北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 收稿日期 基金項(xiàng)目 北京市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局鄉(xiāng)村振興項(xiàng)目 第一作者 孫春輝 碩士研究生 主要從事植物保護(hù)研究 劉麗為共同第一作者 通信作者 李永強(qiáng) 博士 副教授 主要從事植物病毒學(xué)研究 平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒病的病原鑒定 孫春輝 劉 麗 魯書豪 梁宇卿 王昀軒 崔雯莉 高佳儀 李永強(qiáng) 北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 摘 要 目的 為了給平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)設(shè)施番茄病毒病防治提供依據(jù) 方法 年 月在河北村 果各莊 早立莊 梨羊村 小屯村番茄種植區(qū)采集到表現(xiàn)有黃化 蕨葉 褪綠等疑似病毒病癥狀的番茄葉片 利用小 深度測(cè)序技術(shù)對(duì)混合葉片進(jìn)行病毒篩查 并利用 驗(yàn)證 結(jié)果 侵染當(dāng)?shù)胤训牟《痉N類有 黃瓜花葉病 毒 南 方 番 茄 病 毒 番 茄 褪 綠 病 毒 和番茄黃化曲葉病毒 在 份樣品中的病毒 檢出率依次為 兩種及以上病毒復(fù)合侵染率為 并通過對(duì) 個(gè) 進(jìn)行全序列擴(kuò)增及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 表明其均與 北京分離物的親緣關(guān)系最近 結(jié)論 病毒病在馬坊鎮(zhèn) 普遍發(fā)生且危害較為嚴(yán)重 檢測(cè)結(jié)果表明 是侵染當(dāng)?shù)胤训闹饕《?且復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重 關(guān)鍵詞 設(shè)施 番茄 病毒病 病原鑒定 小 深度測(cè)序 中圖分類號(hào) 文章編號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 近年來 隨著安全飲食觀念的不斷深入 蔬菜 產(chǎn)業(yè)在世界范圍內(nèi)得到了迅猛的發(fā)展 其種植區(qū)域 不斷擴(kuò)大 帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益 番茄 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高 廣受歡迎 是全球蔬菜 作物中產(chǎn)量最高的種類 中國(guó)的番茄產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)規(guī) 模宏大 其產(chǎn)量居各國(guó)之首 在市場(chǎng)進(jìn)出口作物中 北 京 農(nóng) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 卷 占有重要份額 但番茄的生產(chǎn)面臨著一重大難題 番茄病毒病發(fā)生頻繁 難以防控 嚴(yán)重影響番茄的 產(chǎn)量和品質(zhì) 如何有效應(yīng)對(duì)病毒病的發(fā)生和發(fā)展 是當(dāng)前番茄產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展中亟待解決的問題 根據(jù)最新報(bào)道 國(guó)內(nèi)在番茄中鑒定到的病毒已 更新為 種 在北京地區(qū) 報(bào)道的番茄毒原種類 主 要 有 番 茄 花 葉 病 毒 黃 瓜 花 葉 病 毒 馬鈴薯 病毒 馬鈴 薯 病毒 煙草蝕紋病毒 苜?；ㄈ~病毒 番 茄 褪 綠 病 毒 番茄黃化曲葉病毒 番茄斑萎病毒 等 同時(shí)番茄 病毒病在田間的癥狀表型特別復(fù)雜 不同生長(zhǎng)周期 表現(xiàn)出不同癥狀 且復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重 對(duì)番茄生 產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅 是世界番茄種植區(qū)普通存在的一種植 物病毒 在已被報(bào)道的番茄病毒中危害最大 其寄 主除了番茄外 還包括辣椒 菜豆 棉花 擬南芥和 煙草等 多種植物 主要通過煙粉虱進(jìn)行傳播 不能通過機(jī)械摩擦傳播 在番茄的苗期就 可引起發(fā)病 通常癥狀表現(xiàn)為頂部葉片黃化 出現(xiàn) 黃綠斑 葉片變小 葉緣向內(nèi)卷曲 嚴(yán)重時(shí)植株矮 化 生長(zhǎng)停止 不能正常開花結(jié)果 對(duì)番茄生產(chǎn)造成 毀滅性打擊 世紀(jì)中期 以色列首次報(bào)道了番茄 黃化曲葉病毒病 年代末 引起該病的病原被正 式命名為 年 在中國(guó)上 海首次報(bào)道 最近幾年 已擴(kuò)散到中國(guó) 各省市的番茄種植區(qū) 