植物病理學(xué)報(bào) Acta Phytopathologica Sinica ISSN 0412 0914 CN 11 2184 Q 植物病理學(xué)報(bào) 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)論文 題目 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 作者 彭夢林 何依璐 姚博 魏方俊 張晉豪 邱玥 姬廣海 DOI 10 13926 ki apps 001033 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期 2023 12 07 引用格式 彭夢林 何依璐 姚博 魏方俊 張晉豪 邱玥 姬廣海 云南省草莓角斑 病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) J OL 植物病理學(xué)報(bào) https doi org 10 13926 ki apps 001033 網(wǎng)絡(luò)首發(fā) 在編輯部工作流程中 稿件從錄用到出版要經(jīng)歷錄用定稿 排版定稿 整期匯編定稿等階 段 錄用定稿指內(nèi)容已經(jīng)確定 且通過同行評議 主編終審?fù)饪玫母寮?排版定稿指錄用定稿按照期 刊特定版式 包括網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)版式 排版后的稿件 可暫不確定出版年 卷 期和頁碼 整期匯編定稿指出 版年 卷 期 頁碼均已確定的印刷或數(shù)字出版的整期匯編稿件 錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)稿件內(nèi)容必須符合 出 版管理?xiàng)l例 和 期刊出版管理規(guī)定 的有關(guān)規(guī)定 學(xué)術(shù)研究成果具有創(chuàng)新性 科學(xué)性和先進(jìn)性 符合編 輯部對刊文的錄用要求 不存在學(xué)術(shù)不端行為及其他侵權(quán)行為 稿件內(nèi)容應(yīng)基本符合國家有關(guān)書刊編輯 出版的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 正確使用和統(tǒng)一規(guī)范語言文字 符號 數(shù)字 外文字母 法定計(jì)量單位及地圖標(biāo)注等 為確保錄用定稿網(wǎng)絡(luò)首發(fā)的嚴(yán)肅性 錄用定稿一經(jīng)發(fā)布 不得修改論文題目 作者 機(jī)構(gòu)名稱和學(xué)術(shù)內(nèi)容 只可基于編輯規(guī)范進(jìn)行少量文字的修改 出版確認(rèn) 紙質(zhì)期刊編輯部通過與 中國學(xué)術(shù)期刊 光盤版 電子雜志社有限公司簽約 在 中國 學(xué)術(shù)期刊 網(wǎng)絡(luò)版 出版?zhèn)鞑テ脚_上創(chuàng)辦與紙質(zhì)期刊內(nèi)容一致的網(wǎng)絡(luò)版 以單篇或整期出版形式 在印刷 出版之前刊發(fā)論文的錄用定稿 排版定稿 整期匯編定稿 因?yàn)?中國學(xué)術(shù)期刊 網(wǎng)絡(luò)版 是國家新聞出 版廣電總局批準(zhǔn)的網(wǎng)絡(luò)連續(xù)型出版物 ISSN 2096 4188 CN 11 6037 Z 所以簽約期刊的網(wǎng)絡(luò)版上網(wǎng)絡(luò)首 發(fā)論文視為正式出版 植物病理學(xué)報(bào) ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 研究論文 doi 10 13926 ki apps 001033 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 彭夢林 1 何依璐 姚 博 魏方俊 張晉豪 邱 玥 姬廣海 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650201 摘要 草莓角斑病是云南近幾年發(fā)生的重要細(xì)菌病害之一 本實(shí)驗(yàn) 通過從病斑處分離得到的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài) 學(xué) 生理生化 致病性檢測 16S rDNA hrpB 基因分子鑒定 鑒定其中 1 株分離菌為草莓黃單胞菌 Xanthomonas fragariae 生理生化指標(biāo)檢測表明 致病菌能利用 D 麥芽糖 D 海藻糖 D 纖維二糖 蔗糖 D 松二糖等碳源 26 種 能與萘啶酮酸 林肯霉素等 7 種化學(xué)敏感物質(zhì)反應(yīng) 致病菌鹽耐受性弱 對酸敏感 能利用 L 乳酸 檸檬酸等有機(jī)酸 不同草莓品種對草莓黃單胞菌的抗性鑒定結(jié)果表明 紅顏 和 甜查理 為高抗品種 病情指數(shù)分別為 5 95 和 4 76 高抗品種占比為 14 28 中抗品種為 波特拉 全明星 越秀 白雪公主 京藏香 香野 中抗品種占比為 42 85 本研究明確了 草莓角斑病病原菌 提供了部分草莓品種抗性信息 以期為深入研究該病害發(fā)生規(guī)律 防治提供理論依據(jù) 關(guān)鍵詞 草莓 病原菌分離鑒定 草莓黃單胞菌 抗性評價(jià) Isolation identification and resistance evaluation of strawberry angular leaf spot pathogen in Yunnan Province PENG Menglin HE Yilu YAO Bo WEI Fangjun ZHANG Jinhao QIU Yue JI Guanghai