病毒學(xué)報(bào) Chinese Journal of Virology ISSN 1000 8721 CN 11 1865 R 病毒學(xué)報(bào) 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)論文 題目 侵染貴州番茄的辣椒褪綠病毒分子鑒定與分析 作者 田雨 李淳 吳石平 黃露 安星宇 王莉爽 DOI 10 13242 ki bingduxuebao 004472 收稿日期 2023 10 28 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期 2024 03 15 引用格式 田雨 李淳 吳石平 黃露 安星宇 王莉爽 侵染貴州番茄的辣椒褪綠病 毒分子鑒定與分析 J OL 病毒學(xué)報(bào) https doi org 10 13242 ki bingduxuebao 004472 網(wǎng)絡(luò)首發(fā) 在編輯部工作流程中 稿件從錄用到出版要經(jīng)歷錄用定稿 排版定稿 整期匯編定稿等階 段 錄用定稿指內(nèi)容已經(jīng)確定 且通過(guò)同行評(píng)議 主編終審?fù)饪玫母寮?排版定稿指錄用定稿按照期 刊特定版式 包括網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)版式 排版后的稿件 可暫不確定出版年 卷 期和頁(yè)碼 整期匯編定稿指出 版年 卷 期 頁(yè)碼均已確定的印刷或數(shù)字出版的整期匯編稿件 錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)稿件內(nèi)容必須符合 出 版管理?xiàng)l例 和 期刊出版管理規(guī)定 的有關(guān)規(guī)定 學(xué)術(shù)研究成果具有創(chuàng)新性 科學(xué)性和先進(jìn)性 符合編 輯部對(duì)刊文的錄用要求 不存在學(xué)術(shù)不端行為及其他侵權(quán)行為 稿件內(nèi)容應(yīng)基本符合國(guó)家有關(guān)書刊編輯 出版的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 正確使用和統(tǒng)一規(guī)范語(yǔ)言文字 符號(hào) 數(shù)字 外文字母 法定計(jì)量單位及地圖標(biāo)注等 為確保錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)的嚴(yán)肅性 錄用定稿一經(jīng)發(fā)布 不得修改論文題目 作者 機(jī)構(gòu)名稱和學(xué)術(shù)內(nèi)容 只可基于編輯規(guī)范進(jìn)行少量文字的修改 出版確認(rèn) 紙質(zhì)期刊編輯部通過(guò)與 中國(guó)學(xué)術(shù)期刊 光盤版 電子雜志社有限公司簽約 在 中國(guó) 學(xué)術(shù)期刊 網(wǎng)絡(luò)版 出版?zhèn)鞑テ脚_(tái)上創(chuàng)辦與紙質(zhì)期刊內(nèi)容一致的網(wǎng)絡(luò)版 以單篇或整期出版形式 在印刷 出版之前刊發(fā)論文的錄用定稿 排版定稿 整期匯編定稿 因?yàn)?中國(guó)學(xué)術(shù)期刊 網(wǎng)絡(luò)版 是國(guó)家新聞出 版廣電總局批準(zhǔn)的網(wǎng)絡(luò)連續(xù)型出版物 ISSN 2096 4188 CN 11 6037 Z 所以簽約期刊的網(wǎng)絡(luò)版上網(wǎng)絡(luò)首 發(fā)論文視為正式出版 第40卷 第 2 期 2024 年3月 病 毒 學(xué) 報(bào) CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY Vol 40 No 2 March 2024 侵染貴州番茄的辣椒褪綠病毒分子鑒定與 分析 田雨 1 2 李淳 2 吳石平 2 黃露 2 安星宇 2 王莉爽 2 1 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究員院 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550025 2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 貴陽(yáng) 550006 摘要 辣椒褪綠病毒 Capiscum chlorosis virus CaCV 是正番茄斑萎病毒屬 Orthotospovirus 的重要成員 能夠侵染 辣椒 番茄等作物并造成嚴(yán)重危害 為明確貴州番茄CaCV分離物基因組分子結(jié)構(gòu)特征及其進(jìn)化起源 本研究通過(guò) RT PCR技術(shù)擴(kuò)增和測(cè)定了CaCV的N NSs和NSm基因的全長(zhǎng)片段 分別獲得長(zhǎng)度約828bp 1320bp和927bp的目 標(biāo)條帶 經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建等方法進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn) 貴州番茄CaCV分離物的N NSs和NSm基 因與CaCV其他分離物核苷酸的相似性分別在85 5 99 4 82 7 