明 邊緣整齊 突起 形狀平展 表面濕潤且有黏稠感 圖1a 革蘭氏 染色發(fā)現(xiàn)該菌為短桿狀革蘭氏陽性菌 圖1b 分 子序列鑒定發(fā)現(xiàn) OMR1 7菌株16S rDNA基因 GenBase No C AA009084 1 與從栽培稻品種 金剛30中分離的Bacillus amyloliquefaciens Lx 11 菌株 GenBank No HQ179100 1 相似性最高 為 99 93 OMR1 7菌株gyrA基因 GenBase No C AA016452 1 與從番茄根際土壤中分離的B am yloliquefaciens RNB 92菌株 GenBank No LC09 6069 1 相似性最高 為100 00 通過構(gòu)建16S rDNA和gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 圖1c和1d 發(fā)現(xiàn) OMR1 7菌株與B amyloliquefaciens聚在同一分 支 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子序列鑒定結(jié)果可知 OM R1 7菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌 B amylolique faciens 2 2 OMR1 7對多肉黑腐病原菌的抑制效果 OMR1 7菌株與血色羅密歐黑腐病原菌KM EARM 2菌株 靜夜黑腐病原菌KMJY6菌株之 間均形成了明顯的抑菌帶 圖2a 并且造成了黑 腐病菌菌絲末端膨大 圖2b OMR1 7菌株對 KMEARM 2和KMJY6菌株的菌絲生長抑制率分 別為57 15 和74 29 圖2c KMEARM 2和K MJY6菌株在OMR1 7菌株制成的毒板上生長受 到抑制 OMR1 7菌株對2個病原菌菌體抑制率 分別為84 82 和86 15 圖2d 同時造成2個 病原菌孢子產(chǎn)量減少 圖2e 以上結(jié)果說明解淀 粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對血色羅密歐和靜夜黑 腐病菌的菌絲和孢子生長具有顯著抑制效果 且 造成病原菌侵染結(jié)構(gòu)畸形 2 3 OMR1 7菌株產(chǎn)鐵載體能力 OMR1 7在CAS培養(yǎng)基上其菌落周圍形成了 橙黃色透明圈 圖3 且OMR1 7菌株產(chǎn)鐵載體 的透明圈和菌落圈直徑的比值為4 43 0 17 通過 定量測定 OMR1 7菌株產(chǎn)生鐵載體的相對含量 為80 98 以上結(jié)果說明該菌株具有較強(qiáng)的鐵載 體分泌能力 能夠與植物病原真菌競爭鐵元素進(jìn) 而抑制病原菌 第 1 期劉 爽 等 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果57 2 4 OMR1 7菌株產(chǎn)微生物膜能力 OMR1 7菌株在MSgg培養(yǎng)基中形成了密集 褶皺的生物膜 圖4 OMR1 7菌株產(chǎn)生的生物 膜在570 nm處的吸光度值為1 60 0 38 說明其 具有較強(qiáng)的能力 有利于菌株適應(yīng)環(huán)境以及提高 在寄主中定殖和抗菌的活性 2 5 OMR1 7菌株在擬石蓮花屬多肉植物中的 定殖 OMR1 7 GFP菌株能成功定殖于血色羅密歐 和靜夜的根 莖和葉部 圖5 相較于葉部 OM R1 7 GFP菌株在寄主根部和莖部數(shù)量較多 說 明OMR1 7菌株具有內(nèi)生特性 占據(jù)了擬石蓮屬 多肉植物體根 莖和葉內(nèi)生態(tài)位 有效阻止了黑 腐病菌的侵入和擴(kuò)增 2 6 OMR1 7菌株對擬石蓮花屬黑腐病的生防 效果 接種黑腐病菌28 d后 血色羅密歐和靜夜植 株葉部和莖部出現(xiàn)了黑腐癥狀 圖6a b 發(fā)病率 分別為83 33 和100 00 而先接種OMR1 7 菌株5 d后再接種病原菌的植株發(fā)病率分別為 16 67 和33 33 圖6c OMR1 7菌株對血色 羅密歐和靜夜黑腐病的盆栽防效分別達(dá)到80 08 和78 89 圖6d 說明解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病具有顯著的生 防效果 3 討論 解淀粉芽孢桿菌是目前應(yīng)用最為廣泛的生防 細(xì)菌之一 具有廣譜抗菌活性和較強(qiáng)的抗逆能 力 能夠促進(jìn)多種植物生長 21 解淀粉芽孢桿菌 對尖孢鐮刀菌 F oxysporum 灰葡萄孢 Botryt is cinerea 稻瘟病菌 Magnaporthe oryzae 灰 綠青霉 Penicillium glaucum 葉霉病菌 Clado sporium fulvum 等植物病原真菌具有顯著的抑菌 效果 22 23 研究表明 解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生抑 菌次生代謝物 