山 西 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2024 52 2 65 77 Journal of Shanxi Agricultural Sciences 抗感菜豆品種對菜豆普通花葉病毒 侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析 牛 靜 雅 唐 慕 寧 王 新 華 霍 思 凡 武 文 艷 梁 興 瑞 黃 欣 琪 王 古 悅 馮 雪 山 西 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 植 物 保 護 學(xué) 院 山 西 太 谷 030801 摘 要 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 BCMV 在 世 界 范 圍 內(nèi) 分 布 廣 泛 并 可 造 成 菜 豆 嚴 重 減 產(chǎn) 菜 豆 是 BCMV 的 主 要 寄 主 不 同 遺 傳 背 景 的 菜 豆 對 BCMV 侵 染 的 響 應(yīng) 存 在 顯 著 差 異 目 前 菜 豆 抗 性 基 因 功 能 及 BCMV 的 致 病 機 制 鮮 有 報 道 為 了 為 菜 豆 抗 性 基 因 功 能 的 研 究 以 及 分 子 抗 病 育 種 提 供 相 關(guān) 依 據(jù) 利 用 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 RNA sequencing 技 術(shù) 對 BCMV C54 株 系 侵 染 感 性 及 不 同 抗 性 的 菜 豆 品 種 材 料 進 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 對 所 得 數(shù) 據(jù) 篩 選 差 異 表 達 基 因 并 進 行 Gene Ontology GO Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG 富 集 以 及 進 行 Weighted correla tion network analysis WGCNA 分 析 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 不 同 的 菜 豆 品 種 中 病 毒 的 積 累 量 差 異 表 達 基 因 的 定 位 及 一 些 關(guān) 鍵 通 路 對 病 毒 侵 染 的 響 應(yīng) 存 在 共 性 和 差 異 如 晝 夜 節(jié) 律 光 合 作 用 植 物 病 原 體 的 相 互 作 用 和 一 些 代 謝 途 徑 相 關(guān) 通 路 等 在 接 種 葉 上 Dubbele witte 品 種 DW 對 BCMV 侵 染 易 感 與 Redland s greenleaf C 品 種 RGLC 對 BCMV 侵 染 具 有 抗 性 差 異 表 達 的 基 因 類 型 上 更 為 相 似 定 位 于 光 合 體 系 在 光 合 作 用 光 合 作 用 天 線 蛋 白 以 及 光 合 生 物 中 的 碳 固 定 等 通 路 富 集 而 Sanilac 對 BCMV 侵 染 具 有 抗 性 的 差 異 基 因 沒 有 在 光 合 作 用 等 通 路 富 集 在 系 統(tǒng) 葉 上 2 個 抗 性 品 種 中 的 差 異 表 達 基 因 類 型 也 有 差 異 植 物 被 病 毒 侵 染 后 會 干 擾 植 物 激 素 的 合 成 與 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 通 路 通 過 選 取 8 個 關(guān) 鍵 的 植 物 激 素 合 成 或 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 相 關(guān) 基 因 進 行 驗 證 轉(zhuǎn) 錄 組 和 qPCR 數(shù) 據(jù) 結(jié) 果 表 明 不 同 的 植 物 激 素 合 成 或 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 相 關(guān) 基 因 在 BCMV 侵 染 菜 豆 后 的 表 達 情 況 存 在 差 異 BCMV 侵 染 促 進 了 參 與 水 楊 酸 茉 莉 酸 和 赤 霉 素 合 成 通 路 的 關(guān) 鍵 基 因 的 正 向 調(diào) 控 乙 烯 油 菜 素 內(nèi) 酯 以 及 脫 落 酸 相 關(guān) 的 基 因 在 抗 感 品 種 中 的 表 達 變 化 趨 勢 不 相 同 研 究 結(jié) 果 明 確 了 BCMV 侵 染 不 同 遺 傳 背 景 的 菜 豆 品 種 后 的 轉(zhuǎn) 錄 組 差 異 反 應(yīng) 關(guān) 鍵 詞 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 