State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio Resources in Yunnan Yunnan Agricultural University Kunming 650201 China Abstract Strawberry angular leaf spot is one of the important bacterial diseases in Yunnan in recent years In this study a bacterial strain isolated from the strawberry leaf lesion was identified as Xanthomonas fragariae based on morphological physiological and biochemical analysis pathogenicity detection as well as the phylogenetic analysis of the 16S rDNA and hrpB genes The physiological and biochemical detection showed that the pathogenic bacterium could utilize 26 carbon sources such as D maltose D trehalose D cellobiose sucrose and D pintobiose It can react with seven chemical sensitive substances such as nalidixic acid and lincomycin The pathogenic bacterium had weak salt tolerance sensitive to acid and could use organic acids such as L lactic acid and citric acid The disease resistance evaluation experiment showed that Benihoppeand and Sweet Charlie were highly 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金 32260701 云南省科技廳基礎(chǔ)研究專項(xiàng) 重點(diǎn)項(xiàng)目 202201AS070313 通訊作者 姬廣海 博士 教授 研究方向?yàn)橹参锊『ι锓揽匮芯?Email jghai001 第一作者 彭夢林 碩士研究生 研究方向?yàn)橹参锊『ι锓揽匮芯?Email 1355306842 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間 2023 12 07 11 50 52 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 2 resistant varieties with disease indexes of 5 95 and 4 76 respectively and the proportion of highly resistant varieties was 14 28 The moderately resistant varieties included Portola All star Yuexiu Snow White Jingzangxiang and Xiangye and the proportion of moderately resistant varieties was 42 85 In conclusion we identified the pathogenic bacterium of strawberry angular leaf spot and obtained several disease resistant strawberry varieties through screening These results laid a foundation for further research on the characteristics of disease occurrence and prevention methods Keywords strawberry isolation and identification of pathogens Xanthomonas fragariae resistance evaluation 0 引言 草莓 Fragaria ananassa Duch 屬于薔薇科 Rosaceae 薔薇亞科 Rosoideae 草莓屬 Fragria 多年生草本 為喜光植物 但又有較強(qiáng)的耐蔭性 在世界范圍內(nèi)廣泛種植 因其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng) 具有 促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的重要價(jià)值 成為世界上最受歡迎的經(jīng)濟(jì)作物之一 1 草莓角斑病是由草莓黃單胞菌 Xanthomonas fragariae 引起的一種病害 草莓黃單胞菌 屬于薄壁菌門 Gracilicutes 假單胞菌科 Pseudomonaceae 黃單胞菌屬 Xanthomonas 是一種系統(tǒng)性病原體 主要定殖在葉肉組織 能造成 維管束系統(tǒng)受損 使葉片出現(xiàn)萎焉和塌陷 2 3 在草莓農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中日益成為一個(gè)難題 該病 1959 年首先在 美國明尼蘇達(dá)州發(fā)現(xiàn) 