中國農(nóng)學(xué)通報(bào) ChineseAgriculturalScienceBulletin 中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2021 37 16 119 126 ChineseAgriculturalScienceBulletin 基 金 項(xiàng) 目 國 家 重 點(diǎn) 研 發(fā) 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 主 要 經(jīng) 濟(jì) 作 物 重 要 及 新 成 災(zāi) 害 綠 色 綜 合 防 控 技 術(shù) 2019YFD1002000 云 南 省 萬 人 計(jì) 劃 產(chǎn) 業(yè) 技 術(shù) 領(lǐng) 軍 人 才 專 項(xiàng) YNWR CYJS 2019 046 云南省重點(diǎn)研發(fā) 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域 計(jì)劃項(xiàng)目 藍(lán)莓病蟲害診斷和綠色防控綜合體系建設(shè) 2018BB016 第 一 作 者 簡 介 張 榮 琴 女 1994 年 出 生 云 南 楚 雄 人 碩 士 主 要 從 事 植 物 病 害 防 治 研 究 通 信 地 址 661300 云 南 省 紅 河 州 河 口 縣 沙 壩 云 南 省 紅 河 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 E mail 382429016 通 訊 作 者 魏 蘭 芳 女 1971 年 出 生 河 南 遂 平 人 高 級 實(shí) 驗(yàn) 師 碩 士 研 究 方 向 微 生 物 資 源 開 發(fā) 與 利 用 通 信 地 址 650201 云 南 省 昆 明 市 盤 龍 區(qū) 灃 源 路452 號 云 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) E mail 1121942876 姬 廣 海 男 1970 年 出 生 河 南 睢 縣 人 教 授 博 士 研 究 方 向 植 物 細(xì) 菌 病 害 通 信 地 址 650201 云南省昆明市盤龍區(qū)灃源路452 號 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) E mail jghai001 收稿日期 2020 08 03 修回日期 2021 03 21 云南藍(lán)莓根癌病病原鑒定及其防控藥劑的篩選 張榮琴 1 2 萬效琰 1 張晉豪 1 代真林 1 鄭建立 3 崔興國 3 趙項(xiàng)武 3 魏蘭芳 1 姬廣海 1 1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明650201 2 云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 云南河口661300 3 曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司 云南曲靖655000 摘 要 研 究 旨 在 確 定 云 南 省 藍(lán) 莓 主 產(chǎn) 區(qū) 發(fā) 生 的 藍(lán) 莓 根 癌 病 病 原 菌 種 類 并 進(jìn) 行 田 間 防 治 藥 劑 篩 選 采 集 云 南 省 藍(lán) 莓 主 產(chǎn) 區(qū) 藍(lán) 莓 根 癌 病 樣 品 通 過 發(fā) 病 癥 狀 菌 落 形 態(tài) 觀 察 致 病 性 測 定 Biolog 分 析 16S rDNA 序 列 分 析 比 較 進(jìn) 行 系 統(tǒng) 鑒 定 在 發(fā) 病 嚴(yán) 重 的 藍(lán) 莓 基 地 采 用 噻 霉 酮 申 嗪 霉 素 等8 種 藥 劑 進(jìn) 行 田 間 防 治 試 驗(yàn) 從 藍(lán) 莓 根 癌 病 樣 品 中 分 離 純 化 獲 得 的 菌 株L 11 接 種 向 日 葵 番 茄 藍(lán) 莓 植 株 均 能 發(fā) 病 且 發(fā) 病 癥 狀 與 田 間 癥 狀 相 同 重 新 分 離 得 到 形 態(tài) 相 同 的 菌 株 16SrDNA 序 列 分 析 和 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 結(jié) 果 表 明 L 11 菌 株 序 列 與 根 癌 土 壤 桿 菌 Agrobacterium tumefaciens 菌 株Ell 7 登 錄 號FJ613554 1 同 源 性 高 達(dá) 97 65 與 根 癌 土 壤 桿 菌 處 于 同 一 分 支 上 菌 株L 11 利 用ipt 基 因 的 特 異 性 引 物AtP3F AtP3R 能 擴(kuò) 增 出 155bp 的 特 異 性 片 段 進(jìn) 一 步 證 實(shí) 藍(lán) 莓 根 癌 病 由 根 癌 土 壤 桿 菌 引 起 田 間 藥 效 試 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明 1 5 噻 霉 酮 水 乳 劑 對 藍(lán) 莓 根 癌 病 有 較 好 的 防 