植物保護學報Journal of Plant Protection 2022 49 4 1085 1092 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2022 2020266 云南省藍莓莖基腐病病原菌鑒定及其生物學特性分析 楊秀梅 1 瞿素萍 1 張藝萍 1 吳學尉 2 王麗花 1 1 云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所 國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心 云南省花卉育種重點實驗室 昆明650205 2 云南大學農(nóng)學院 昆明650504 摘要 為明確云南省藍莓莖基腐病的病原菌種類及其生物學特性 從玉溪市江川區(qū)藍莓種苗種植 基地采集具有莖基腐病典型癥狀的藍莓病株進行病原菌分離 純化和致病性測定 對病原菌形態(tài)學 特征進行觀察并基于Act H3 EF 1 和 tub基因序列分析進行分子生物學鑒定 同時對病原菌的 生物學特性進行室內(nèi)測定 結(jié)果表明 分離到的病原菌純化菌落為深棕色 菌絲白色至紅褐色 大 型分生孢子梗無色透明 長150 400 m 分枝末端產(chǎn)生2 4個瓶梗 囊泡球形或近球形 大小為 15 23 m 6 15 m 大型分生孢子無色透明 直圓柱形 一端稍窄 大小為45 80 m 4 8 m 基 于Act H3 EF 1 和 tub基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 菌株BC 1 BC 2與冬青麗赤殼Calonectria ilicicola 均聚在同一分支 結(jié)合形態(tài)學特征與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 將云南省藍莓莖基腐病病原菌鑒定為冬青 麗赤殼C ilicicola 病原菌對可溶性淀粉的利用效果最好 菌絲生長的最適氮源為蛋白胨 最適生 長溫度為25 最適pH范圍為4 7 關(guān)鍵詞 藍莓 莖基腐病 冬青麗赤殼 鑒定 生物學特性 Identification and biological characteristics of the pathogen causing stem base rot of blueberry inYunnan Yang Xiumei 1 Qu Suping 1 Zhang Yiping 1 Wu Xuewei 2 Wang Lihua 1 1 Yunnan Key Laboratory for Flower Breeding National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture Flower Research Institute YunnanAcademy ofAgriculture Sciences Kunming 650205 Yunnan Province China 2 School ofAgriculture Yunnan University Kunming 650504 Yunnan Province China Abstract To clarify the pathogen causing stem base rot of blueberry inYunnan Province and its biologi cal characteristics the diseased plants with typical symptoms of stem base rot were collected from the blueberry seedling planting base in Jiangchuan District Yuxi City for pathogen isolation purification and pathogenicity determination The morphological characteristics of pathogens were observed and their Act H3 EF 1 and tub gene sequences were analyzed The results showed that the colonies of the purified isolates were dark brown and the hyphae were white to reddish brown The large conidium stalks were colorless and transparent 150 400 m long with two to four bottle shaped conidiogenous cells at the