每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù) 十億元 對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重影響 近年來 小 深度測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)病害監(jiān) 測(cè)尤其是病毒病原鑒定領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用 小 深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病毒是基于 沉默 原理的一種檢測(cè)技術(shù) 病毒侵染后會(huì)將自身的基因 組釋放到植物體內(nèi) 同時(shí)會(huì)觸發(fā)植物的抗病毒防御 機(jī)制 即 干擾 通過 干擾的方式 植物細(xì) 胞內(nèi) 形 成 大 量 的 病 毒 衍 生 小 干 擾 獲得這 些小 序列 再通過生物信息學(xué)相關(guān)軟件分析 將測(cè)序數(shù)據(jù)拼接 就可以獲取植物中病毒的序列信 息 該研究調(diào)查了北京市平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒 病的發(fā)生情況 并利用小 深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè) 了侵染當(dāng)?shù)胤训牟《痉N類 擴(kuò)增了 個(gè) 基因組全序列 并對(duì)其進(jìn)行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育 分析 為當(dāng)?shù)胤巡《静〉念A(yù)防和綜合防治奠定 基礎(chǔ) 材料與方法 番茄病毒病樣品采集 年在北京市平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)的河北村 果各 莊 早立莊 梨羊村 小屯村的番茄大棚中采集到疑 似病毒病的番茄葉片 液氮快速冷凍后放入 超低溫冰箱中保存 以備后續(xù)使用 小 深度測(cè)序的番茄葉片樣品處理 用植物 快速提取試劑盒 提取番 茄葉片樣品總 用 檢測(cè) 樣 品 的 質(zhì) 量 和 濃 度 用 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 和 檢測(cè) 樣品的完整性 當(dāng)測(cè) 定 質(zhì) 量 濃 度 體 積 值 時(shí) 樣 品檢測(cè)合格 樣品檢測(cè)合格后委托華大基因公司 進(jìn)行小 分離 建庫和測(cè)序工作 將在河北村 采集的 葉片等量混合 命名為 在 小屯村采集的 葉片等量混合 命 名為 將梨羊村采集的 早立莊村采集的 和果各莊村采集的 葉片等量混合 命名為 分別進(jìn)行測(cè)序 小 深度測(cè)序數(shù)據(jù)處理 利用 語言腳本將小 深度測(cè)序原始數(shù) 據(jù)中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)剔除 去除接頭序列 得到有效 序列 將有效序列通過 軟件 剔除基因組序列后 與未比對(duì)到的小 通 過 軟件進(jìn)行拼接 獲得多個(gè) 拼接所得的 通過 網(wǎng)站的病毒核酸數(shù)據(jù)庫和蛋白 質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 比對(duì) 并對(duì)其分類注釋 法驗(yàn)證 根據(jù)小 測(cè)序結(jié)果及已有報(bào)道 設(shè)計(jì)候選 病毒的特異性引物對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證 引物信息見表 病毒 通過 方式驗(yàn)證 其余病毒 通過 方 式 驗(yàn) 證 分別按照植物基因組 提取試劑盒 和植物總 提取試 劑盒 的說明書提取病樣葉片的總 總 以提取的 總 為模板 引物 和 各添加 添 加 隨后用 處理過的水將反應(yīng)體系體 年第 期 孫春輝 等 平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒病的病原鑒定 積補(bǔ)充至 將上述反應(yīng)體系在 水浴中 孵育 向反應(yīng)體系中添加 逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)緩沖液 反轉(zhuǎn)錄酶 和 抑制 劑 合 成 試劑均采購(gòu)于 表 用于檢測(cè)病毒的引物 引物 引物序列 以合成的 和提取的 為模板進(jìn)行 擴(kuò)增 擴(kuò)增總體系為 包括上 下 游引物各 預(yù)混液 擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性 變性 退火 延伸 進(jìn)行 個(gè)循環(huán) 補(bǔ)平 擴(kuò)增結(jié) 束后 通過瓊脂糖凝聚電泳觀察片段大小 并將片 段 進(jìn) 行 回 收 純 化 后 克 隆 至 載 體 中 通過熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌 感受態(tài) 之后通過菌落 鑒定陽性克 隆 將陽性克隆送至生工生物工程 上海 技術(shù)服 務(wù)有限公司測(cè)序 序列拼接 將對(duì) 陽 性 克 隆 測(cè) 序 獲 得 的 病 毒 序 列 利 用 軟件進(jìn)行序列拼接 拼接結(jié)果與 中的 進(jìn)行同源比對(duì)分析 并下載相關(guān)序列 數(shù)據(jù) 全基因組序列擴(kuò)增 根據(jù)小 深度測(cè)序結(jié)果 通過 軟件拼 接得 到 五 條 不 同 的 序 列 分 兩 段 對(duì) 全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增 所設(shè)計(jì)的 對(duì)引 物信息見表 感病植株 的提取 擴(kuò)增 回收 連接 及轉(zhuǎn)化參考 進(jìn)行 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析 利用 軟件對(duì)擴(kuò)增獲得的 的序列進(jìn)行組裝 根據(jù) 中 鑒 定 基因組上每個(gè) 的具體位置 并通 過 網(wǎng)站對(duì)拼接得到的這五條 全長(zhǎng) 序列進(jìn)行核苷酸一致性分析 表 全長(zhǎng)序列擴(kuò)增所需引物 引物 引物序列 利用 軟件 采用最大似然法 根據(jù) 的全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 可信度設(shè)置為 次重復(fù) 分析其親緣關(guān)系 結(jié)果與分析 番茄病毒病樣本的檢測(cè) 樣品 質(zhì)量檢測(cè) 所提取 的質(zhì)量 結(jié)果如圖 表 所示 其 的 均大 于 濃度均大于 值均大于 圖 樣品 電泳 表 樣品 質(zhì)量檢測(cè) 樣品 質(zhì)量濃度 番茄發(fā)病情況 在平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)的河北村 果各莊 早立莊 梨羊村 小屯村的番茄大棚中采集 的疑似病毒病葉片的癥狀包括黃化 卷葉 蕨葉 矮 化 顯脈和褪綠等 一部分葉片表現(xiàn)其中的一種癥 狀類型 而大部分葉片則表現(xiàn)出復(fù)合癥狀 深度測(cè)序結(jié)果分析 通過小 深度測(cè)序 技術(shù) 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后對(duì)得到的 序列在 上進(jìn)行 比對(duì) 檢測(cè)出番茄葉片上帶有 以及 四種病毒序列 北 京 農(nóng) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 卷 表 結(jié)果 序號(hào) 病毒名稱 數(shù) 未檢測(cè)到 未檢測(cè)到 未檢測(cè)到 未檢測(cè)到 檢測(cè) 根據(jù)文中設(shè)計(jì)的病毒特異性引物 以提取的番 茄葉片 和反轉(zhuǎn)錄的 為模板 經(jīng) 擴(kuò)增 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 明確樣品中確 有測(cè)序結(jié)果中預(yù)測(cè)的 這四種病毒 圖 其中梨羊村的樣品中檢測(cè)到有 注 樣品 陰性對(duì)照 圖 疑似感染番茄病毒的番茄樣品 檢測(cè)結(jié)果 和 果各莊和早立莊的樣品中 檢測(cè)到有 和 河北村的樣品中只檢 測(cè)到了 而小屯村的樣品中檢測(cè)到 和 這 種病毒 由此表明小 測(cè)序結(jié)果具有可靠性 在 份的樣品中 種病毒的檢出率依次為 種及以上病毒復(fù)合侵染率為 番茄黃化曲葉病毒基因組全序列擴(kuò)增 分段擴(kuò)增番茄黃化曲葉病毒 利用引物 對(duì)番茄病葉進(jìn)行基 因組擴(kuò)增 分別獲得大小約為 的電泳條 帶 條帶大小符合預(yù)期 且沒有在健康植株中檢測(cè) 到條帶 病毒基因組結(jié)構(gòu)分析 拼接得到的五條 分離物的全長(zhǎng)序列 命名為 和 其全長(zhǎng)分別為 和 進(jìn)一步分析 個(gè)分離物的分子特征發(fā)現(xiàn) 個(gè) 分離物與已報(bào)道的 具有相同的結(jié)構(gòu)特征 基因組均為單鏈閉合環(huán)狀 編碼 個(gè)開放閱讀 框 其中病毒鏈和互 補(bǔ)鏈的編碼框信息如表 所示 表 個(gè) 分離物的開放閱讀框信息 病毒分離物相似性比對(duì) 在 網(wǎng)站上對(duì) 拼接出的病毒全序列進(jìn)行比對(duì) 發(fā)現(xiàn) 與 分離物 登錄號(hào) 相似度最高 為 與分離物 登錄號(hào) 相似 度 最 高 為 與 分 離 物 相似度最高 為 與分離物 相似度最 高 為 與分離物 相似度最高 為 拼接序列與其他分離物的 年第 期 孫春輝 等 平谷區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒病的病原鑒定 核苷酸相似性比對(duì)見表 表 拼接序列與 其他分離物相似性比對(duì) 分離物名稱 登錄號(hào) 