治 效 果 相 對 防 效 為52 這 是 云 南 首 次 報(bào) 道 由 根 癌 土 壤 桿 菌 引 起 藍(lán)莓根癌病 關(guān)鍵詞 藍(lán)莓根癌病 病原菌 分離 鑒定 根癌土壤桿菌 藥劑篩選 中圖分類號 S436 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 論文編號 casb2020 0315 Pathogen Identification of Blueberry Crown Gall Disease in Yunnan Province and Screening of Control Agents in Field Zhang Rongqin 1 2 Wan Xiaoyan 1 Zhang Jinhao 1 Dai Zhenlin 1 Zheng Jianli 3 Cui Xingguo 3 Zhao Xiangwu 3 Wei Lanfang 1 Ji Guanghai 1 1 Key Laboratory of Agriculture Biodiversity for Plant Disease Management of the Ministry of Education Yunnan Agricultural University Kunming 650201 2 Honghe Tropical Agricultural Science Institute of Yunnan Hekou Yunnan 661300 3 Qujing Jiawo Modern Agriculture Co Ltd Qujing Yunnan 655000 Abstract The study aims to d etermine the species of blueberry crown gall pathogenic bacteria currently occurring in the main blueberry producing areas of Yunnan Province and screen the field control agents Collecting blueberry crown gall disease samples from the main blueberry production areas in Yunnan the symptoms of the disease colony morphology pathogenicity test Biolog analysis and 16 S rDNA sequence analysis were carried out for systematic identification The agent screening test was conducted at the blueberry base with serious disease and eight kinds of pesticides such as thiazinone and shenzemycin were used for field control experiments The strain L 11 isolated and purified from blueberry crown gall disease samples could infect sunflower tomato and blueberry plants and the symptoms were simila r to those in field The strain with中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 0 引言 藍(lán) 莓 Vaccinium spp 又 稱 越 桔 屬 杜 鵑 花 科 越 桔 屬 灌 木 分 布 在 熱 帶 亞 熱 帶 溫 帶 等 地 區(qū) 藍(lán) 莓 果 實(shí) 風(fēng)味獨(dú)特 營養(yǎng)豐富 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的栽 培 前 景 1 近 年 來 藍(lán) 莓 在 云 南 省 的 種 植 面 積 逐 年 增 加 各 種 藍(lán) 莓 病 害 也 頻 繁 發(fā) 生 2 其 中 藍(lán) 莓 根 癌 病 是 一 種為害藍(lán)莓根部的重要病害 使藍(lán)莓產(chǎn)量急劇下降 經(jīng) 濟(jì) 損 失 嚴(yán) 重 根 癌 病 是 一 種 普 遍 發(fā) 生 的 細(xì) 菌 性 病 害 由具有致瘤性的根瘤菌科菌株引起 包括土壤桿菌屬 異 根 瘤 菌 屬 和 根 瘤 菌 屬 的 多 個(gè) 種 可 侵 染 多 種 果 樹 和 一 些 多 年 生 觀 賞 植 物 3 危 害 根 頸 主 根 側(cè) 根 4 為 果 園 及 苗 圃 帶 來 重 大 經(jīng) 濟(jì) 損 失 2010 年 阿 根 廷 首 次 發(fā) 現(xiàn) 和 報(bào) 道 了 由 根 癌 農(nóng) 桿 菌 引 起 的 藍(lán) 莓 根 癌 病 5 同 年 國內(nèi)研究人員在遼寧 吉林 山東及黑龍江省發(fā)現(xiàn)了藍(lán) 莓 根 癌 病 6 目 前 未 見 云 南 省 藍(lán) 莓 根 癌 病 的 研 究 報(bào) 道 為 