98 9 和83 1 98 7 之間 根據(jù)系統(tǒng) 發(fā)育樹結(jié)果 貴州番茄CaCV分離物N基因和NSs基因與中國(guó)云南分離物的親緣關(guān)系較近 NSm基因與中國(guó)海南 和廣州分離物的親緣關(guān)系近 推測(cè)貴州CaCV可能是由于番茄 辣椒的品種引進(jìn) 及薊馬帶毒傳播進(jìn)入 這是貴州 省CaCV侵染番茄的首次報(bào)道 對(duì)監(jiān)測(cè)CaCV在我國(guó)的擴(kuò)散具有重要意義 關(guān)鍵詞 番茄 辣椒褪綠病毒 病毒鑒定 序列分析 中圖分類號(hào) S436 412 1 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000 8721 2024 02 0402 10 辣 椒 褪 綠 病 毒 Capiscum chlorosis virus CaCV 是布尼亞病毒目 Bunyaviruses 番茄斑萎病 毒 科 Tospoviridae 正 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 Orthotospovirus 的重要成員之一 1 2 1999年 在 澳大利亞首次報(bào)道CaCV侵染番茄和辣椒 3 隨后 在中國(guó) 4 7 伊朗 8 印度 9 泰國(guó) 10 希臘 11 和美國(guó) 12 等國(guó)家均有發(fā)生為害的報(bào)道 CaCV對(duì)辣椒 番茄 和西葫蘆等蔬菜作物的危害較大 一些經(jīng)濟(jì)作物 觀 賞植物和雜草也是該病毒的自然寄主 如 菠蘿 苦 杏仁 百合 馬蹄蓮 蠟花 勝紅薊 一點(diǎn)紅 苦苣菜 印加孔雀草等 13 15 目前已報(bào)道能傳播CaCV病毒 的薊馬主要有 煙薊馬 Thrips tabaci Lindeman 棕 櫚 薊 馬 Thrips palmi Karny 和 蘇 花 薊 馬 Frankliniella schultzei 16 此外 Sun 等人 17 在 2022年報(bào)道線蟲也可傳播CaCV病毒 CaCV具有三個(gè)單鏈 ss RNA片段組成的負(fù)義 或雙義基因組 分別命名為小 S 中 M 和大 L S RNA和M RNA 均為雙義RNA 有2個(gè)ORF S RNA大小約3kb 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 Nonstructural protein NSs 和核衣殼蛋白 Nucleocapsid protein N M RNA大小約5kb 編碼非結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)蛋白 Nonstructural movement protein NSm 和糖蛋白前 體 Glycoprotein precursor GP L RNA為負(fù)鏈 含 單個(gè)開放閱讀框架 ORF 大小約9kb 編碼 RNA 依 賴 性 RNA 聚 合 酶 RNA dependent RNA polymerase 簡(jiǎn)稱L蛋白 18 21 目前 克隆分析番茄 斑萎病毒屬的多基因片段 能豐富病毒的遺傳多樣 性 為今后CaCV抗病育種提供指導(dǎo) 22 2021年在貴州省關(guān)嶺縣斷橋鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)番茄葉片 和果實(shí)有褪綠 斑點(diǎn)等疑似病毒病的癥狀 影響了番 茄的品質(zhì) 因此 本研究對(duì)疑似病毒病樣品進(jìn)行田 間癥狀觀察 RT PCR擴(kuò)增 序列測(cè)定 明確毒源為 CaCV 基于CaCV的N NSs和NSm構(gòu)建了國(guó)內(nèi) 外不同地區(qū)不同寄主的CaCV分離物系統(tǒng)發(fā)育樹 分析貴州番茄分離物CaCV其他地區(qū)分離物的系統(tǒng) 進(jìn)化關(guān)系 為闡明CaCV的遺傳機(jī)制提供理論依據(jù) 并為貴州番茄辣椒褪綠病毒的科學(xué)防控提供依據(jù) 材料與方法 1 試驗(yàn)材料 2021年秋季在貴州關(guān)嶺采集褪綠 斑駁 斑點(diǎn) 收稿日期 2023 10 28 接受日期 2024 02 01 基金項(xiàng)目 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培育項(xiàng)目 項(xiàng)目號(hào) 黔農(nóng) 科院青年科技基金 2020 01號(hào) 題目 貴州蔬菜番茄斑萎病毒屬病 毒的發(fā)生動(dòng)態(tài)及防控技術(shù)研究 貴州省科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng) 資金 項(xiàng)目號(hào) 黔科合服企 2023 011 題目 農(nóng)業(yè)入侵物種綠色防 控創(chuàng)新能力建設(shè) 作者簡(jiǎn)介 田雨 1998 女 主要從事植物保護(hù)研究 Email 1294955729 通訊作者 王莉爽 1985 女 副研究員 主要從事植物病害 防治工作 Email wwllss520 開放科學(xué) OSID DOI 10 13242 ki bingduxuebao 004472 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間 