表面活性素 大環(huán)內(nèi)酯H 芽孢 素 豐原素 地非西丁 桿菌溶素等 以及水解酶 類 幾丁質(zhì)酶和蛋白酶 抑制植物病原真菌的生 長 24 25 本研究發(fā)現(xiàn) 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7 菌株與擬石蓮屬多肉植物黑腐病菌F oxys porum拮抗互作時 兩者之間形成了明顯的抑菌 帶 病原菌菌絲出現(xiàn)畸形且產(chǎn)孢量降低 說明 OMR1 7菌株能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)影響擬石蓮屬多 肉植物黑腐病菌侵染結(jié)構(gòu)和無性繁殖體的形成 進(jìn)而影響病原菌的侵入和擴(kuò)繁 深入挖掘和鑒定 注 a LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) b 革蘭氏染色結(jié)果 c 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 d gyrA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Note a colony of B amyloliquefaciens OMR1 7 on LB medium b cells of B amyloliquefaciens OMR1 7 based on Gram staining c phylogenetic tree from 16S rDNA sequences d phylogenetic tree from gyrA genes 圖 1 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株的形態(tài)特征和分子序列系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 1 Morphological characteristic and molecular sequence phylogenetic tree of Bacillus amyloliquefaciens OMR1 7 strain 58云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第 39 卷 注 a OMR1 7菌株對黑腐病菌KMEARM 2和KMJY6菌株的菌絲生長抑制效果以及菌體生長抑制效果 b OMR1 7菌株造成黑腐病菌 KMEARM 2和KMJY6菌株菌絲膨大畸形 c e 表示差異顯著 P 0 05 表示差異極顯著 P 0 01 下同 Note a hyphal and colony growth of Fusarium oxysporum KMEARM 2 and KMJY6 were inhibited by B amyloliquefaciens OMR1 7 b F oxysporum KMEARM 2 and KMJY6 produced abnormal hyphae due to the antagonistic effect of B amyloliquefaciens OMR1 7 c e indicates a significant differ ences P 0 05 indicates an extremely significant differences P 0 01 the same as below 圖 2 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病菌的抑制效果 Fig 2 Antagonistic effects of B amyloliquefaciens OMR1 7 against Fusarium oxysporum causing black rot on Echeveria succulent plants 注 CK LB培養(yǎng)基 1 4 OMR1 7菌液 Note CK LB medium 1 4 OMR1 7 strains 圖 3 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株在 CAS平板上的產(chǎn)鐵載體情況 Fig 3 Siderophore produced by B amyloliquefaciens OMR1 7 on CAS plates 注 a LB培養(yǎng)基接種在MSgg液態(tài)培養(yǎng)基72 h后的情況 b OMR1 7菌株接種在MSgg液態(tài)培養(yǎng)基72 h后形成生物膜的情況 Note a LB medium was inoculated in Msgg liquid medium after 72 h b B amyloliquefaciens OMR1 7 produced biofilms in Msgg liquid medium after 72 h 圖 4 