end of each branch Vesicles were spherical or nearly spherical with a size of 15 23 m 6 15 m Large conidia were also colorless and transparent straight cylindrical slightly narrow at one end and the size was 45 80 m 4 8 m The phylogenetic tree based on Act H3 EF 1 and tub genes indicated that selected isolates BC 1 BC 2 and Calonectria ilicicola were clustered in the same branch Combining the results of morphological characteristics and phylogenetic analysis the pathogen causing blueberry stem base rot in Yunnan Province was identified as C ilicicola The results of biologi 基金項目 云南省鄉(xiāng)村振興科技專項 202104BI090014 通信作者 Author for correspondence E mail wanglihua cn 收稿日期 2020 10 23 1086 植 物 保 護 學 報 49卷 藍莓為一種新興的世界性小漿果類果樹 是原 產(chǎn)于北美地區(qū)的杜鵑花科越橘屬Vaccinium藍果類 型植物 藍莓果實含有豐富的營養(yǎng)成分 尤其富含 花青素 黃酮類和多糖類化合物 具有良好的營養(yǎng)和 保健價值 被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為世界五大健康食 品之一 王佳寧等 2016 我國自2000年開始藍莓 的商業(yè)化種植 截止2020年底 全國藍莓栽培面積 6 64萬hm 2 總產(chǎn)量34 72萬t 鮮果產(chǎn)量23 47萬t 李 亞東等 2021 近年來隨著藍莓產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展 種植面積逐年增加 藍莓病害發(fā)生也隨之增多 嚴重 影響藍莓的產(chǎn)量和品質(zhì) 麗赤殼屬Calonectria真菌是一類重要的植物 病原菌 其無形態(tài)為帚梗柱孢霉Cylindrocladium 該屬真菌主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū) 主要引起 植物葉斑 枝枯和根莖腐爛 其寄主范圍廣泛 可侵 染約100個科335種植物 殷瑜 2016 在我國 麗 赤殼屬真菌嚴重危害綠巨人 桉樹 花生和大豆等植 物 造成巨大的經(jīng)濟損失 據(jù)報道 廣州市從臺灣省 引進的綠巨人幼苗 1個月內(nèi)被天南星帚梗柱孢Cyl indrocladium spathiphylli侵染而腐爛死亡的植株比 例高達60 姜子德和戚佩坤 1997 廣西壯族自 治區(qū)北海市合浦縣常樂鎮(zhèn)和曲樟鄉(xiāng)等地由柱枝雙孢 霉Cy scoparium和帚梗柱枝菌Cy quinqueseptatum 侵染引起的桉樹焦枯病發(fā)病率達75 以上 龐聯(lián)東 等 2001 廣東省由冬青麗赤殼Ca ilicicola侵染 引起的花生黑腐病和大豆冠腐病發(fā)病率分別高 達50 和80 Guan et al 2010 Pan et al 2009 2007年 我國將冬青麗赤殼列入 中華人民共和國 進境植物檢疫性有害生物名錄 蓋云鵬等 2016 近年來 隨著國內(nèi)藍莓種植面積不斷擴大 種植 區(qū)不斷有麗赤殼屬真菌危害藍莓的報道 如馮璐 2007 對發(fā)生于遼東地區(qū)的藍莓葉斑病進行研究 發(fā)現(xiàn)病原菌為柯氏麗赤殼Ca colhounii 費諾亞等 2017 將湖北省隨州市藍莓苗木枝枯病的病原菌鑒 定為加拿大麗赤殼Ca canadensis 麗赤殼菌可隨 藍莓苗木進行遠距離傳播 且病原體以微菌核的形 式長期存在于土壤或植物病殘體中 田塊一旦發(fā)過 病就會殘留抗逆性強的病菌子囊殼 微菌核和厚垣 孢子 給藍莓病害防控帶來很大困難 蓋云鵬等 2016 筆者于2019年10月在云南省玉溪市江川區(qū) 的藍莓種苗生產(chǎn)基地開展病害調(diào)查時 發(fā)現(xiàn)品種萊 格西和天后等2 3年生藍莓種苗出現(xiàn)莖基腐病癥 狀 表現(xiàn)為植株莖基部發(fā)黑變腐 枝條枯萎 葉片干 枯脫落 受害植株1 