闡 明 云 南 省 發(fā) 生 的 藍(lán) 莓 根 癌 病 病 原 菌 種 類 筆 者采用多點(diǎn)采樣 進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng) 致病性測定和 病 原 菌 的 系 統(tǒng) 鑒 定 以 期 為 藍(lán) 莓 根 癌 病 的 研 究 和 防 治 提供參考 1 材料與方法 1 1 樣品采集 藍(lán)莓根癌病樣品分別采集自云南省藍(lán)莓主栽區(qū)曲 靖 市 麒 麟 區(qū) 馬 龍 區(qū) 玉 溪 市 澄 江 縣 昆 明 市 石 林 縣 藍(lán) 莓基地發(fā)病地塊 采集具有根癌病病癥的根部腫瘤組 織 保存于紙質(zhì)采樣袋中 1 2 菌株分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn) 7 8 中根癌菌的分離方法 選取根部腫瘤 組 織 白 色 幼 嫩 部 分 清 洗 干 凈 后 用75 乙 醇 表 面 消 毒 60s 再 用 無 菌 水 漂 洗3 次 用 無 菌 研 缽 將 組 織 研 碎 轉(zhuǎn) 移 至 無 菌 三 角 瓶 中 加 入45mL 無 菌 水 28 160r min 振蕩30min 將上清 液梯度 稀釋 10 1 10 5 各取100 L 在YEM 和MW 培 養(yǎng) 基 按 低 濃 度 至 高 濃 度 進(jìn) 行 涂 布 分 離 28 培 養(yǎng)48h 參 考 文 獻(xiàn) 9 中 根 癌 土 壤 桿 菌 代 表 菌 株 的 菌 落 特 征 和 生 物 學(xué) 特 性 測 定 方 法 篩 選 具 有 根 癌 土 壤 桿 菌 特 征 的 單 菌 落 純 化 培 養(yǎng)2 代 后 保 存 備 用 表1 1 3 致病性測定 1 3 1 向 日 葵 番 茄 接 種 試 驗(yàn) 選 取 向 日 葵 和 番 茄 為 指 示 植 物 10 將 分 離 得 到 的20 株 純 培 養(yǎng) 菌 株 表1 分 別 接 種 到50 mLKB 液 體 培 養(yǎng) 基 中 28 過 夜 培 養(yǎng) 制 備 濃 度 為1 10 9 CFU mL 的 菌 懸 液 采 用 針 刺 法 接 種 健 康 向 日 葵 和 番 茄 植 株 的 莖 基 部 并 用 脫 脂 棉 保 濕 對 照 用 無 菌 水 接 種 處 理 每 個(gè) 處 理5 個(gè) 重 復(fù) 每 天 觀 察 植 株 發(fā) 病 情 況 2 周 后 開 始 觀 察 并 記 錄 腫 瘤 的 生 長 情 況 根 據(jù) 柯 赫 氏 法 則 對 發(fā) 病 部 位 進(jìn) 行 再 分 離 根 據(jù) 菌 株的形態(tài)特征判斷分離得到的病菌是否與原接種菌株 相同 1 3 2 藍(lán) 莓 回 接 試 驗(yàn) 選 取 致 病 性 較 強(qiáng) 的 菌 株 回 接 藍(lán) 莓 菌 懸 液 制 備 方 法 同1 3 1 灌 根 生 長 健 壯 的 藍(lán) 莓 植 株 對 照 用 無 菌 水 灌 根 處 理 每 個(gè) 處 理5 個(gè) 重 復(fù) 每 天 觀 察 植 株 發(fā) 病 情 況 30 天 后 開 始 觀 察 記 錄 腫 瘤 的 生 長 情況 1 4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 1 4 1 病 原 菌DNA 的 提 取 將 供 試 菌 株L 11 2JK11 芽 孢 桿 菌 1 BT 186 假 單 胞 菌 1 BT 22 冬 青 節(jié) 桿 菌 2 BT 19 黃 桿 菌 RG 4 根 瘤 菌 接 種 至NA 培 養(yǎng) identical morphology was obtained by re isolation 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree analysis showed that the sequence of L 11 strain and Agrobacterium tumefaciens strain Ell 7 accession number FJ 613554 1 homology was up to 97 65 and L 11 was on the same branch as A tumefaciens The specific fragment of 155 bp was amplified by the ipt specific primer AtP 3F AtP 3 R in L 11 which further confirmed that blueberry crown gall disease was caused by A tumefaciens The field efficacy test results showed that 1 5 thiazinone emulsion in water had a better control effect on blueberry crown gall disease with a relative control effect of 52 This is the first report of blueberry crown gall disease caused by A