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株在 Msgg液態(tài)培養(yǎng)基中形成生物膜 Fig 4 Biofilms produced by B amyloliquefaciens OMR1 7 in Msgg liquid medium 第 1 期劉 爽 等 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果59 OMR1 7菌株的抗菌物質(zhì) 有助于開發(fā)擬石蓮屬 多肉植物黑腐病的生物農(nóng)藥 高產(chǎn)鐵載體的生防細(xì)菌通過競爭土壤中的鐵 元素從而抑制植物病原菌的生長 促進(jìn)寄主植物 健康 26 已有研究報道不同種的芽孢桿菌均具有 高產(chǎn)鐵載體特性 27 29 黃瓜根際土壤中分離的B amyloliquefaciens B2菌株能夠產(chǎn)鐵載體 抑制黃 瓜枯萎病菌 F oxysporum f sp cucumerinum 促 進(jìn)輪作環(huán)境下的黃瓜生長 30 本研究發(fā)現(xiàn) OM R1 7菌株鐵載體產(chǎn)量高達(dá)80 98 說明其與土 傳性擬石蓮花屬多肉植物黑腐病菌F oxyspor um拮抗互作時 具有強(qiáng)鐵素競爭能力 能夠有 效抑制病原菌入侵 解淀粉芽孢桿菌寄主范圍廣泛 可穩(wěn)定定殖 于寄主植物根際 葉際和體內(nèi) 31 B amylolique faciens X5和BQA2菌株在番茄根際有較強(qiáng)的定 殖能力 32 B amyloliquefaciens Jt84菌株能夠在 水稻葉表長期有效定殖 33 B amyloliquefaciens CC09菌株在小麥根內(nèi) 根表和根際均能定殖 且不影響根組織細(xì)胞結(jié)構(gòu) 34 本研究從小粒野生 稻中分離到的B amyloliquefaciens OMR1 7菌株 可在非寄主植物擬石蓮屬多肉植物的根 莖和葉 部有效定殖 OMR1 7菌株在擬石蓮屬多肉植物 的根和莖部大量定殖 可有效阻止土傳性黑腐病 菌F oxysporum從根部侵入 繼而向維管束蔓 延 說明OMR1 7菌株具有與黑腐病菌進(jìn)行空間 競爭的能力 此外 B amyloliquefaciens占據(jù)寄 主植物根際生態(tài)位后 還能招募有益微生物群促 進(jìn)植物生長 35 細(xì)菌生物膜是細(xì)菌群體聚集形成的膜狀物 幫助其黏附寄主 提高環(huán)境適應(yīng)性 36 生物膜被 認(rèn)為是B amyloliquefaciens在寄主環(huán)境定殖并與 植物病原菌進(jìn)行空間競爭的重要物質(zhì)之一 37 39 它還能在逆境條件下維持B amyloliquefaciens的 營養(yǎng)供給 減少逆境傷害 40 本研究也發(fā)現(xiàn) OM R1 7菌株能夠產(chǎn)生生物膜 可以幫助其高效定殖 于寄主 提高在土壤和寄主中長期存活的能力 解淀粉芽孢桿菌對多種植物真菌病害具有良 好的生防潛力 目前研究報道該菌對F oxyspor um引起病害的生防效果可達(dá)60 以上 21 如 分離自土壤的B amyloliquefaciens B6菌株對F ox ysporum f sp lycopersicis引起的番茄枯萎病防效 為64 35 41 B amyloliquefaciens Y 4菌株對F oxysporum f sp cubense引起的香蕉枯萎病防效 為67 9 42 B amyloliquefaciens HD 5菌株對F oxysporum引起的草莓根腐病防效達(dá)77 78 43 圖 5 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株在擬石蓮屬多肉植物血色羅密歐 上 和靜夜 下 中的定殖 Fig 5 Colonization of B amyloliquefaciens OMR1 7 in E agavoides cv Romeo above and E derenbergii cv Purpus below 60云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第 39 卷 噴施解淀粉芽孢桿菌微生物葉面肥懸浮劑對葡萄 白粉病的防治效果達(dá)65 以上 44 本研究分離 的B amyloliquefaciens OMR1 7菌株對擬石蓮屬 多肉植物黑腐病的生防效果為78 89 80 08 且該菌株對供試2種多肉植物黑腐病的生防效果 無顯著差異 但OMR1 7菌株在PDA培養(yǎng)基上 對血色羅密歐黑腐病菌的抑菌效果卻顯著低于對 靜夜黑腐病菌的抑菌效果 這是由于生防細(xì)菌在 植物體內(nèi)的生防效果受自身定殖能力 寄主和環(huán) 境等多重因素影響 因此體外抑菌防效和田間防 效存在一定差異 45 46 4 結(jié)論 本研究首次對擬石蓮花屬多肉植物的生物防 治進(jìn)行了生防細(xì)菌挖掘 