轉(zhuǎn) 錄 組 WGCNA 菜 豆 中 圖 分 類 號 S436 43 文 獻 標(biāo) 識 碼 A 文 章 編 號 1002 2481 2024 02 0065 13 Transcriptome Analysis of Resistant and Susceptible Common Bean Varieties Infected by Bean Common Mosaic Virus NIU Jingya TANG Muning WANG Xinhua HUO Sifan WU Wenyan LIANG Xingrui HUANG Xinqi WANG Guyue FENG Xue College of Plant Protection Shanxi Agricultural University Taigu 030801 China Abstract Bean Common Mosaic Virus BCMV is widely distributed worldwide and can cause a serious reduction in common bean yields Common bean is the primary host of BCMV and there are significant differences in the response of common beans with different genetic backgrounds to BCMV infection Currently there are few reports on the function of resistant genes in common beans and the pathogenic mechanism of BCMV To provide a data foundation for the study on resistant gene function and molecular disease resistance breeding for common bean varieties in this study RNA sequencing technology was utilized to conduct transcriptional sequencing of common bean varieties with varying levels of susceptibility to BCMV infection C54 strain The obtained data were analyzed to identify differentially expressed genes and further analyses were conducted using gene ontology GO Kyoto encyclopedia of genes and genomes KEGG enrichment and weighted correlation network analysis WGCNA It was observed that there were both commonalities and differences in virus accumulation mapping of differentially expressed genes and responses of key pathways to virus infection such as circadian rhythm photosynthesis plant pathogen interaction and various metabolic pathways in different common bean varieties In the infected leaves the types of differentially expressed genes in Dubbele witte variety DW susceptible and Redland s greenleaf C variety RGLC resistant were more similar to each other mostly localized in photosynthetic systems and enriched in pathways d o i d o i 10 3969 j issn 1002 2481 2024 02 10 收 稿 日 期 2023 05 07 基 金 項 目 山 西 省 回 國 留 學(xué) 人 員 科 研 資 助 項 目 2020 063 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項 目 32202247 山 西 省 自 然 科 學(xué) 基 金 項 目 20210302123367 作 者 簡 介 牛 靜 雅 1996 女 山 西 平 順 人 在 讀 碩 士 研 究 方 向 