tumefaciens in Yunnan Keywords blueberry crown gall disease pathogenic bacteria isolation identification Agrobacterium tumefaciens pharmacy screening 表 1 藍(lán)莓根部腫瘤中分離獲得的菌株 編號 L4 P4 P4 12 P4 14 P4 1 Jh 4 P2 13 P2 14 P2 1 P2 2 采集地點(diǎn) 昆明市石林縣 昆明市石林縣 昆明市石林縣 玉溪市澄江縣 玉溪市澄江縣 玉溪市澄江縣 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 編號 L 11 L 12 P2 3 P2 5 P2 6 P2 12 L 3 L 5 L4 20 P4 21 采集地點(diǎn) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市麒麟?yún)^(qū) 曲靖市馬龍區(qū) 曲靖市馬龍區(qū) 曲靖市馬龍區(qū) 曲靖市馬龍區(qū) 120基 28 培 養(yǎng)24 h 用 接 種 環(huán) 挑 取 少 量 菌 體 接 種 于LB 液 體 培 養(yǎng) 基 28 160r min 過 夜 培 養(yǎng) 后 收 集 菌 體 按 照 細(xì) 菌DNA 提 取 試 劑 盒 天 根DP302 02 說 明 書 提 取 細(xì)菌基因組DNA 1 4 2 16S rDNA 序 列 分 析 及 其 同 源 性 比 較 根 據(jù) 已 發(fā) 表 的 細(xì) 菌16SrDNA 通 用 引 物 11 27F 和1492R 對 供 試 菌 株 進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增 引 物 序 列 為 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 參 照 Taq PCR Master Mix catTSE030 擎 科 配 制25 LPCR 反 應(yīng) 體 系 PCR 擴(kuò) 增 程 序 為 95 預(yù) 變 性5min 94 變 性30s 55 退 火30 s 72 延 伸1 min 35 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸 10 min 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 用1 0 瓊 脂 糖 凝 膠 進(jìn) 行 電 泳 檢 測 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序 將 得 到 的16SrDNA 序 列 與BLAST 中 的 分 析 結(jié) 果 進(jìn) 行 比 較 使用MEGA6 0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 1 4 3 特 異 性 引 物 設(shè) 計(jì) 及 檢 測 將 根 癌 土 壤 桿 菌 的ipt 基 因 在BLAST 中 進(jìn) 行 同 源 性 比 對 并 將 靶 片 段 序 列 通 過BLASTn 進(jìn) 行 同 源 性 比 對 設(shè) 計(jì) 出 特 異 性 較 強(qiáng) 的 藍(lán) 莓 根 癌 病 菌 特 異 性 引 物 12 14 由 昆 明 擎 科 生 物 技 術(shù) 公 司 合 成 引 物 序 列 為AtP3F 5 GCAACGAGTTAGCAGAC GAG 3 AtP3R 5 CCCATCGATCCCTTCCAGTA 3 預(yù) 期 片 段 為155bp 利 用AtP3F AtP3R 對 菌 株L 11 和5 株 非 靶 標(biāo) 菌 株 2JK11 1 BT 186 1 BT 22 2 BT 19 RG 4 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 參 照TaqPCRMasterMix catTSE030 擎 科 配 制 25 LPCR 反 應(yīng) 體 系 PCR 擴(kuò) 增 程 序 同1 4 2 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 用1 0 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測 1 5 Biolog 生理生化特性測定 采 用 美 國BIOLOG 公 司 的MicrostationTMV 4 01 系 統(tǒng) 革 蘭 氏 陰 性 菌 微 板 GN 和 數(shù) 據(jù) 庫 Biolog GN 板 反 應(yīng) 底 物 如 表2 試 驗(yàn) 程 序 按 公 司 的 操 作 指 南 進(jìn) 行 將 供 試 菌 株L 11 在YEM 培 養(yǎng) 基 上 轉(zhuǎn) 接2 次 劃 線 接 種 到Bug 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 上 28 培 養(yǎng)24h 用 無 菌 棉 簽 輕 輕 擦拭培養(yǎng)基上的菌落 移入無菌稀釋緩沖液中 混勻得 到 菌 懸 液 測 定 其 濁 度 