2024 03 15 21 46 13 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 2 期 田 雨 等 侵 染 貴 州 番 茄 的 辣 椒 褪 綠 病 毒 分 子 鑒 定 與 分 析 和 環(huán) 斑 等 典 型 病 毒 病 癥 狀 的 番 茄 葉 片 在 田 間 采 集 樣 品 放 入 泡 沫 冰 盒 在 實(shí) 驗(yàn) 室 進(jìn) 行 拍 照 分 裝 處 理 后 置 于 80 冰 箱 備 用 以 C aC V 侵 染 發(fā) 病 的 番 茄 植 株 葉 片 作 為 陽(yáng) 性 對(duì) 照 以 未 發(fā) 病 的 健 康 番 茄 植 株 葉 片 作 為 陰 性 對(duì) 照 2 試 驗(yàn) 方 法 2 1 番 茄 植 物 總 R N A 的 提 取 及 c D N A 合 成 采 用 U niversal T otal R N A K it 通 用 總 R N A 提 取 試 劑 盒 北 京 全 式 金 生 物 技 術(shù) 股 份 有 限 公 司 R 013 50 提 取 番 茄 植 物 總 R N A 具 體 操 作 步 驟 如 下 將 植 物 組 織 在 液 氮 中 磨 碎 每 50 100m g 植 物 組 織 加 1m L 裂 解 液 R L 渦 旋 15s 將 勻 漿 樣 品 在 室 溫 下 放 置 5m in 12000r m in 離 心 5m in 轉(zhuǎn) 移 上 清 液 至 新 的 離 心 管 中 向 上 清 液 中 加 入 等 體 積 的 無(wú) 水 乙 醇 混 勻 此 時(shí) 可 能 會(huì) 出 現(xiàn) 沉 淀 將 溶 液 和 沉 淀 一 起 轉(zhuǎn) 入 R N A 吸 附 柱 中 12000r m in 離 心 1m in 棄 廢 液 向 吸 附 柱 內(nèi) 加 入 500 L 去 蛋 白 液 R E 12000r m in 離 心 1m in 棄 收 集 管 中 廢 液 向 吸 附 柱 內(nèi) 加 入 500 L 去 漂 洗 液 R W 12000r m in 離 心 1m in 棄 收 集 管 中 廢 液 重 復(fù) 步 驟 一 次 將 R N A 吸 附 柱 放 回 空 收 集 管 中 12000r m in 離 心 2m in 將 離 心 吸 附 柱 置 于 一 個(gè) 新 的 1 5m L 離 心 管 中 加 入 60 L 的 R N ase free ddH 2 O 洗 脫 室 溫 放 置 2m in 12000r m in 離 心 1m in 離 心 管 溶 液 即 R N A 將 R N A 置 于 80 保 存 R N A 用 G oldenstar T M R T 6 cD N A S ynthesis K it 北 京 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 T S K 301S 進(jìn) 行 cD N A 反 轉(zhuǎn) 錄 具 體 操 作 步 驟 如 下 5 G oldenstar T M R eaction B uffer 4 L G oldenstar T M R T 6 200U L 1 L R andom er 50 m ol L 1 L dN T P M ix 10m m ol L 1 L D T T 1 L R N ase free W ater 8 L T otal R N A 4 L 總 體 積 為 20 L 輕 輕 混 勻 后 25 孵 育 10 m in 42 孵 育 30 m in 85 加 熱 5m in 產(chǎn) 物 置 于 20 保 存 2 2 C a C V 引 物 合 成 根 據(jù) 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 及 N C B I 上 的 序 列 合 成 引 物 用 于 擴(kuò) 增 出 包 含 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 通 用 引 物 dtospo 以 及 C aC V N N S s 和 N S m 基 因 的 目 的 片 段 引 物 序 列 由 重 慶 擎 科 興 業(yè) 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 合 成 引 物 序 列 見(jiàn) 表 1 2 3 R T P C R 擴(kuò) 增 及 克 隆 以 cD N A 為 模 板 用 2 H ieff P C R M aster M ix W ith D ye 上 海 翌 圣 生 物 科 技 有 限 公 司 10102E S 03 進(jìn) 行 R T P C R 擴(kuò) 增 反 應(yīng) 體 系 如 下 T em plate 2 L 2 H ieff P C R M aster M ix 25 L F orw ard P rim er 10 m ol L 2 L R everse P rim er 10 m ol L 2 L N uclease free W ater 19 L 總 體 積 50 L 反 應(yīng) 程 序 預(yù) 變 性 94 5 m in 變 性 94 30 s 退 火 53 30 s 延 伸 72 30 s 35 個(gè) 循 環(huán) 72 最 終 延 伸 510 m in 反 應(yīng) 結(jié) 束 后 用 