2月內(nèi)即枯萎死亡 據(jù)調(diào)查 品 種萊格西較易感病 發(fā)病率超過40 在一些地塊甚 至成片死亡 嚴重影響藍莓種苗的產(chǎn)量和品質(zhì) 為 明確該病的病原菌種類 本研究對采集自云南省玉 溪市的典型發(fā)病藍莓植株進行病原菌的分離鑒定 致病性測定及其生物學特性分析 以期為云南省藍 莓莖基腐病的發(fā)生 流行規(guī)律研究和綜合防治提供 理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 供試病樣及植物 2019年10月自云南省玉溪市 江川區(qū)藍莓種苗基地采集藍莓品種萊格西感莖基腐 病病株10株 帶回實驗室于4 保存 同時在該基 地選取健康藍莓品種萊格西植株 帶回室內(nèi)備用 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 potato dextrose agar PDA 培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200 g 葡萄糖20 g 瓊脂18 g 蒸餾水1 L 麥芽汁瓊脂 malt extract agar MEA 培養(yǎng)基成分為麥芽汁20 g 瓊脂18 g 蒸 餾水1 L 香石竹葉片瓊脂 carnation leaf agar CLA 培養(yǎng)基成分為葡萄糖18 g 瓊脂18 g 蒸餾水1 L 滅 菌后倒平板 將新鮮香石竹葉片剪成長度為2 cm的 小片 凝固前每個平板平鋪3片 4 水瓊脂 water agar WA 培養(yǎng)基成分為瓊脂40 g 蒸餾水1 L 查彼 Czapek 培養(yǎng)基成分為NaNO 3 2 g KCl 0 5 g Fe SO 4 7H 2 O 0 01 g K 2 HPO 4 1 g MgSO 4 7H 2 O 0 5 g 蔗 糖30 g 瓊脂18 g 蒸餾水1 L 試劑及儀器 DNA提取試劑盒 dNTP Taq酶 Buffer 寶生物工程 大連 有限公司 其他試劑均為 國產(chǎn)分析純 Powercylcer Gradient SL梯度PCR儀 德國Analytik Jena公司 DYCP 31DN型電泳儀 北 京六一儀器廠 721BR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio Rad 公司 5430R離心機 德國Eppendorf公司 E800生物 顯微鏡 日本Nikon公司 400BS隔水式恒溫培養(yǎng) 箱 上海躍進醫(yī)療器械廠 KBW240光照培養(yǎng)箱 德 cal characteristics showed that among the five tested carbon hydrates soluble starch was the best carbon source for BC 2 The optimum nitrogen source for mycelial growth of BC 2 was peptone the optimum growth temperature was 25 and the optimum pH range was 4 7 Key words blueberry stem base rot Calonectria ilicicola identification biological characteristics 4期 楊秀梅等 云南省藍莓莖基腐病病原菌鑒定及其生物學特性分析 1087 國Binder公司 1 2 方法 1 2 1 藍莓莖基腐病的調(diào)查 于2019年10月在云南省玉溪市江川區(qū)的藍莓 種苗基地開展藍莓莖基腐病的調(diào)查 調(diào)查品種為萊 格西 天后 茶花 珠寶 綠寶石 奧尼爾和春高共 7個藍莓品種 參照方中達 1998 五點取樣法進行 調(diào)查 每點取30 50株 每7 d調(diào)查1次 記錄病害發(fā) 生情況并計算發(fā)病率 1 2 2 藍莓莖基腐病病原菌的分離與形態(tài)學鑒定 采用常規(guī)組織分離法 方中達 1998 分離病原 菌 取萊格西病株莖基部病健交界處組織 切成邊 長為0 5 cm的小方塊 經(jīng)75 酒精與0 1 升汞消毒 后 滅菌水清洗3次后置于PDA平板上 25 暗培 養(yǎng)5 d后 從菌落邊緣挑取菌絲至新的PDA平板上 25 暗培養(yǎng)7 d后 用打孔器打取直徑為5 mm的菌 餅 接種至離體健康萊格西藍莓葉片上 置于放有濕 濾紙片的培養(yǎng)皿中 于25 12 h光照 12 h黑暗條 件下培養(yǎng)5 d后挑取菌絲進行鏡檢 觀察到分生孢 子產(chǎn)生后 挑取孢子并配制濃度為1 10 5 個 mL的懸 浮液母液 將母液稀釋10 4 倍并混勻 取0 1 mL孢 子懸浮液均勻涂布在4 WA平板上 將培養(yǎng)基切成 0 4cm 0 4cm的小塊 逐個鏡檢后挑取帶有單個分生 孢子的瓊脂塊置于新的PDA平板上 25 培養(yǎng)獲得 純培養(yǎng)物 接種至PDA斜面培養(yǎng)基上 4 保存?zhèn)溆?