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 通 信 作 者 馮 雪 1984 女 山 西 晉 中 人 教 授 博 士 主 要 從 事 植 物 病 毒 研 究 工 作 65山 西 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2024 年 第 52 卷 第 2 期 related to photosynthesis photosynthesis antenna protein and carbon fixation in photosynthetic organisms Conversely Sanilac variety resistant differential genes did not exhibit enrichment in photosynthesis or other pathways Additionally in systemic leaves the types of differentially expressed genes were distinct in the two resistant varieties Plant infection by the virus can disrupt plant hormone synthesis and signal transduction pathways Eight key genes involved in plant hormone synthesis or signal transduction were selected for verification in this study Transcriptome and qPCR results revealed differential expression of plant hormone synthesis or signal transduction related genes following BCMV infection BCMV infection led to the upregulation of key genes involved in the synthesis pathways of salicylic acid jasmonic acid and gibberellin The expression patterns of ethylene brassinolide and abscisic acid related genes differed in susceptible varieties This study elucidated the transcriptome s differential response to BCMV infection in common bean varieties with different genetic backgrounds Key words bean common mosaic virus transcriptome WGCNA common bean Phaseolus vulgaris 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 Bean common mosaic virus BCMV 在 自 然 條 件 下 可 侵 染 多 種 豆 科 植 物 菜 豆 Phaseolus vulgaris 是 其 主 要 的 寄 主 BCMV 侵 染 菜 豆 后 可 引 起 花 葉 畸 形 黃 化 生 長 遲 緩 等 癥 狀 嚴 重 時 會 引 起 局 部 或 者 系 統(tǒng) 性 的 壞 死 甚 至 造 成 植 株 死 亡 是 影 響 菜 豆 產(chǎn) 量 和 質(zhì) 量 最 具 危 害 性 的 病 原 之 一 1 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 是 馬 鈴 薯 Y 病 毒 屬 的 成 員 之 一 為 正 單 鏈 RNA 病 毒 全 長 約 為 10 kb 包 含 一 個 開 放 閱 讀 框 編 碼 一 個 多 聚 蛋 白 通 過 蛋 白 酶 切 割 產(chǎn) 生 10 個 具 有 不 同 功 能 的 成 熟 蛋 白 從 5 端 到 3 端 依 次 是 P1 First protein HC Pro Helper component proteinase P3 Third protein 6K1 CI Cylindrical protein 6K2 NIa Nuclear inclusion body a protein 包 含 NIa VPg 和 NIa Pro 等 2 個 蛋 白 NIb Nuclear inclusion body b protein CP Coat protein 此 外 P3 蛋 白 中 核 糖 體 滑 移 產(chǎn) 生 一 個 非 結(jié) 構(gòu) 性 蛋 白 PIPO Pretty interesting