1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 驗(yàn) R T P C R 擴(kuò) 增 結(jié) 果 將 P C R 產(chǎn) 物 回 收 目 的 片 段 與 T 載 體 連 接 后 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 D H 5 挑 取 陽(yáng) 性 克 隆 送 至 重 慶 擎 科 興 業(yè) 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 進(jìn) 行 雙 向 測(cè) 序 2 4 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 測(cè) 序 結(jié) 果 利 用 N C B I B L A S T https blast ncbi nlm nih gov B last cgi 進(jìn) 行 序 列 比 對(duì) 從 3 個(gè) C aC V 分 離 物 測(cè) 序 結(jié) 果 中 挑 選 基 因 序 列 N O R 334399 O R 345476 O R 334398 N S s O R 334403 O R 334405 O R 334404 N S m O R 334401 O R 334402 O R 334400 與 已 報(bào) 道 的 不 同 國(guó) 家 不 同 寄 主 的 分 離 物 相 關(guān) 基 因 用 D N A M A N 表 1 辣 椒 褪 綠 病 毒 不 同 基 因 引 物 序 列 表 T able 1 S equences of prim ers of different genes of capsicum chlorosis virus P rim er nam e dT ospo F 2 dT ospo R 2 C aC V N F C aC V N R C aC V N S s F C aC V N S s R C aC V N S m F C aC V N S m R S equence5 3 G A T C A A T C N A A R T G G T C D G C W T C C A T D G C A C A A G A R T G R T A V A C W G A A T G T A C A A C T A T T T A A A T T A C A C C T C A G A C G T T T C C A T A G T A A A C A C C A T G T C T A C T G T G A A G A G T G C T T A T T G G A G C T C C A C A G T G A A T G T C T C G C T T T T C T A A C G T T T T C A T G A A A T T T C A A G T A A G T T A T C F ragm ent size bp 300bp 828bp 1320bp 927bp A nnealing tem perature 52 52 52 52 source 23 D esign according to N C B I existing sequences 403 病 毒 學(xué) 報(bào) 40 卷 6 0 和 B ioE dit進(jìn) 行 分 析 整 理 利 用 M E G A 7 0 及 鄰 近 算 法 N J N eighbor joining 對(duì) 貴 州 不 同 辣 椒 T S W V 分 離 物 進(jìn) 行 序 列 相 似 性 分 析 和 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 構(gòu) 建 結(jié) 果 1 病 毒 危 害 番 茄 的 田 間 癥 狀 感 病 的 番 茄 葉 片 和 果 實(shí) 表 現(xiàn) 出 多 種 癥 狀 果 實(shí) 出 現(xiàn) 圓 形 環(huán) 斑 有 褐 色 斑 塊 圖 1A 果 實(shí) 出 現(xiàn) 深 綠 色 線 條 紋 狀 深 綠 和 淺 綠 相 間 不 均 圖 1B 葉 片 出 現(xiàn) 黃 褐 色 小 點(diǎn) 圖 1C 葉 片 沿 葉 脈 褪 綠 花 葉 圖 1D 此 外 感 染 病 毒 的 番 茄 植 株 生 長(zhǎng) 緩 慢 個(gè) 別 出 現(xiàn) 矮 化 現(xiàn) 象 2 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 鑒 定 利 用 檢 測(cè) 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 屬 病 毒 的 通 用 引 物 dT ospo F 2 dT ospo R 2 對(duì) 采 集 的 40 份 疑 似 病 毒 病 樣 進(jìn) 行 R T P C R 檢 測(cè) 結(jié) 果 從 15 份 疑 似 病 樣 中 均 擴(kuò) 增 到 1 條 與 目 的 片 段 大 小 300bp 一 致 的 特 異 性 條 帶 陰 性 對(duì) 照 中 未 擴(kuò) 增 出 任 何 片 段 圖 2 表 明 貴 州 番 茄 病 樣 中 存 在 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 病 毒 3 辣 椒 褪 綠 病 毒 分 子 鑒 定 為 