從分離菌株中選擇菌株BC 1 BC 2分別接種 至MEA平板上 25 黑暗培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑 并觀察其形學態(tài)特征 同時參照殷瑜 2016 方法將 供試菌株接種至CLA平板上 25 黑暗培養(yǎng)7 d后 觀察分生孢子梗及囊泡的形狀 并隨機選取20個分 生孢子 觀察其形態(tài) 隔膜數(shù) 并測量其大小 1 2 3 藍莓莖基腐病病原菌的分子生物學鑒定 以菌株BC 1 BC 2為代表菌株進行病原菌的 分子生物學鑒定 從MEA平板上挑取適量菌絲 采 用CTAB法提取菌絲基因組DNA 設(shè)計肌動蛋白 actin Act 組蛋白H3 histon H3 H3 延伸因子 1 蛋白 elongation factor 1 EF 1 和 微管蛋白 tubulin tub 的編碼基因的特異性引物 表1 進行 PCR擴增 引物均由寶生物工程 大連 有限公司合 成 25 L PCR反應體系 2 Taq PCR Green Mix 12 5 L 10 mol L上下游引物各1 L DNA模板 2 L ddH 2 O 8 5 L PCR擴增程序 94 預變性 3 min 94 變性30 s 50 退火30 s 72 延伸1 min 35個循環(huán) 最后72 延伸10 min PCR產(chǎn)物經(jīng)1 5 瓊脂糖凝膠電泳檢測后 送至寶生物工程 大連 有 限公司測序 將測序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行 BLAST同源性比對 從GenBank下載麗赤殼屬近緣 種的Act H3 EF 1 和 tub基因序列作為參考序 列 利用MEGA7 0軟件對基因序列進行比對分析 序列兩端切齊后首尾相連 連接順序為Act H3 EF 1 tub 以鄰接法對4個基因的聯(lián)合序列進行系統(tǒng) 發(fā)育分析 重復檢驗1 000次 表1 目的基因片段擴增引物及序列信息 Table 1 Primers used in this study and their target gene segments 基因片段 Target gene Act H3 EF 1 tub 引物名稱 Primer name ACT 512F ACT 783R CYLH3F CYLH3R EF1 728F EF2 T1 CYLTUB1R 引物序列 5 3 Primer sequence 5 3 ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC TACGAGTCCTTCTGGCCCAT AGGTCCACTGGTGGCAAG AGCTGGATGTCCTTGGACTG CATCGAGAAGTTCGAGAAGG GGARGTACCAGTSATCATGTT AACATGCGTGAGATTGTAAGT AGTTGTCGGGACGGAAGAG 參考文獻 Reference Carbone C D symptoms of leaves 圖1 云南省藍莓莖基腐病的田間癥狀 Fig 1 Symptoms of blueberry stem base rot in the fields inYunnan Province 2 2 藍莓莖基腐病病原菌的分離和形態(tài)學鑒定 共分離純化得到9株單孢菌株 各菌株形態(tài)學 特征無明顯差異 菌株在MEA培養(yǎng)基上生長較慢 平均生長速度為5 8 mm d 菌落近圓形 邊緣不整 齊 菌絲絨毛狀 白色至紅褐色 菌落背面呈深棕色 圖2 A B 大型分生孢子梗由總梗 多級掃帚狀 分枝 末端含囊泡的延伸梗組成 具隔 無色透明 長 150 400 m 末端囊泡帶梗 為球形或近球形 大小 為15 23 m 6 15 m 圖2 C D 分生孢子梗分 枝末端產(chǎn)生2 4個瓶梗 頂端為產(chǎn)孢細胞 呈瓶狀 分生孢子從產(chǎn)孢細胞內(nèi)生出 圖2 E G 大分生孢 子無色透明 呈直圓柱形 一端稍窄 大小為45 80 m 4 8 m 具1 3個隔膜 隔膜處未見明顯縊 縮 圖2 H 根據(jù)形態(tài)學特征 將該病原菌初步鑒 定為麗赤殼屬Calonectria真菌 2 3 藍莓莖基腐病病原菌的分子生物學鑒定 將供試菌株BC 1 BC 2的Act H3 EF 1 和 tub基因序列提交至GenBank 菌株BC 1獲得基因 序列登錄號為MW447130 MW447131 MW447132 和MW447133 菌株BC 2獲得基因序列登錄號為 4期 楊秀梅等 