potyviridae ORF 2 5 BCMV 的 防 治 主 要 依 靠 抗 病 育 種 菜 豆 針 對 BCMV 的 抗 性 基 因 有 6 個 包 括 顯 性 抗 病 基 因 I 和 隱 形 基 因 bc u d bc 1 bc 2 bc 3 和 bc 4 6 13 根 據(jù) BCMV 分 離 株 在 不 同 遺 傳 背 景 的 菜 豆 鑒 別 寄 主 品 種 上 的 生 物 學(xué) 反 應(yīng) 將 其 分 為 8 個 致 病 型 pathogroup PGs 為 PG I PG VIII 7 14 15 已 有 研 究 表 明 bc 1 和 bc 2 基 因 可 能 不 會 影 響 接 種 葉 中 的 病 毒 復(fù) 制 和 胞 間 移 動 但 它 們 可 能 限 制 病 毒 在 植 物 中 的 遠 距 離 運 輸 從 而 影 響 病 毒 的 系 統(tǒng) 性 移 動 對 于 大 多 數(shù) 分 離 株 2 個 隱 性 基 因 bc 1 和 bc 2 共 同 作 用 的 情 況 下 對 BCMV 分 離 株 的 抗 性 比 單 獨 作 用 bc 1 或 bc 2 產(chǎn) 生 的 抗 性 更 有 效 16 Vps4 AAA ATPase ESCRT 蛋 白 Phvul 011G092700 為 bc 2 候 選 基 因 另 一 個 Vps4 AAA ATPase ESCRT 蛋 白 Phvul 005G125100 被 鑒 定 為 新 的 隱 性 bc 4 基 因 的 候 選 基 因 bc 2 與 緊 密 連 鎖 的 bc 4 或 bc u d 結(jié) 合 后 表 現(xiàn) 出 不 同 的 反 應(yīng) 13 bc 3 基 因 影 響 病 毒 的 翻 譯 本 質(zhì) 為 eIF4E Eukaryotic translation initiation factor 4E 10 bc u d 和 bc 4 的 基 因 功 能 尚 不 明 確 目 前 市 場 上 的 抗 性 品 種 多 攜 帶 1 個 或 多 個 抗 性 基 因 深 入 了 解 菜 豆 對 BCMV 的 抗 病 機 制 可 為 分 子 抗 病 毒 育 種 提 供 有 價 值 的 參 考 植 物 為 了 應(yīng) 對 病 原 物 的 侵 染 發(fā) 展 了 多 種 防 御 機 制 防 御 策 略 包 括 對 與 新 陳 代 謝 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 蛋 白 質(zhì) 修 飾 和 其 他 細 胞 功 能 相 關(guān) 的 各 種 基 因 進 行 差 異 化 調(diào) 控 17 19 其 中 植 物 激 素 及 其 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 網(wǎng) 絡(luò) 占 據(jù) 著 非 常 重 要 的 地 位 對 生 物 脅 迫 的 響 應(yīng) 主 要 是 由 水 楊 酸 SA 茉 莉 酸 JAs 和 乙 烯 ET 等 植 物 激 素 介 導(dǎo) 的 這 些 激 素 誘 導(dǎo) 植 物 的 防 御 反 應(yīng) 20 建 立 植 物 局 部 或 者 系 統(tǒng) 獲 得 抗 性 SAR 主 要 依 賴 于 水 楊 酸 的 積 累 21 而 誘 導(dǎo) 性 系 統(tǒng) 抗 性 ISR 的 發(fā) 展 伴 隨 著 茉 莉 酸 的 積 累 22 有 研 究 通 過 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 技 術(shù) RNA sequencing 和 后 期 的 驗 證 實 驗 揭 示 了 SA 響 應(yīng) 途 徑 參 與 了 菊 花 對 壞 死 營 養(yǎng) 真 菌 鏈 格 孢 菌 防 御 的 響 應(yīng) 23 也 有 報 道 證 實 SA 或 JA 的 施 用 誘 導(dǎo) 了 絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 MAPK3 防 御 基 因 的 表 達 并 增 強 了 番 茄 對 番 茄 黃 卷 葉 病 毒 的 抗 性 24 水 稻 被 水 稻 矮 縮 病 毒 侵 染 后 其 體 內(nèi) 的 赤 霉 素 GA1 的 含 量 變 低 并 且 赤 霉 素 合 成 通 路 中 的 內(nèi) 根 貝 殼 杉 烯 氧 化 酶 ent kaurene oxidase KO 的 表 達 水 平 下 調(diào) GAs 積 累 的 減 少 直 接 導(dǎo) 致 了 GA 調(diào) 節(jié) 細 胞 過 程 的 異 常 功 能 從 而 誘 導(dǎo) 相 關(guān) 癥 狀 的 產(chǎn) 生 25 利 用 ET 信 號 通 路 突 變 體 ein2 ethylene insensitive2 和 etr1 ethylene response 1 進 行 