進(jìn) 一 步 驗(yàn) 證 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 通 用 引 物 檢 測(cè) 結(jié) 果 的 可 靠 性 根 據(jù) 已 報(bào) 道 的 C aC V 序 列 F J947156 K X 108864 設(shè) 計(jì) N N S s 和 N S m 基 因 的 全 長(zhǎng) 片 段 圖 1 疑 似 感 染 辣 椒 褪 綠 病 毒 的 番 茄 葉 片 和 果 實(shí) 田 間 癥 狀 F igure 1 F ield sym ptom s of tom ato leaves and fruits suspected to be infected by C apiscum chlorosis virus C aC V 圖 2 番 茄 通 用 引 物 d t o s p o 的 R T P C R 鑒 定 結(jié) 果 注 M D L 2000 m arker P 陽(yáng) 性 對(duì) 照 N 陰 性 對(duì) 照 泳 道 1 15 檢 測(cè) 樣 品 F igure 2 R T P C R identification results of a universal prim er dtospo of tom atoes N otes M D L 2000 m arker P P ositive control N N egative control L anes 1 15 T est sam ples 404 2 期 田 雨 等 侵 染 貴 州 番 茄 的 辣 椒 褪 綠 病 毒 分 子 鑒 定 與 分 析 陽(yáng) 性 樣 品 經(jīng) R T P C R 檢 測(cè) 結(jié) 果 圖 3 5 表 明 病 株 樣 品 可 擴(kuò) 增 出 長(zhǎng) 度 約 828 bp 的 N 基 因 927 bp 的 N S m 基 因 和 1320 bp N S s 基 因 而 健 康 樣 品 無(wú) 目 標(biāo) 條 帶 結(jié) 果 表 明 侵 染 貴 州 番 茄 的 番 茄 斑 萎 屬 病 毒 主 要 為 C aC V 4 不 同 來(lái) 源 C a C V 分 離 物 與 貴 州 分 離 物 序 列 分 析 將 貴 州 關(guān) 嶺 采 集 的 番 茄 樣 本 經(jīng) 測(cè) 序 后 選 取 3 個(gè) 不 同 植 株 的 樣 本 擴(kuò) 增 出 C aC V 的 N N S s 和 N S m 基 因 的 全 長(zhǎng) 片 段 上 傳 到 N C B I N 基 因 登 錄 號(hào) 分 別 為 O R 334398 O R 334399 和 O R 345476 N S s 基 因 登 錄 號(hào) 分 別 為 O R 334403 O R 334404 和 O R 334405 N S m 基 因 登 錄 號(hào) 分 別 為 O R 334400 O R 334401 和 O R 334402 選 取 已 報(bào) 道 的 國(guó) 內(nèi) 外 不 同 寄 主 和 不 同 地 理 來(lái) 源 的 C aC V 分 離 物 與 貴 州 番 茄 分 離 物 進(jìn) 行 同 源 性 比 較 以 同 屬 不 同 種 的 番 茄 環(huán) 紋 斑 點(diǎn) 病 毒 T om ato zonate spot virus T ZS V M Z404609 M Z404610 作 為 外 緣 序 列 結(jié) 果 表 明 N 基 因 與 已 報(bào) 道 的 C aC V 各 分 離 物 N 基 因 核 苷 酸 的 相 似 性 在 85 5 99 4 氨 基 酸 的 相 似 性 在 92 4 100 0 表 2 貴 州 C aC V 番 茄 分 離 物 N S s 基 因 與 C aC V 各 分 離 物 核 苷 酸 相 似 性 在 82 7 98 9 之 間 氨 基 酸 的 相 似 性 在 86 3 98 9 表 3 N S m 基 因 與 C aC V 各 分 離 物 核 苷 酸 相 似 性 在 83 1 98 7 之 間 氨 基 酸 的 相 似 性 在 89 9 99 0 表 4 基 于 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 N 基 因 核 苷 酸 序 列 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 結(jié) 果 表 明 圖 4 17 條 不 同 地 理 來(lái) 源 不 同 C aC V 分 離 物 聚 為 五 支 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 與 云 南 中 國(guó) 臺(tái) 灣 荷 蘭 以 及 泰 國(guó) C aC V 分 離 物 F J947156 F J947157 聚 為 一 支 group 印 度 和 澳 大 利 亞 C aC V 分 離 物 聚 為 一 支 group 湖 北 和 泰 國(guó) C aC V 分 離 物 D Q 256123 N C 008301 聚 為 一 支 group 海 南 和 廣 東 C aC V 分 離 物 聚 為 一 支 group 伊 朗 C aC V 分 離 物 單 獨(dú) 聚 為 一 支 group 其 中 貴 州 番 茄 3 條 C aC V 分 離 物 與 云 南 C aC V 圖 3 番 