云南省藍莓莖基腐病病原菌鑒定及其生物學特性分析 1089 MT683618 MT683619 MT683620 和 MT683621 菌株的Act H3 EF 1 和 tub序列與GenBank中 冬青麗赤殼相關(guān)序列的同源性為99 100 基于 Act H3 EF 1 tub多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 代 表菌株BC 1 BC 2均與冬青麗赤殼位于同一分支 圖3 結(jié)合形態(tài)學特征和分子生物學鑒定結(jié)果 最終將云南省藍莓莖基腐病的病原菌鑒定為冬青麗 赤殼C ilicicola 2 4 藍莓莖基腐病病原菌的致病性 健康藍莓活體枝條接種供試菌株后發(fā)病較快 48 h后接種部位即出現(xiàn)長度為0 5 1 0 cm的紅褐色 水浸狀病斑 接種5 d時病斑長度擴展至3 0 5 0 cm 接種10 d后植株枯萎死亡 而對照植株未發(fā)病 圖 4 取發(fā)病植株進行病原菌的再分離 重新獲得與 接種菌形態(tài)學特征一致的病原菌 通過柯赫氏法則 驗證證明原接種菌株為藍莓莖基腐病的病原菌 A B MEA培養(yǎng)基上菌落的正面和背面形態(tài) C 大型分生孢子梗 D 囊泡 E G 分生孢子梗和產(chǎn)孢細胞 H 大 型分生孢子 A B Frontal and reverse colony morphologies on MEAmedium C macroconidiophore D vesicle E G conidiophores and conidiogenous cells H macroconidia 圖2 云南省藍莓莖基腐病病原菌的形態(tài)學特征 Fig 2 Morphological characteristics of the pathogenic isolates causing stem base rot on blueberry inYunnan Province 圖3 基于Act H3 EF1 和 tub基因聯(lián)合序列以鄰接法構(gòu)建云南省藍莓莖基腐病病原菌及相關(guān)近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 3 Phylogenetic tree of pathogenic isolates causing blueberry stem rot inYunnan and its related sibling species based onAct H3 EF1 and tub gene sequences by neighbor joining method 括號內(nèi)的登錄號依次對應Act H3 EF1 和 tub基因序列 The accession no in parentheses correspond to Act H3 EF1 and tub gene sequences 1090 植 物 保 護 學 報 49卷 A 對照植株 B 接種菌株BC 1后發(fā)病植株 C D 接種菌株BC 2后發(fā)病植株 A Control B diseased plant after infected isolate BC 1 C D diseased plants after infected isolate BC 2 圖4 云南省藍莓莖基腐病病原菌的致病性測定 Fig 4 Pathogenicity test of selected isolate BC 2 on blueberry under greenhouse conditions 2 5 藍莓莖基腐病病原菌的生物學特性 2 5 1 病原菌對碳源和氮源的利用 供試菌株在5種碳源培養(yǎng)基上均能生長 對可 溶性淀粉的利用效果最好 培養(yǎng)7 d時菌落直徑為 6 78 cm 其次為麥芽糖和葡萄糖 兩者對菌絲生長 的影響差異不顯著 病原菌對果糖的利用效果最差 培養(yǎng)7 d時菌落直徑為4 06 cm 圖5 A 在氮源利 用試驗中 供試菌株對蛋白胨和甘氨酸的利用效果 較好 培養(yǎng)7 d時菌落直徑分別為8 14 cm和8 00 cm 病原菌對尿素和硝酸鈉的利用效果較差 兩者對菌 絲生長的影響差異不顯著 圖5 B 圖5 碳源 A 氮源 B 溫度 C 和pH D 對云南省藍莓莖基腐病病原菌菌絲生長的影響 Fig 5 Effects of carbon source A nitrogen source B incubation temperature C and pH D on mycelia growth of isolate BC 2 obtained from blueberry stem rot inYunnan Province 圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標準差 