的 相 關(guān) 研 究 表 明 去 除 ET 信 號 可 以 減 弱 SA 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 的 抑 制 并 啟 動 植 物 的 防 御 反 應(yīng) 從 而 使 擬 南 芥 對 花 椰 菜 花 葉 病 毒 侵 染 的 抗 性 增 強 26 據(jù) 報 道 ABA 對 多 種 病 毒 的 侵 染 過 程 均 有 響 應(yīng) 27 29 研 究 發(fā) 現(xiàn) 經(jīng) 蕓 苔 素 內(nèi) 酯 Brassinolide BL 處 理 的 野 生 型 煙 草 對 煙 草 花 葉 病 毒 的 抗 性 增 強 并 且 BL 誘 導(dǎo) 的 抗 性 不 同 于 系 統(tǒng) 獲 得 抗 性 SAR 和 傷 口 誘 導(dǎo) 的 抗 病 性 30 我 們 在 菜 豆 田 間 樣 品 上 分 離 出 了 BCMV 株 66牛 靜 雅 等 抗 感 菜 豆 品 種 對 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 侵 染 后 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 系 命 名 為 C54 GenBank Accession OP828732 該 株 系 可 以 系 統(tǒng) 侵 染 Dubbele witte 簡 稱 DW 菜 豆 品 種 并 產(chǎn) 生 皺 縮 畸 形 黃 化 等 癥 狀 但 是 不 能 系 統(tǒng) 侵 染 Redland s greenleaf C 品 種 簡 稱 RGLC 抗 性 基 因 bc 1 和 Sanilac 品 種 抗 性 基 因 bc 2 bc 4 以 C54 接 種 感 性 和 不 同 抗 性 的 菜 豆 材 料 為 研 究 對 象 對 病 毒 侵 染 植 株 及 對 照 植 株 樣 本 進 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 分 析 明 確 BCMV 侵 染 DW RGLC Sanilac 菜 豆 品 種 后 的 接 種 葉 和 系 統(tǒng) 葉 基 因 在 轉(zhuǎn) 錄 水 平 上 表 達 的 共 性 和 差 異 本 研 究 進 行 了 感 性 及 不 同 抗 性 的 菜 豆 品 種 被 BCMV 侵 染 后 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 旨 在 為 進 一 步 解 析 不 同 菜 豆 品 種 對 BCMV 的 抗 病 機 制 提 供 數(shù) 據(jù) 基 礎(chǔ) 和 理 論 依 據(jù) 1 材 料 和 方 法 1 1 植物栽培和病毒接種 用 于 接 種 的 毒 株 分 離 于 山 西 晉 中 經(jīng) 過 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 測 定 及 病 毒 序 列 擴 增 測 序 確 定 為 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 并 將 其 命 名 為 BCMV C54 在 易 感 品 種 DW 上 進 行 擴 繁 并 保 存 于 實 驗 室 將 菜 豆 易 感 品 種 DW 抗 性 品 種 Sanilac 和 RGLC 種 植 于 人 工 智 能 氣 候 箱 白 天 16 h 30 晚 上 8 h 24 20 000 lx 中 待 菜 豆 長 至 第 1 對 真 葉 完 全 展 開 時 對 其 進 行 病 毒 接 種 接 種 前 在 葉 片 上 撒 0 002 5 mm 金 剛 砂 取 BCMV 染 病 組 織 加 入 磷 酸 緩 沖 鹽 溶 液 1 8 mmol L KH 2 PO 4 8 0 mmol L Na 2 HPO 4 12 H 2 O 137 0 mmol L NaCl 2 7 mmol L KCl 進 行 研 磨 取 研 磨 均 勻 后 的 汁 液 對 2 片 初 生 葉 進 行 摩 擦 接 種 對 照 組 使 用 磷 酸 緩 沖 鹽 溶 液 進 行 處 理 每 組 樣 品 進 行 3 次 獨 立 的 生 物 重 復(fù) 接 種 后 所 有 植 株 安 置 于 26 的 溫 室 白 天 16 h 晚 上 8 h 20 000 lx 培 養(yǎng) 14 d 后 觀 察 植 株 葉 片 癥 狀 采 用 Trizol 試 劑 Biosharp 白 鯊 生 物 公 司 提 取 各 植 株 系 統(tǒng) 葉 片 的 RNA 然 后 使 用 M MLV 4 First Strand cDNA Synthesis Kit 北 京 博 邁 德 基 因 技 術(shù) 有 限 公 司 合 成 第 1 鏈 cDNA 以 cDNA 為 模 板 使 用 BCMV 特 異 性 引 物 表 1 進 行 PCR 擴 增 PCR 反 應(yīng) 程 序 為 95 3 