茄 C a C V N C a C V N S s C a C V N S m 的 R T P C R 鑒 定 結(jié) 果 注 M D L 2000 m arker P 陽(yáng) 性 對(duì) 照 N 陰 性 對(duì) 照 泳 道 1 15 檢 測(cè) 樣 品 F igure 3 R T P C R identification results of N N S s and N S m of C aC V in tom atoes N otes M D L 2000 m arker P P ositive control N N egative control L anes 1 15 T est sam ples 405 病 毒 學(xué) 報(bào) 40 卷 分 離 物 K Y 994103 單 獨(dú) 形 成 一 個(gè) 獨(dú) 立 的 分 支 表 明 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 與 云 南 的 親 緣 關(guān) 系 較 近 基 于 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 N S s 基 因 核 苷 酸 序 列 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 結(jié) 果 表 明 圖 5 28 條 不 同 地 理 來(lái) 源 不 同 的 C aC V 分 離 物 聚 為 五 支 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 與 云 南 中 國(guó) 臺(tái) 灣 荷 蘭 印 度 F I011449 以 及 泰 國(guó) C aC V 分 離 物 F J947156 F J947157 E F 602030 E F 488164 E F 990562 聚 為 一 支 group 印 度 C aC V 分 離 物 M N 707997 M N 708000 M N 707995 M N 707996 M N 707998 M N 707999 聚 為 一 支 group 海 南 和 廣 東 C aC V 分 離 物 聚 為 一 支 group 伊 朗 湖 北 和 廣 東 C aC V 分 離 物 聚 為 一 支 group 湖 北 和 泰 國(guó) C aC V 分 離 物 D Q 256123 N C 008301 聚 為 一 支 group 結(jié) 果 表 明 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 與 泰 國(guó) 云 南 荷 蘭 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 近 進(jìn) 一 步 推 測(cè) 侵 染 貴 州 番 茄 的 C aC V 分 離 物 可 能 是 從 云 南 等 地 引 進(jìn) 番 茄 或 辣 椒 種 苗 及 薊 馬 帶 毒 進(jìn) 入 貴 州 地 區(qū) 基 于 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 N S m 基 因 核 苷 酸 序 列 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 結(jié) 果 表 明 圖 6 21 條 不 同 地 表 2 N 基 因 序 列 一 致 性 T able 2 S equence consistency of the N gene 注 在 M egA lign 中 使 用 C lustalW 方 法 計(jì) 算 基 因 在 核 苷 酸 左 下 和 氨 基 酸 右 上 水 平 上 的 序 列 一 致 性 N otes T he C lustalW m ethod w as used in M egA lign to calculate the sequence consistency of genes at nucleotide bottom left and am ino acid top right levels 表 3 N S s 基 因 序 列 一 致 性 T able 3 S equence consistency of the N S s gene 注 在 M egA lign 中 使 用 C lustalW 方 法 計(jì) 算 基 因 在 核 苷 酸 左 下 和 氨 基 酸 右 上 水 平 上 的 序 列 一 致 性 N otes T he C lustalW m ethod w as used in M egA lign to calculate the sequence consistency of genes at nucleotide bottom left and am ino acid top right levels 406 2 期 田 雨 等 侵 染 貴 州 番 茄 的 辣 椒 褪 綠 病 毒 分 子 鑒 定 與 分 析 理 來(lái) 源 不 同 的 C aC V 分 離 物 聚 為 五 支 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 與 澳 大 利 亞 海 南 廣 東 和 中 國(guó) 臺(tái) 灣 聚 為 一 支 group 印 度 C aC V 分 離 物 K X 499515 M N 707975 M N 707978 聚 為 一 支 group 荷 蘭 云 