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將得到的病毒序列全長(zhǎng) 在 網(wǎng)站上進(jìn)行 比對(duì) 并基于比對(duì)結(jié)果與 當(dāng)前已經(jīng)報(bào)道過的 的不同分離物 通過構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹 并以同科不同屬的 做為外源病毒作為對(duì)照 進(jìn) 行分析 如圖 拼接得到的 番 茄 黃 化 曲 葉 病 毒 和 與中國(guó)北 京番茄分離物 共聚與同一個(gè)分支上 親緣關(guān)系最近 和 與中國(guó) 北京番茄分離物 共聚與同一個(gè)分支 上 親緣關(guān)系最近 都與同屬的中國(guó)云南番茄分離 物 中國(guó)江蘇番茄分離物 中國(guó)陜西番茄分離物 等 個(gè)分離物聚在不同的分支上 親緣關(guān)系 較遠(yuǎn) 圖 番茄病毒 全序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 結(jié)論與討論 該研究利用小 深度測(cè)序技術(shù)對(duì)采自平谷 區(qū)馬坊鎮(zhèn)河北村 果各莊 早立莊 梨羊村 小屯村 五個(gè)設(shè)施番茄基地的 份疑似病毒病的混合葉片 樣品進(jìn)行了毒原檢測(cè) 共檢測(cè)到 和 種病毒 對(duì)每份樣品進(jìn)行 驗(yàn)證 發(fā)現(xiàn)每份番茄樣品中都檢測(cè)到有病毒侵 北 京 農(nóng) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 卷 染 其中檢出最多的為 其檢出率為 并且發(fā)現(xiàn)多數(shù)樣品中存在 種病毒的復(fù)合侵染 復(fù)合侵染率達(dá) 綜合到地區(qū)來看 梨羊村 果各莊和早立莊地區(qū)的樣品在共檢測(cè)到 三種病毒 和 兩種病 毒的復(fù) 合 侵 染 嚴(yán) 重 河北村的樣品中只檢測(cè)到 一種 病 毒 而小屯村中的樣品中檢測(cè)到 和 四種病毒 存在 種 病毒甚至 種病毒的復(fù)合侵染 由此可認(rèn)為 平谷 區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒病的毒原有 和 種 其中 為優(yōu)勢(shì)種 病毒病發(fā) 生較為普遍 病毒復(fù)合侵染嚴(yán)重 同時(shí)對(duì)各地區(qū)檢 測(cè)到的 序列拼接后得到 個(gè) 序 列 對(duì)其進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增 并分析各基因序列 的分子特征及核苷酸相似性 證實(shí) 個(gè) 分 離物的全基因序列分別為 和 確認(rèn)這 個(gè)病毒分離物是 分離物 并通過系統(tǒng)進(jìn) 化分析發(fā)現(xiàn) 和 與中國(guó)北京番茄分離物 親緣關(guān)系 最近 和 與中國(guó)北京番茄 分離物 親緣關(guān)系最近 由此可見 北 京地區(qū)的番茄中 發(fā)生普遍 類型復(fù)雜 其防 治工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn) 結(jié)合對(duì)當(dāng)?shù)胤巡∠x害的 調(diào)查分析 認(rèn)為煙粉虱的遷徙 種苗來源不穩(wěn)等可 能是病毒遷入的主要途徑 據(jù)此研究 為明確平谷 區(qū)馬坊鎮(zhèn)番茄病毒病的發(fā)生情況提供了理論依據(jù) 為番茄病毒病的防控和抗病毒育種奠定了基礎(chǔ) 參考文獻(xiàn) 劉欽 鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展分析 北方 園藝 李君明 項(xiàng)朝陽 王孝宣 等 十三五 我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及展 望 中國(guó)蔬菜 嚴(yán)婉榮 王寶 吉訓(xùn)聰 等 番茄病毒病種類及主要鑒定方法研 究進(jìn)展 分子植物育種 馮蘭香 楊翠榮 北京地區(qū)番茄病毒病病毒原種類的監(jiān)測(cè)與黃 瓜花葉病毒株系的鑒定 中國(guó)蔬菜 李明遠(yuǎn) 黃化曲葉病毒病傳入北京 番茄生產(chǎn)面臨威脅 植 物保護(hù) 李明遠(yuǎn) 陳東亮 李雪梅 等 李明遠(yuǎn)斷病手跡 八十六 北京蔬 菜上的幾種番茄斑萎病毒 農(nóng)業(yè)工程技術(shù) 張前榮 李大忠 朱海生 等 番茄黃化曲葉病毒研究進(jìn)展 分子植物育種 李明遠(yuǎn) 試說北京番茄病毒病 年的變遷 以番茄黃化曲 葉病毒為主的時(shí)期 蔬菜 蘇秀 小 深度測(cè)序在幾種木本植物病毒鑒定中的應(yīng)用 杭州 浙江大學(xué) 于云奇 小 深度測(cè)序在柑橘新發(fā)病毒的鑒定及 誘導(dǎo)的抗病毒新機(jī)制中的研究 重慶 西南大學(xué) 閆亞莉 基于小 深度測(cè)序技術(shù)檢測(cè)鑒定山東省及周邊地 區(qū)番茄病毒種類 泰安 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)