min 95 30 s 56 30 s 72 70 s 共 40 個 循 環(huán) 72 10 min 1 2 樣片采集和測序 接 種 14 d 后 采 集 各 組 接 種 葉 in 和 系 統(tǒng) 葉 s 在 液 氮 中 冷 凍 1 h 后 立 即 放 入 干 冰 箱 中 送 往 公 司 進 行 RNA sequencing 測 序 測 序 委 托 北 京 百 邁 客 生 物 科 技 有 限 公 司 進 行 首 先 進 行 總 RNA 提 取 檢 測 RNA 樣 品 的 純 度 濃 度 和 完 整 性 樣 品 檢 測 合 格 后 進 行 文 庫 構(gòu) 建 主 要 流 程 包 括 用 帶 有 Oligo dT 的 磁 珠 富 集 真 核 生 物 mRNA 加 入 Fragmentation Buffer 將 mRNA 進 行 隨 機 打 斷 以 mRNA 為 模 板 用 六 堿 基 隨 機 引 物 random hexamers 合 成 第 1 條 cDNA 鏈 然 后 加 入 緩 沖 液 dNTPs RNase H 和 DNA polymerase I 合 成 第 2 條 cDNA 鏈 利 用 AM Pure XP beads 純 化 cDNA 純 化 的 雙 鏈 cDNA 再 進 行 末 端 修 復(fù) 加 A 尾 并 連 接 測 序 接 頭 然 后 用 AM Pure XP beads 進 行 片 段 大 小 選 擇 最 后 通 過 PCR 富 集 得 到 cDNA 文 庫 文 庫 構(gòu) 建 完 成 后 使 用 實 時 熒 光 定 量 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) qPCR 方 法 對 文 庫 的 有 效 濃 度 文 庫 有 效 濃 度 2 nmol L 進 行 準(zhǔn) 確 定 量 以 保 證 文 庫 質(zhì) 量 庫 檢 合 格 后 不 同 文 庫 按 照 目 標(biāo) 下 機 數(shù) 據(jù) 量 進 行 pooling 使 用 Illumina 平 臺 進 行 測 序 1 3 比對和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 將 下 機 數(shù) 據(jù) 進 行 過 濾 得 到 Clean Data 與 菜 豆 參 考 基 因 組 Phaseolus vulgaris v2 1 進 行 比 對 得 到 Mapped Data 然 后 進 行 生 物 信 息 分 析 同 時 將 測 序 結(jié) 果 與 BCMV C54 基 因 序 列 進 行 比 對 得 到 病 毒 基 因 在 各 樣 本 中 的 的 比 對 效 率 以 及 各 基 因 比 對 各 樣 本 的 raw counts 數(shù) 目 對 樣 品 中 的 Mapped Reads 的 數(shù) 目 和 轉(zhuǎn) 錄 本 長 度 進 行 歸 一 化 采 用 FPKM Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped 作 為 衡 量 轉(zhuǎn) 錄 本 或 基 因 表 達 水 平 的 指 標(biāo) 基 于 以 下 數(shù) 據(jù) 庫 非 冗 余 蛋 白 質(zhì) 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 Non Redundant Protein Sequence Database NR 含 有 詳 細 注 釋 內(nèi) 容 的 蛋 白 質(zhì) 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 Swiss Prot 基 因 本 體 論 Gene Ontology GO 蛋 白 質(zhì) 家 族 Protein family Pfam 京 都 基 因 與 基 因 組 百 科 全 書 Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge nomes KEGG 直 系 同 源 蛋 白 簇 Cluster of Ortholo gous Groups of proteins COG 等 注 釋 基 因 功 能 1 4 差異表達分析及加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 對 試 驗 中 的 生 物 學(xué) 重 復(fù) 使 用 皮 爾 遜 相 關(guān) 性 系 數(shù) 作 為 評 估 指 標(biāo) r 2 越 接 近 1 說 明 2 個 重 復(fù) 樣 品 相 關(guān) 性 越 強 使 用 BMKCloud 平 臺 的 差 異 表 達 基 因 DEG 分 析 工 具 進 行 分 析 對 于 有 生 物 學(xué) 重 復(fù) 的 樣 本 使 用 DESeq2 進 行 樣 品 組 間 的 差 異 表 達 分 析 獲 得 2 個 生 物 學(xué) 條 