隨后此病迅速擴(kuò)散 被歐洲和地中海植物保護(hù)組織 EPPO 列為歐洲種植種群的 A2 國際檢疫病原體 4 5 在疾病發(fā)展的早期階段 草莓角斑病的癥狀是葉片背面可見水浸狀角斑 受到葉脈限 制形成不規(guī)則斑點(diǎn) 用透射光觀察時(shí) 斑點(diǎn)是半透明的 病斑隨著時(shí)間擴(kuò)大 變紅褐色 嚴(yán)重時(shí)病斑合并 葉片壞死 在高濕度和超過 20 的溫度條件下 觀察到病變處有粘稠的細(xì)菌滲出液 干燥條件下呈薄膜狀 6 有研究報(bào)道 草莓黃單胞菌 X fragariae 的最佳生存溫度條件為 20 超過 32 病菌會死亡 能在草 莓殘?bào)w中長期存在 單獨(dú)在土壤里存活的時(shí)間很短 7 8 現(xiàn)在歐洲大多地區(qū) 北美洲 非洲 大洋洲 亞洲等部分地區(qū)均有此病的報(bào)道 9 10 在我國 草莓黃單 胞菌已經(jīng)被列入 2007 年 中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄 11 其引起的草莓病害在 2020 年我國臺灣首次發(fā)現(xiàn) 且該病害在天津 上海 云南也有發(fā)生 12 14 當(dāng)草莓被草莓黃單胞菌侵染后其產(chǎn)量 會下降 75 80 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 15 生產(chǎn)上 草莓角斑病的防治主要是使用殺菌劑 可以在一定程 度上控制和減少該病害的危害 然而化學(xué)農(nóng)藥的大面積使用致使生態(tài)和食品安全問題頻繁發(fā)生 所以發(fā)現(xiàn) 和挖掘抗性基因資源并培育抗病品種是有效控制疾病的策略之一 該病害的發(fā)病率在草莓品種間存在差異 表明草莓品種對草莓角斑病的敏感性存在差異 MAAS J L 16 測試 草莓基因型 發(fā)現(xiàn) 2 種基因型 1 種來自明 尼蘇達(dá)州的原生深紅莓 弗吉尼亞 草 莓 和 1 種 弗州草莓鳳梨草莓 雜交種 被發(fā)現(xiàn)能夠抵抗 草莓黃單 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 3 胞菌 的感染 森林草莓 對草莓角斑病具有較高抗性 HAZEL 17 發(fā)現(xiàn)免疫草莓角斑病的草莓品種是 六倍 體 的 麝香草莓 F moschata Duch 其他草莓 品種表現(xiàn)中等抗性 但 麝香草莓 僅分布于歐洲 18 我國主抗草莓角斑病的品種或種質(zhì)資源匱乏 因此需 發(fā)掘優(yōu)質(zhì)抗性資源緩解草莓角斑病的蔓延 本實(shí)驗(yàn)室從云南曲靖發(fā)現(xiàn)在草莓葉片上大量浸染引起草莓生產(chǎn)上難題的 1 種細(xì)菌性病害 從將采集的 樣品中分離純化得到菌落呈透明 水潤 圓形的細(xì)菌 經(jīng)生理生化測定 形態(tài)學(xué)觀察 分子鑒定 以及 致病 性測定 明確該細(xì)菌的分類地位 并評價(jià)該病原菌對不同草莓品種的致病力差異 以期對防治該細(xì)菌病害 的大面積發(fā)生和流行提供理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 樣品采集 2021 年采自云南省曲靖市會澤縣草莓種植地區(qū)的草莓角斑病病葉 1 2 供試培養(yǎng)基 WBN Wilbrinck N 10 g L 1 蔗糖 5 g L 1 蛋白胨 Oxoid 公司 0 5 g L 1 K2HPO4 Sigma 公司 0 25 g L 1 MgSO4 7H2O Sigma 公司 0 25 g L 1 NaNO3 Sigma 公司 pH 7 0 7 2 1 3 病原菌的分離純化與 形態(tài)學(xué)觀察 使用組織分離法 將樣品用 75 C2H5OH 表面消毒 60 s 用無菌水沖洗 3 次 用無菌吸水紙吸干水分 將病健交接處病斑剪成均勻大小的碎片 放 于裝有 10 mL 無菌水的三角瓶中 150 r min 1 培養(yǎng) 15 min 10 倍梯度稀釋后吸取 100 L 涂布在 WBN 平板上 于 26 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d 左右 然后挑取單菌落劃 線純化培養(yǎng) 2 代 得到 16 株形態(tài)完全一樣的分離菌株 1 4 病原菌 致病性測定 1 4 1 噴霧接種 采用本地草莓品種 蒙特瑞 作為接種材料 用手持細(xì)霧噴霧器 Boston Round Bottle U S Plastic Corp Lima OH 將 16 株細(xì)菌的水懸浮液 108 CFU mL 1 小心地噴灑在草莓嫩葉的背面 直 到徑流 屏蔽其他的植物組織 以防止接種的葉片接觸到植物的其他部分 在 2 次接種之間佩戴一次性手 套 以無菌水 噴灑 作為 對照 每處理接種 5 株 重復(fù) 5 次 將所有植株置于光照培養(yǎng)箱中 記錄發(fā)病情況 1 4 2 針刺接種 將 16 株細(xì)菌 的水懸浮液 108 CFU mL 1 使用無菌針管 針刺草莓新葉葉片背面 每 次 接種處理 5 株 用水做對照接種 在接種 7 d 后觀察記錄 1 4 3 滲壓接種 將 16 株細(xì)菌 的水懸浮液 108 CFU mL 1 使用無針注射器按壓 在 新葉葉脈間 每次接種 處理 5 株 用水做對照接種 在 接種 7 d 后 觀察記錄 1 4 4 摩擦接種 使用無菌石英砂適量摩擦葉片背面 然后 將 16 株細(xì)菌 的水懸浮液 108 CFU mL 1 使用 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 4 無菌棉涂布在葉片背面 每次接種處理 5 株 用水做對照接種 在 接種 7 d 后 觀察記錄 選取一株致病性 