南 泰 國(guó) K X 108864 以 及 印 度 C aC V 分 離 物 M N 707979 F J011450 聚 為 一 支 group 伊 朗 C aC V 分 離 物 單 獨(dú) 聚 為 一 支 group 泰 國(guó) C aC V 分 離 物 D Q 256125 N C 008303 聚 為 一 支 group 結(jié) 果 表 明 貴 州 分 離 物 與 海 南 廣 州 澳 大 利 亞 和 中 國(guó) 臺(tái) 灣 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 較 近 與 地 區(qū) 來(lái) 源 和 寄 主 作 物 存 在 一 定 的 差 異 討 論 本 研 究 用 O rthotospovirus 通 用 引 物 及 C aC V 特 異 引 物 對(duì) 2021 年 采 自 貴 州 省 關(guān) 嶺 縣 表 現(xiàn) 出 斑 駁 褪 表 4 N S m 基 因 序 列 一 致 性 T able 4 S equence consistency of the N S m gene 注 在 M egA lign 中 使 用 C lustalW 方 法 計(jì) 算 基 因 在 核 苷 酸 左 下 和 氨 基 酸 右 上 水 平 上 的 序 列 一 致 性 N otes T he C lustalW m ethod w as used in M egA lign to calculate the sequence consistency of genes at nucleotide bottom left and am ino acid top right levels 圖 4 基 于 N 基 因 序 列 構(gòu) 建 辣 椒 褪 綠 病 毒 不 同 分 離 物 的 進(jìn) 化 樹 F igure 4 C onstruction of evolutionary trees of different isolates of pepper chlorosis virus based on N gene sequences 407 病 毒 學(xué) 報(bào) 40 卷 綠 癥 狀 的 番 茄 葉 片 和 果 實(shí) 進(jìn) 行 了 R T P C R 檢 測(cè) 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 有 15 份 樣 品 檢 測(cè) 到 了 C aC V 因 侵 染 番 茄 的 病 毒 病 種 類 較 多 采 集 樣 品 僅 對(duì) 正 番 茄 斑 萎 病 毒 屬 進(jìn) 行 檢 測(cè) C aC V 檢 出 率 為 37 5 這 些 樣 品 中 可 能 還 存 在 其 他 病 毒 但 有 待 進(jìn) 一 步 的 驗(yàn) 證 本 研 究 克 隆 了 3 個(gè) 樣 品 C aC V 的 N N S s 和 N S m 基 因 的 全 長(zhǎng) 片 段 經(jīng) 測(cè) 序 鑒 定 其 大 小 分 別 為 828bp 1320bp 和 927bp 序 列 比 對(duì) 結(jié) 果 表 明 3 個(gè) C aC V 貴 州 分 離 物 與 我 國(guó) 其 他 地 區(qū) 及 泰 國(guó) 印 度 澳 大 利 亞 伊 朗 等 國(guó) 家 的 不 同 寄 主 的 C aC V 分 離 物 的 核 苷 酸 相 似 性 均 較 高 說(shuō) 明 侵 染 危 害 我 國(guó) 番 茄 的 C aC V 分 離 物 在 基 因 序 列 上 的 差 異 不 大 基 于 C aC V 分 離 物 N N S s 和 N S m 基 因 建 立 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 進(jìn) 化 樹 可 知 貴 州 番 茄 C aC V 分 離 物 N 基 因 與 中 國(guó) 云 南 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 較 近 與 廣 州 蝴 蝶 蘭 分 離 物 與 泰 國(guó) 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 近 的 結(jié) 論 不 一 致 24 這 可 能 與 傳 播 來(lái) 源 有 關(guān) N S s 基 因 與 中 國(guó) 云 南 泰 國(guó) 和 荷 蘭 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 較 近 與 地 理 來(lái) 源 和 寄 主 植 物 存 在 一 定 的 差 異 性 N S m 基 因 與 中 國(guó) 海 南 和 廣 州 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 近 推 測(cè) 貴 州 C aC V 可 能 是 從 番 茄 辣 椒 在 國(guó) 內(nèi) 調(diào) 運(yùn) 及 薊 馬 帶 毒 傳 播 進(jìn) 入 也 可 能 是 進(jìn) 口 其 他 國(guó) 家 的 種 子 苗 木 引 入 的 C aC V 侵 染 番 茄 后 導(dǎo) 致 番 茄 斑 駁 矮 小 甚 至 絕 產(chǎn) 極 大 地 影 響 了 番 茄 的 產(chǎn) 量 以 及 果 實(shí) 的 品 質(zhì) 嚴(yán) 