為98 用 移 液 器 將 菌 懸 液 加 入GN 微 孔 板 每 孔150 L 共96 孔 對 照 孔 加150 L 無菌水 置于28 培養(yǎng) 4 24 48h 后讀數(shù)記錄結(jié)果 1 6 田間藥劑篩選 1 6 1 供試藍(lán)莓 試驗(yàn)藍(lán)莓園位于曲靖市麒麟?yún)^(qū)越州鎮(zhèn) 大梨樹村 試驗(yàn)于2018 年12 月開始 2019 年5 月結(jié)束 1 6 2 供 試 藥 劑 化 學(xué) 藥 劑 包 括50 氯 溴 異 氰 尿 酸 粉 劑 南 京 南 農(nóng) 農(nóng) 藥 科 技 發(fā) 展 有 限 公 司 1 5 噻 霉 酮 水 乳 劑 陜 西 西 大 華 特 科 技 實(shí) 業(yè) 有 限 公 司 1 申 嗪 霉 素 懸 浮 劑 上 海 農(nóng) 樂 生 物 制 品 有 限 公 司 葉 斑 寧 60 億 芽 孢 mL 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌Lx 11 水 劑 江 蘇 蘇 科 農(nóng) 化 有 限 公 司 生 防 菌 劑 為WR13 6 C3 13 6 枯 草 芽 孢 桿 菌 均由本實(shí)驗(yàn)室提供 表 2 Biolog GN 微孔板上 96 種碳氮源底物 編號 A B C D E F G H 編號 A B C D E F G H 1 水 赤蘚糖醇 D 蜜二糖 乙酸 p 對羥基苯乙酸 溴丁二酸 L 組氨酸 尿刊酸 7 N 乙酰 D 氨基半乳糖 肌醇 蔗糖 D 葡萄糖酸 丙二酸 L 丙氨酰甘氨酸 L 焦谷氨酸 2 氨基乙醇 2 環(huán)糊精 D 果糖 甲基 D 葡萄糖苷 順式烏頭酸 亞甲基丁二酸 琥珀酰胺酸 羥基 L 脯氨酸 肌苷 8 N 乙酰 D 氨基葡萄糖 D 乳糖 D 海藻糖 D 氨基葡萄糖酸 丙酸 L 天門冬酰胺 D 絲氨酸 2 3 丁二醇 3 糊精 L 海藻糖 D 阿洛酮糖 檸檬酸 丁酮酸 葡糖醛酰胺 L 亮氨酸 尿苷 9 金盞花醇 乳果糖 松二糖 D 葡萄糖醛酸 奎寧酸 L 天冬氨酸 L 絲氨酸 丙三醇 4 淀粉 D 半乳糖 D 棉子糖 蟻酸 酮戊二酸 氨基丙酰胺 L 鳥氨酸 胸苷 10 L 阿拉伯糖 麥芽糖 木糖醇 羥丁酸 D 砂糖酸 L 谷氨酸 L 蘇氨酸 D L 吲哚甘油磷酸 5 吐溫40 龍膽二塘 L 鼠李糖 D 半乳糖酸內(nèi)酯 氧代戊酸 D 丙氨酸 L 苯丙氨酸 苯乙胺 11 D 阿拉伯醇 D 甘露醇 丙酮酸甲酯 羥丁酸 癸二酸 甘氨酰 L 天冬氨酸 D L 肉毒堿 葡萄糖1 磷酸鹽 6 吐溫80 D 葡萄糖 D 山梨醇 D 半乳糖醛酸 D L 乳酸 L 丙氨酸 L 脯氨酸 腐胺 12 2 纖維素二塘 D 甘露醇 單甲琥珀酸 g 羥丁酸 丁二酸 甘氨酰 L 谷氨酸 g 氨基丁酸 葡萄糖6 磷酸鹽 張 榮 琴 等 云 南 藍(lán) 莓 根 癌 病 病 原 鑒 定 及 其 防 控 藥 劑 的 篩 選 121中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 1 6 3 試驗(yàn)方法 1 藥 劑 施 用 方 法 選 擇 基 地 中 發(fā) 病 嚴(yán) 重 的 藍(lán) 莓 植 株 進(jìn) 行 藥 劑 試 驗(yàn) 共9 個(gè) 處 理 8 個(gè) 藥 劑 處 理 1 個(gè) 空 白 處 理 每 個(gè) 處 理30 株 藍(lán) 莓 供 試 藥 劑 稀 釋 至 相 應(yīng) 濃 度 表3 每 隔10 天 灌 根1 次 每 株 每 次 灌1000mL 共 灌 根5 次 2 試驗(yàn)結(jié)果調(diào)查及統(tǒng)計(jì)方法 坐 果 率 調(diào) 查 花 期 結(jié) 束 后 每 隔15 天 調(diào) 查1 次 坐 果 情 況 直 至 果 實(shí) 子 房 膨 大 成 形 不 再 出 現(xiàn) 生 理 落 果 為 止 坐果 率 子房 膨 大果實(shí)總數(shù) 單花總 數(shù) 10 0 1 田 間 藥 劑 防 效 評 估 最 后 一 次 灌 根10 天 后 進(jìn) 行 病 情 調(diào) 查 每 個(gè) 小 區(qū) 隨 機(jī) 選 取5 株 藍(lán) 莓 進(jìn) 行 調(diào) 查 3 次 生 物 學(xué) 重 復(fù) 依 據(jù) 根 瘤 情 況 進(jìn) 行 分 級 表4 按 照 式 2 4 計(jì)算各處理的發(fā)病率 病情指數(shù)以及防效 發(fā)病率 調(diào) 查病株數(shù) 調(diào) 查總株數(shù) 10 0 2 病情指 數(shù) 病級株 數(shù) 該 級代表數(shù) 總株 數(shù) 最高級 代表數(shù)值 10 0 3 防效 1 A B D C 1 00 4 式 中 A 為 試 驗(yàn) 區(qū) 處 理 后 的 病 情 指 數(shù) B 為 試 驗(yàn) 區(qū) 處 理 前 的 病 情 指 數(shù) C 為 對 照 區(qū) 處 理 后 的 病 情 指 數(shù) D 為 對 照區(qū)處理前的病情指數(shù) 2 結(jié)果與分析 2 1 田間癥狀 藍(lán)莓根部腫瘤早期呈圓形 黃白色 后期瘤體慢慢 變 大 并 由 黃 褐 色 變 為 暗 褐 色 根 部 腫 瘤 傾 向 于 木 