件 之 間 的 差 異 表 達 基 因 集 在 差 異 表 達 基 因 檢 測 過 程 中 篩 選 標(biāo) 準(zhǔn) 為 FDR 錯 誤 發(fā) 現(xiàn) 率 0 1 的 全 部 基 因 為 背 景 使 用 北 京 百 邁 客 生 物 科 技 有 限 公 司 云 平 臺 的 WGCNA 67山 西 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2024 年 第 52 卷 第 2 期 分 析 工 具 進 行 加 權(quán) 基 因 共 表 達 網(wǎng) 絡(luò) 分 析 1 5 總 RNA 提取及 qPCR 分析 通 過 菜 豆 或 者 近 緣 物 種 序 列 注 釋 選 取 了 有 代 表 性 的 8 個 植 物 激 素 合 成 以 及 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 相 關(guān) 的 基 因 在 接 種 14 d 時 分 別 對 DW 和 RGLC 病 毒 處 理 組 和 健 康 對 照 組 植 株 的 系 統(tǒng) 葉 片 取 樣 每 組 樣 品 進 行 3 次 獨 立 的 生 物 重 復(fù) 將 上 述 采 集 的 樣 品 在 液 氮 中 研 磨 并 使 用 Trizol 試 劑 Biosharp 白 鯊 生 物 公 司 提 取 總 RNA 然 后 使 用 HiScript All in one RT SuperMix Perfect for qPCR Vazyme Biotech Co Ltd 合 成 第 1 鏈 cDNA 使 用 ChamQ Univer sal SYBR qPCR Master Mix Vazyme Biotech Co Ltd 在 QuantStudio 平 臺 進 行 植 物 激 素 相 關(guān) 基 因 的 實 時 熒 光 定 量 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) qRT PCR PCR 擴 增 參 數(shù) 如 下 95 3 min 95 10 s 和 60 15 s 共 40 個 循 環(huán) 使 用 IDT PrimerQuest Tool 進 行 引 物 設(shè) 計 引 物 序 列 見 表 1 菜 豆 基 因 Actin 作 為 內(nèi) 參 基 因 用 來 歸 一 化 基 因 表 達 每 個 反 應(yīng) 進 行 3 次 技 術(shù) 重 復(fù) 選 擇 基 因 的 相 對 表 達 水 平 以 2 Ct 法 進 行 計 算 并 且 以 平 均 值 表 示 誤 差 線 表 示 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 BCMV 侵染菜豆的鑒定 在 菜 豆 上 用 機 械 摩 擦 接 種 的 方 法 接 種 了 BCMV C54 14 d 后 觀 察 病 毒 侵 染 癥 狀 如 圖 1 A 所 示 BCMV C54 侵 染 DW 后 的 葉 片 表 現(xiàn) 為 花 葉 和 黃 化 表 1 qPCR 所用引物核苷酸序列 Tab 1 Nucleotide sequences of primers for qPCR 基 因 ID Gene ID Phvul 004G164800 Phvul 008G289500 Phvul 003 G109100 Phvul 003 G010700 Phvul 011G216400 Phvul 003 G291800 Phvul 005G183600 Phvul 004G094100 Phvul 011G064500 注 釋 Annotation Peroxisomal fatty acid oxidation multifunctional protein AIM1 OS Arabidopsis thaliana AIM1 Phenylalanine ammonia lyase class 3 OS Phaseolus vulgaris PAL Pathogenesis related protein 1 OS Phaseolus vulgaris PR1 Allene oxide synthase 1 chloroplastic OS Solanum lycopersicum AOS Ethylene receptor OS Malus domestica ETR1 ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5 like protein 7 OS Arabidopsis thaliana ABF4 Ent kaurene oxidase OS Salvia miltiorrhiza KO Steroid 5 alpha reductase DET2 OS Solanum lycopersicum DET2 Actin OS Gossypium hirsutum OX 3635 PE 3 SV 1 Actin 引 物 5 