重 限 制 番 茄 產(chǎn) 業(yè) 的 可 持 續(xù) 發(fā) 展 造 成 了 巨 大 的 經(jīng) 濟(jì) 損 失 C aC V 的 主 要 傳 播 介 體 是 薊 馬 薊 馬 能 夠 廣 泛 的 危 害 作 物 甚 至 可 以 侵 染 雜 草 16 25 因 此 在 應(yīng) 當(dāng) 警 惕 薊 馬 將 C aC V 傳 播 給 其 他 作 物 并 且 加 強(qiáng) 對(duì) 于 貴 州 省 其 他 茄 科 作 物 上 的 C aC V 監(jiān) 測(cè) 了 解 其 發(fā) 生 趨 勢(shì) 以 及 為 害 范 圍 為 保 障 番 茄 產(chǎn) 業(yè) 的 健 康 可 持 續(xù) 發(fā) 展 提 供 參 考 依 據(jù) 同 時(shí) 為 集 成 辣 椒 褪 綠 病 毒 的 防 控 技 術(shù) 奠 定 理 論 基 礎(chǔ) 作 者 貢 獻(xiàn) 聲 明 田 雨 李 淳 王 莉 爽 方 案 設(shè) 計(jì) 數(shù) 據(jù) 管 理 初 稿 寫 作 提 供 資 源 田 雨 實(shí) 驗(yàn) 操 作 可 視 化 吳 石 平 王 莉 爽 獲 取 資 助 項(xiàng) 目 管 理 監(jiān) 督 指 導(dǎo) 審 查 和 編 輯 寫 作 田 雨 黃 露 安 星 宇 有 效 性 驗(yàn) 證 提 供 資 源 作 者 利 益 沖 突 公 開 聲 明 作 者 聲 明 沒(méi) 有 任 何 可 能 會(huì) 影 響 本 文 所 報(bào) 告 工 作 的 已 知 經(jīng) 濟(jì) 利 益 或 個(gè) 人 關(guān) 系 圖 5 基 于 N S s 基 因 序 列 構(gòu) 建 辣 椒 褪 綠 病 毒 不 同 分 離 物 的 進(jìn) 化 樹 F igure 5 C onstruction of evolutionary trees of different isolates of capsicum chlorosis virus based on N S s gene sequences 408 2 期 田 雨 等 侵 染 貴 州 番 茄 的 辣 椒 褪 綠 病 毒 分 子 鑒 定 與 分 析 參 考 文 獻(xiàn) 1 洪 健 謝 禮 張 仲 凱 等 IC T V 最 新 十 五 級(jí) 分 類 階 元 病 毒 分 類 系 統(tǒng) 中 的 植 物 病 毒 J 植 物 病 理 學(xué) 報(bào) 2021 51 02 143 162 D O I 10 13926 ki apps 000554 2 Zheng Y ouxiu C hen C hingchung Jan F uh Jyh C om plete nucleotide sequence of capsicum chlorosis virus isolated from phalaenopsis orchid and the prediction of the unexplored genetic inform ation of tospoviruses J A rch V irol 2011 156 3 421 432 D O I 10 1007 s00705 010 0874 y 3 L A M cM ichael D M P ersley J E T hom as T he first record of a serotype IV tospovirus in A ustralia J A ustralas P lant P athol 2000 29 2 149 D O I 10 1071 A P 00023 4 K C hen Z X u L Y an et al C haracterization of a new strain of capsicum chlorosis virus from peanut A rachis hypogaea L in C hina J J P hytopathol 2007 155 3 178 181 D O I 10 1111 j 1439 0434 2007 01217 x 5 C hen C C H uang C H C hen T C et al F irst report of capsicum chlorosis virus causing yellow stripes on calla lilies in T aiw an J P lant D is 2007 91 9 1201 D O I 10 1094 P D IS 91 9 1201C 6 L u C hen Jianw ei G uo R ex F rim pong A nane et al F irst report of capsicum chlorosis virus infecting chrom olaena odorata in Y unnan C hina J P lant D is 2022 106 3 1077 D O I 10 1094 P D IS 02 21 0341 P D N 7 Y in Y Y L i T T L u X et al F irst report of capsicum chlorosis virus infecting tom ato in Y unnan southw est of C hina J P lant D is 2016 100 1 230 230 D O I 10 1094 pdis 01 15 0088 pdn 8 H ossei