不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗在P 0 05水平差異顯著 Data are mean SD Different lowercase letters indicate significant difference at P 0 05 level by Duncan s new multiple range test 4期 楊秀梅等 云南省藍莓莖基腐病病原菌鑒定及其生物學特性分析 1091 2 5 2 不同溫度 pH對菌絲生長的影響 供試菌株在10 30 范圍內(nèi)均能生長 最適宜 溫度為25 菌落直徑為8 11 cm 溫度為10 20 時菌絲生長較緩慢 溫度為35 時菌絲停止生長 圖5 C 供試菌株對環(huán)境酸堿度的適應范圍較 廣 在pH 4 10范圍內(nèi)均能生長 最適pH范圍為4 7 圖5 D 3 討論 準確的分類鑒定是研究病原菌種群結(jié)構(gòu) 傳播 途徑 流行規(guī)律以及病害綜合防治的基礎(chǔ) 我國藍 莓產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)的麗赤殼菌有多個種 因此病原菌的鑒 定工作顯得尤為重要 在麗赤殼屬真菌的鑒定中 形態(tài)學分類的重要依據(jù)是囊泡的形狀 但是球形囊 泡與梨形或卵圓形囊泡容易混淆 Hirooka et al 2009 因此在確定菌株的種群分類時還需進行進一 步的分子生物學鑒定 目前結(jié)合形態(tài)學特征和多基 因系統(tǒng)學鑒定該屬真菌已成為發(fā)展趨勢 殷瑜 2016 Lombard et al 2010 對麗赤殼菌屬的68個 種進行了Act tub Cal H3 ITS Lsu及EF 1 七段 基因的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)聚類分析及 形態(tài)學特征將其劃分為扁平囊泡組和球形囊泡組 2個大類13個復合群 建議對于未知的麗赤殼菌屬 真菌的鑒定 可應用H3 EF 1 和 tub這3段基因 聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來確定其分類地位 本研究通 過Act H3 EF 1 和 tub共4段基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng) 發(fā)育樹的方法 將云南省藍莓莖基腐病的病原菌鑒 定為冬青麗赤殼 與麗赤殼屬真菌的其他相似種能 進行明顯區(qū)分 病原菌的生物學特性與病害的發(fā)生和流行規(guī)律 有著密切聯(lián)系 吳恩果等 2020 蓋云鵬等 2016 研究結(jié)果表明 引起花生黑腐病的冬青麗赤殼在 10 30 范圍內(nèi)均能生長 溫度低于5 或高于35 時菌絲停止生長 菌絲最適生長溫度為25 28 費 諾亞等 2017 對加拿大麗赤殼的生物學特性研究結(jié) 果表明 菌絲生長的最適溫度為25 但在5 與 35 條件下菌絲不能生長 這與本研究結(jié)果一致 本研究中 病原菌菌絲生長的最適pH范圍為4 7 表明該菌適宜在中性偏酸性的條件下生長 該菌對 可溶性淀粉的利用效果最好 這與費諾亞等 2017 的研究結(jié)果一致 冬青麗赤殼在pH 4 10范圍內(nèi)均 能生長 且對大部分供試碳 氮源均可有效利用 表 明該菌有較強的環(huán)境適應性 這也許是麗赤殼屬真 菌在全世界范圍內(nèi)均有分布且寄主范圍廣泛的原因 之一 近年來國內(nèi)藍莓種植面積不斷擴大 不同種植 環(huán)境 品種布局與種苗來源影響著病害發(fā)生的多樣 性 我國藍莓產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)有柯氏麗赤殼Ca colhounii 和加拿大麗赤殼 以及本研究在云南省玉溪市藍莓 種苗基地發(fā)現(xiàn)的冬青麗赤殼 表明隨著藍莓商業(yè)化 種植由北向南延伸 麗赤殼屬真菌在藍莓種植區(qū)的 種群分布越來越豐富 其對藍莓產(chǎn)業(yè)的潛在威脅不 容忽視 該屬真菌在云南省乃至全國藍莓種植基地 的種群分布 危害情況以及病害流行規(guī)律都有待進 一步研究 冬青麗赤殼菌引起的藍莓莖基腐病是典 型的土傳和種傳病害 為防治該病害建議在種植藍 莓時應選擇無病地塊 種苗種植前應進行消毒處 理 此外 田間發(fā)現(xiàn)病株應及時銷毀 并對病株周圍 土壤進行消毒 發(fā)病地塊應注意水旱輪種 或與其他 作物輪作 參 考 文 獻 References Carbone I Kohn LM 1999 Amethod for designing primer 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