質(zhì) 化 表 皮 粗 糙 近 圓 形 或 不 規(guī) 則 直 徑 可 達(dá)2 3 cm 嚴(yán) 重 可 達(dá)10 15cm 田 間 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) 根 癌 發(fā) 病 早 期 在 苗 木 根 部 形 成 較 小 的 白 色 或 者 肉 色 粗 糙 瘤 狀 物 圖 1D 感 染 根 癌 病 后 植 物 根 部 吸 收 水 分 及 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 受阻 根系發(fā)育不良 發(fā)病后期 植株生長緩慢 葉片變 黃 干枯甚至整株死亡 12 2 2 致病性測定 2 2 1 向 日 葵 番 茄 接 種 試 驗(yàn) 20 株 供 試 菌 株 接 種 向 日 葵 幼 苗2 周 后 接 種P2 2 L 3 L 11 L 5 的 向 日 葵 在 莖 基 部 開 始 出 現(xiàn) 不 規(guī) 則 的 瘤 狀 突 起 接 種 其 他 菌 株 的 向 日 葵 和 對 照 無 瘤 狀 突 起 圖2A 接 種30 天 后 瘤 狀 突 起 逐 漸 增 大 形 成 明 顯 腫 瘤 接 種L 11 的 植 株 瘤 狀 突 起 最 大 其 余16 株 菌 株 和 對 照 仍 無 瘤 狀 突 起 L 11 接 種 番茄幼苗14 天后 接種部位出現(xiàn)瘤狀突 起 圖2B 從 接 種 發(fā) 病 部 位 重 新 分 離 病 原 菌 獲 得 純 培 養(yǎng) 物 通 過 菌 株 形 態(tài) 學(xué) 特 征 判 斷 分 離 得 到 的 病 菌 與 原 接 種 菌 株 相 同 2 2 2 藍(lán) 莓 植 株 回 接 試 驗(yàn) L 11 灌 根 藍(lán) 莓60 天 后 在 接 種 植 株 根 部 形 成 不 規(guī) 則 的 結(jié) 節(jié) 狀 突 起 對 照 植 株 的 接 種 部 位 無 瘤 狀 突 起 90 天 后 瘤 狀 突 起 逐 漸 增 大 形 成 明顯的冠癭瘤 圖3B 對照植株無腫瘤形成 圖3A 2 3 病原菌鑒定 2 3 1 Biolog 生 理 生 化 鑒 定 將L 11 菌 懸 液 接 種 到 Biolog 革 蘭 氏 陰 性 菌 微 孔 板 GN 中 4 24 48 h 后 分 別 測 定 其 對 碳 氮 源 的 利 用 情 況 并 與 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 進(jìn) 行 比 較 L 11 與 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 放 射 根 瘤 菌 土 壤 桿 菌 屬 Rhizobium radiobacter Agrobacetrum sp 相 似 程 度 較 高 表5 碳 源 氮 源 利 用 情 況 完 全 相 同 均 不 能 利 用 亞 甲 基 丁 二 酸 E2 氧 代 戊 酸 E5 D 絲 氨 酸 G8 表 4 根癌病分級標(biāo)準(zhǔn) 表 3 藥劑施用濃度 藥劑 化學(xué)藥劑 50 氯溴異氰尿酸粉劑 1 5 噻霉酮水乳劑 葉斑寧 1 申嗪霉素懸浮劑 稀釋比例 1 2000 1 2000 1 50 1 1500 藥劑 生物菌劑 枯草芽孢桿菌 13 6 WR13 6 C3 稀釋比例 1 200 1 30 1 10 1 30 級別 級 級 級 級 分級標(biāo)準(zhǔn) 健康 有1 5 個(gè)冠癭瘤植株生長基本正常 瘤子在5 個(gè)以上根莖部冠癭瘤占相應(yīng)段周面積1 3 瘤子在較多并愈合成片根莖部冠癭瘤占相應(yīng)段周面積1 3 代表數(shù)值 0 1 2 3 122A 不同菌株接種向日葵產(chǎn)生的癥狀 B L 11 接種番茄產(chǎn)生的癥狀 圖 2 L 11 致病性檢測 A 接種滅菌水后藍(lán)莓根部 B 接種L 11 后藍(lán)莓根部 圖 3 L 11 接種藍(lán)莓幼苗的癥狀 A 田間藍(lán)莓健康植株 B 田間藍(lán)莓健康根部 C 田間藍(lán)莓發(fā)病植株 D 田間發(fā)病藍(lán)莓根部形態(tài) 圖 1 田間藍(lán)莓發(fā)病癥狀 張 榮 琴 等 云 南 藍(lán) 莓 根 癌 病 病 原 鑒 定 及 其 防 控 藥 劑 的 篩 選 B A A B A B C D 123中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 2 3 2 分子生物學(xué)鑒定 1 16S rDNA 分 子 鑒 定 以L 11 基 因 組DNA 為 模 板 用16S rDNA 通 用 引 物27F 1492R 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 約1500bp L 1116SrDNA 測 序 序 列 登 錄 號MK910214 1 進(jìn) 行BLAST 比 對 與 根 癌 土 壤 桿 菌 Agrobacterium tumefaciens Ell 7 序 列 登 錄 號 FJ613554 1 相 似 度 達(dá) 到97 65 將L 11 的16S rDNA 序列與其他農(nóng)桿菌屬的序列進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹 圖4 表 明L 11 與 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株Ell 7 親 緣 關(guān) 系 最 近 因 此 云 南 省 藍(lán) 莓 根 癌 病 的 病 原 菌 鑒 定 為 根 癌 土 壤 桿 菌 Agrobacterium tumefaciens 2 特 異 性 引 物 擴(kuò) 增 結(jié) 果 圖5 利 用 根 癌 土 壤 桿 菌 特 異 性 引 物AtP3F AtP3R 對L 11 2JK11 1 BT 186 1 BT 22 2 BT 19 RG 4 基 因 組DNA 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 L 11 擴(kuò) 增 出155bp 的 特 異 性 片 段 其 他 菌 株 均 未 表 5 L 11 菌株在 Biolog GN 微板中的代謝活性 195 mm 132 mm 96 96 dpi 編號 A B C D E F G H 1 0 296 534 258 281 635 526 2 372 330 307 718 163 345 526 423 3 391 469 523 525 439 435 4 374 532 454 794 589 574 5 424 575 610 797 41 6 444 573 422 762 568 544 607 7 457 464 603 849 464 704 539 8 387 540 601 573 297 861 42 430 9 352 506 523 471 675 777 530 425 10 352 334 376 591 402 433 11 391 310 289 310 452 319 397 12 493 384 216 276 366 584 375 553 注 表 格 中 為 數(shù) 字 表 明 反 應(yīng) 陽 性 說 明 該 菌 株 可 以 利 用 表 格 中 為 數(shù) 字 表 明 陰 性 反 應(yīng) 說 明 菌 株 不 能 利 用 表 格 中 為 說 明 反 應(yīng) 在 陰 陽 之 間 圖 4 基于 16 S rDNA 序列的藍(lán)莓根癌病原菌相關(guān)種系統(tǒng)發(fā)育樹 1 為DL2000Marker 2 為L 11 3 為2JK11 4 為1 BT 186 5 為1 BT 22 6 為2 BT 19 7 為RG 4 圖 5 特異性引物 AtP 3F AtP 3R 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 124擴(kuò)增出條帶 可將L 11 鑒定為根癌土壤桿菌 2 4 田間藥劑篩選 藥 劑 篩 選 結(jié) 果 表6 表 明 1 5 噻 霉 酮 水 乳 劑 防 治 效 果 最 好 52 1 申 嗪 霉 素 懸 浮 劑 C3 生 防 菌 劑 50 氯 溴 異 氰 尿 酸 粉 劑 防 治 效 果 次 之 分 別 為48 45 43 3 結(jié)論 本研究對云南省藍(lán)莓主產(chǎn)區(qū)采集的藍(lán)莓根癌病樣 品 進(jìn) 行 病 原 菌 的 分 離 培 養(yǎng) 通 過 致 病 性 測 定 和 多 種 分 類 鑒 定 方 法 證 實(shí) 云 南 發(fā) 生 的 藍(lán) 莓 根 癌 病 是 由 根 癌 土 壤 桿 菌 所 致 并 篩 選 出 對 藍(lán) 莓 根 癌 病 有 較 好 防 治 效 果 的 藥 劑1 5 噻 霉 酮 水 乳 劑 為 進(jìn) 一 步 開 展 有 關(guān) 該 病 發(fā) 病規(guī)律及防治技術(shù)的系統(tǒng)研究提供科學(xué)依據(jù) 4 討論 根 癌 病 菌 可 侵 染93 科331 屬643 種 植 物 包 括 多 種 果 樹 林 木 花 卉 甚 至 瓜 類 造 成 嚴(yán) 重 的 經(jīng) 濟(jì) 損 失 15 根 癌 病 病 原 菌 較 多 包 括 土 壤 桿 菌 屬 異 根 瘤 菌 屬 和 根 瘤 菌 屬 的 多 個(gè) 種 2 土 壤 桿 菌 屬 和 根 瘤 菌 屬 的 關(guān) 系 一 直 存 在 爭 議 有 學(xué) 者 提 出 按 照16SrDNA 序 列 分 析 可 將 土 壤 桿 菌 屬 Agrobacterium 和 異 根 瘤 菌 屬 Allorhizobium 歸 為 根 瘤 菌 屬 Rhizobium 16 但 也 有 學(xué) 者 發(fā) 現(xiàn) 根 瘤 菌 屬 Rhizobium 中 個(gè) 別 種 與 土 壤 桿 菌 屬 的 關(guān) 系 不 是 很 密 切 不 能 籠 統(tǒng) 地 說 土 壤 桿 菌 和 根 瘤 菌 的 關(guān) 系 較 近 而 應(yīng) 該 深 入 研 究 土 壤 桿 菌 與 根 瘤 菌 的 種 間 關(guān) 系 17 土 壤 桿 菌 屬 與 根 瘤 菌 屬 的 鑒 別 標(biāo) 準(zhǔn) 之 一 是 病 菌 引 起 致 病 癥 狀 還 是 引 起 根 瘤 18 本 研 究 分 離 得 到 的 注 表中數(shù)據(jù)含有相同字母者表示差異不顯著 P 0 05 新復(fù)極差檢驗(yàn) 表 6 藍(lán)莓根癌病田間藥劑試驗(yàn)防治結(jié)果 