3 Primer 5 3 Forward CTTTGCTCAGCGGGCTATAA Reverse CCATTAGACCTCCTCCAACAAC Forward CTATCACCAAACTCCTCAACCA Reverse GCAATGTAGGACAGAGGAATCA Forward CCCAAAGGCTCTTCCTGATT Reverse GTCTCTCCATCCTCAACGAAAG Forward CTCTCTTCAGCCATGTCATCTT Reverse GTAGTTGTGGCGGTCGATTAT Forward CTCTTGTTGAGCTGGGTAGAAC Reverse TGCTGTCGCAATGTGTAAGA Forward AACAGTGGATGAGGTTTGGAG Reverse GTTGGTTGCCTTTGAGGAATG Forward GCAAGGTCTGGGACGTAATATAG Reverse CAATGGCTCCCTCCATCATATC Forward AACACTGCTTACACACCTAACA Reverse GCCAGTGACACGAGACTTATC Forward GAAGTTCTCTTC CAACCATCC Reverse TTTCCTTGCTCATTCT GTCCG A BCMV 侵 染 感 性 品 種 DW RGLC 和 Sanilac 的 癥 狀 圖 以 及 健 康 植 株 B RT PCR 方 法 檢 測 BCMV A Symptoms of BCMV infected susceptible varieties DW RGLC Sanilac and healthy plants B BCMV detection by RT PCR 圖 1 BCMV 侵染菜豆的癥狀圖及 RT PCR 檢測 Fig 1 Symptom and RT PCR detection of BCMV infected common bean 68牛 靜 雅 等 抗 感 菜 豆 品 種 對 菜 豆 普 通 花 葉 病 毒 侵 染 后 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 在 菜 豆 未 摩 擦 接 種 的 上 部 葉 片 中 采 用 RT PCR 方 法 分 析 驗 證 了 病 毒 的 積 累 量 如 圖 1 B 可 知 在 C54 侵 染 DW 的 葉 片 組 織 中 獲 得 了 相 應(yīng) 的 特 異 性 擴 增 條 帶 而 在 C54 侵 染 Sanilac 和 RGLC 的 葉 片 組 織 中 沒 有 獲 得 特 異 性 擴 增 條 帶 說 明 BCMV 成 功 侵 染 感 性 品 種 DW 但 不 能 侵 染 Sanilac 和 RGLC 可 以 進 行 下 一 步 的 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 2 2 比對信息統(tǒng)計 為 了 研 究 感 性 以 及 不 同 抗 性 的 菜 豆 與 BCMV 之 間 的 互 作 機 制 進 行 了 RNA sequencing 測 序 共 完 成 36 個 樣 品 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 各 樣 品 Clean Data 均 達 到 5 94 Gb Q30 堿 基 百 分 比 在 92 68 及 以 上 表 明 數(shù) 據(jù) 質(zhì) 量 高 可 用 于 后 續(xù) 試 驗 數(shù) 據(jù) 分 析 將 過 濾 后 的 reads 與 菜 豆 的 參 考 基 因 組 Phaseolus vulgaris v2 1 進 行 比 對 總 體 比 對 的 百 分 比 為 76 90 95 59 唯 一 位 置 比 對 的 百 分 比 為73 33 89 75 有 2 79 8 66 的 reads 比 對 到 參 考 基 因 組 多 處 位 置 表 2 2 3 病毒比對率分析 通 過 統(tǒng) 計 比 對 到 病 毒 基 因 組 的 reads 數(shù) 占 樣 品 總 reads 數(shù) 的 比 例 得 到 BCMV C54 在 各 樣 本 中 的 積 累 量 表 2 其 中 感 性 品 種 的 接 種 葉 樣 本 中 的 病 毒 積 累 量 分 別 為 40 64 44 64 和 33 01 而 系 統(tǒng) 葉 中 的 病 毒 積 累 量 整 體 高 于 接 種 葉 均 為 50 以 上 Sanilac 與 RGLC 處 理 組 接 種 葉 和 系 統(tǒng) 葉 上 的 病 毒 積 累 量 有 明 顯 下 降 為 0 03 8 84 RGLC 處 理 組 接 種 葉 的 平 均 病 毒 比 對 率 高 于 Sanilac 處 理 組 接 種 葉 說 明 RGLC 的 接 種 葉 病 毒 積 累 量 高 于 Sanilac 在 系 統(tǒng) 葉 中 大 多 數(shù) 的 病 毒 處 理 過 的 RGLC 和 Sanilac 樣 本 中 的 病 毒 積 累