明確了解淀粉芽孢桿菌 OMR1 7菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病的生防 效果 研究結(jié)果將為多肉植物黑腐病的防控和生 防藥劑開發(fā)提供參考 圖 6 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮屬多肉植物血色羅密歐和靜夜黑腐病的生防效果 Fig 6 Biocontrol efficiency of B amyloliquefaciens OMR1 7 against black rot diseases of E agavoides cv Romeo EA and E derenbergii cv Purpus ED 第 1 期劉 爽 等 解淀粉芽孢桿菌OMR1 7菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果61 參考文獻(xiàn) 胡瑩冰 沈守云 多肉植物的景觀應(yīng)用及發(fā)展趨勢 J 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013 40 12 46 DOI 10 16768 j issn 1004 874x 2013 12 057 1 劉磊 多肉還能再火十年嗎 N OL 中國花卉報 2023 04 20 2 2023 07 18 DOI 10 38297 ki nzghh 2023 000168 2 GULLINO M L DAUGHTREY M L GARIBALDI A et al Fusarium wilts of ornamental crops and their man agement J Crop Protection 2015 73 50 DOI 10 1016 j cropro 2015 01 003 3 KAMALI SARVESTANI S MOSTOWFIZADEH GH ALAMFARSA R SALMANINEZHAD F et al Fusari um and Neocosmospora species associated with rot of Cactaceae and other succulent plants J Journal of Fu ngi 2022 8 4 364 DOI 10 3390 jof8040364 4 XUE Z F JI M L TIAN Q L et al First report of Fusarium oxysporum causing stem and leaf rot on Ec heveria agavoides cv Romeo in southwestern China J Journal of Plant Pathology 2023 105 16 319 DOI 10 1007 s42161 022 01220 0 5 薛治峰 張樹竹 孔德婷 等 多肉植物 靜夜 黑腐病的 病原菌鑒定 J 植物病理學(xué)報 2023 53 5 981 DOI 10 13926 ki apps 000842 6 劉浩 楊爽 田佩玉 等 多肉植物彩虹黑腐病病原菌的 分離鑒定 C 彭友良 王文明 陳學(xué)偉 中國植物病理 學(xué)會 2019年學(xué)術(shù)年會論文集 北京 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù) 出版社 2019 7 ORTU G BERTETTI D GULLINO M L et al Fusari um oxysporum f sp echeveriae a novel forma specialis causing crown and stem rot of Echeveria agavoides J Phytopathologia Mediterranea 2015 54 1 64 DOI 10 14601 Phytopathol Mediterr 13533 8 YAO J A HUANG P CHEN H X et al Fusarium oxysporum is the pathogen responsible for stem rot of the succulent plant Echeveria Perle von N rnberg and ob servation of the infection process J European Journal of Plant Pathology 2021 159 3 555 DOI 10 1007 s10 658 020 02186 4 9 COLLINGE D B JENSEN D F RABIEY M et al Bio logical control of plant diseases what has been achieved and what is the direction J Plant Pathology 2022 71 5 1024 DOI 10 1111 ppa 13555 10 DUAN