處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9 藥劑 50 氯溴異氰尿酸粉劑 1 5 噻霉酮水乳劑 1 申嗪霉素懸浮劑 葉斑寧水劑 WR13 6 13 6 C3 枯草芽孢桿菌 CK 坐果率 53 21ab 54 63a 52 58ab 48 35b 50 13ab 48 25b 51 37ab 49 96ab 42 58c 發(fā)病率 51 28g 45 85i 55 23f 69 56c 68 33d 73 87b 48 33h 66 67e 85 53a 病情指數(shù) 39 64f 33 7i 36 17h 49 88b 40 24e 46 53d 38 64g 47 28c 69 88a 防效 43cd 52a 48b 29f 42d 33e 45c 32e 菌 株P(guān)2 2 L 3 L 11 L 5 都 會 引 起 藍(lán) 莓 根 部 腫 瘤 說 明 這4 株菌歸類至土壤桿菌屬 根 癌 病 菌 通 過 傷 口 侵 染 植 物 T DNA 在 寄 主 植 物 中表達(dá) 編碼生長素和細(xì)胞分裂素的生物合成 使植物 細(xì) 胞 增 殖 失 控 導(dǎo) 致 腫 瘤 的 形 成 19 化 學(xué) 農(nóng) 藥 防 治 效 果 并 不 顯 著 持 效 性 差 20 1 5 噻 霉 酮 水 乳 劑 防 治 效 果 較 好 但 相 對 防 效 也 僅 為52 目 前 生 物 防 治 研 究 發(fā) 展 較 快 R rhizogenesK84 商 品 名 根 癌 寧 可 有 效 防 治 桃 根 癌 病 21 K84 是Kerr 于1972 年 發(fā) 現(xiàn) 的 一 株 無 致 瘤 性 的 發(fā) 根 根 瘤 菌 22 主 要 作 用 方 式 是 接 合 質(zhì) 粒pAgK84 編 碼 產(chǎn) 生 土 壤 桿 菌 素84 進(jìn) 而 殺 滅 細(xì) 菌 23 另 外 放 射 土 壤 桿 菌M I 15 也 能 有 效 抑 制 葡 萄 根 癌 菌 的 生 長 和 致 瘤 24 還 有 無 致 病 性 的 葡 萄 土 壤 桿 菌E26 菌 株 對 葡 萄 根 癌 病 具 有 良 好 防 效 25 目 前 生 產(chǎn) 上 可 在 施 用 藥 劑 的同時(shí) 采用植物檢疫 苗木 砧木消毒 及時(shí)清除田間 病株 選育抗病品種 改進(jìn)嫁接方式等手段進(jìn)行綜合治 理 控制藍(lán)莓根癌病的發(fā)生 以實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù) 發(fā)展 參考文獻(xiàn) 1 常 福 蘭 鄭 婉 霞 漢 翠 藍(lán) 莓 的 生 物 學(xué) 特 性 和 保 健 作 用 及 市 場 前 景 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013 2 160 161 2 楊 燕 林 和 志 嬌 王 朝 文 等 云 南 藍(lán) 莓 病 蟲 害 調(diào) 查 及 防 治 方 法 J 植物保護(hù) 2014 40 4 153 156 197 3 Kuzmanovi Nemanja Pu awska Joanna Evolutionary Relatedness and Classification of Tumor Inducing and Opine Catabolic Plasmids in Three Rhizobium rhizogenes Strains Isolated from the Same Crown Gall Tumor J Genome Biology and Evolution 2019 11 6 4 崔 進(jìn) 國 鄭 廣 存 果 樹 根 癌 病 的 發(fā) 生 與 防 治 J 煙 臺 果 樹 2006 3 41 42 5 Alippi A M Lopez A C Balatti PA First Report of Agrobacterium rubi and A rhizogenes Causing Crown and Root Gall and Hairy RootonBlueberryinArgentina J PlantDisease 2010 94 8 張 榮 琴 等 云 南 藍(lán) 莓 根 癌 病 病 原 鑒 定 及 其 防 控 藥 劑 的 篩 選 125中國農(nóng)學(xué)通報(bào) 6 傅 俊 范 彭 超 嚴(yán) 雪 瑞 等 藍(lán) 莓 根 癌 病 發(fā) 生 調(diào) 查 及 病 原 鑒 定 J 吉 林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2011 33 3 283 286 292 7 趙 小 蘭 趙 梁 軍 月 季 根 癌 病 病 原 菌 分 離 及 抗 病 資 源 初 步 篩 選 J 植物保護(hù) 2006 6 54 58 8 陳 曉 英 相 望 年 我 國 啤 酒 花 根 癌 土 壤 桿 菌 的 初 步 研 究 J 微 生 物 學(xué)報(bào) 1987 27 1 10 16 9 尹 向 田 魏 彥 鋒 徐 亮 等 葡 萄 根 癌 病 病 原 菌 的 篩 選 及 鑒 定 J 農(nóng) 學(xué)學(xué)報(bào) 2019 9 2 24 30 1