較強(qiáng)的菌株編號為 YM2 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn) 1 5 病原菌生理生化鑒定 將病原菌菌株在 WBN 板上劃線純化 2 代 再挑取單菌落在 Biolog 專業(yè)培養(yǎng)基 BUG 板上劃線純化培 養(yǎng) 2 代 使用無菌棉簽在培養(yǎng)基上輕輕蘸取菌落接種到 IF A 接種液中 混勻 用濁度儀檢測濁度在 90 98 T 倒入 V 型貯液槽 用八道移液器吸取 150 L 菌懸液接種于 GEN 鑒定板 對照孔 A1 加入等量的 1 生理鹽水 然后封口后放置于 26 培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng) 采用 Biolog 公司的 MicrostationTM V4 01 系統(tǒng)進(jìn)行 致病菌生理生化測定 20 1 6 病原菌分子鑒定 使用細(xì)菌總 DNA 提取試劑盒 天根生化科技有限公司 提取 YM2 的 DNA 采用細(xì)菌 通用 鑒別基因 16S rDNA 以及 草莓黃 單胞 菌 特異性 引物 對該菌 株 進(jìn)行擴(kuò)增測序 對應(yīng)的引物分別是 27F 1492R XF F XF R 19 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化測序后在 NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 Blast 比對 挑選比對相似性高的序列 采用 MEGA 7 0 26 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 分析同源性關(guān)系較近的菌株以確定 YM2 的分類地位 1 7 不同草莓品種對草莓角斑病抗性鑒定 1 7 1 草莓品種 供試品種選取云南種植面積較多的 14 個(gè)品種 基本信息見表 1 Table 1 Basic information of 14 strawberry varieties Varieties Genetic background Origin Yuexiu China Benihoppe Akihime Sachinoka China Fenyu No 2 China Sweet Charlie F180 456 Pajaro United states Monterey Albion Cal97 85 6 United states Akihime Jiunengzaosheng Nyoho Japan Portola Cal97 93 cal97 209 1 United states San Andreas Albion Cal97 86 1 United states Snow White China Jingzangxiang Earlibrite Benihoppe Japan Yanli 08 A 01 Tochiotome Europe All star United states Kinuama Europe Xiangye Japan Note Not reported 1 7 2 植株噴霧法抗性鑒定 盆栽法抗性鑒定參考 FU 21 方法 選取具有 4 葉 1 心的健康草莓植株 采用噴 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 5 霧法將濃度為 108 CFU mL 1 OD620 1 的草莓黃單胞菌懸浮液分別均勻噴霧接種于 不同草莓品種葉片上 噴霧時(shí)間和壓強(qiáng)分別為 60 s 0 1 MPa 噴霧時(shí)使葉片背面菌懸液徑流 每盆接種 3 枝 每品種 3 次重復(fù) 接種后盆栽草莓放于溫室大棚 7 d 14 d 21 d 后調(diào)查 葉片發(fā)病情況 可將抗病程度分為免疫 1 00 高抗 0 80 0 99 中抗 0 40 0 79 中感 0 20 0 39 高感 0 20 5 種類型 病情 嚴(yán)重程度分級標(biāo)準(zhǔn)參考 Wolf J M 22 的分級方法 相對病情指數(shù) 供試草莓品種病情指數(shù) 供試草莓品種最高病情指數(shù) 相對抗病指數(shù) 1 相對病情指數(shù) 2 結(jié)果與分析 2 1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 病原菌 YM2 在 WBN 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 初始菌落呈現(xiàn)透明 水潤 圓形單菌落 72 h 后形成 黃色 圓形的 單菌落 菌落表面濕潤光滑且粘稠 邊緣清晰 革蘭氏染色為紅色短桿狀 屬于革蘭氏陰性菌 Fig 1 Bacterial morphological characterization A Colonies formed on WBN plate B Gram staining 2 2 病原菌致病性測定 草莓角斑病田間病癥表現(xiàn)為葉片背面可見水浸 狀角斑 受到葉脈限制形成不規(guī)則斑點(diǎn) 病 斑隨 著 時(shí)間 擴(kuò)大 變 紅褐 色 嚴(yán)重時(shí)病斑合并 葉片壞死 圖 2 A B 發(fā)病嚴(yán)重導(dǎo)致植株花蕾枯死 嚴(yán)重影響草莓 產(chǎn)量 室內(nèi)分離得到 16 株細(xì)菌菌株通過摩擦 噴霧 滲壓與針刺 4 種方法回接 圖 2 C H 健康草莓葉片 其中致病菌代表菌株 YM2 的發(fā)病情況如 圖 2 C H 所示 在 7 10 d 后表現(xiàn)與田間相同的水漬狀病癥 符合柯赫氏法則 具體表現(xiàn)為在 溫度 25 濕度 75 以上發(fā)病較重 當(dāng)溫濕度適宜時(shí) 發(fā)病部位會出現(xiàn) 菌膿覆蓋 后形成菌膜 接種 4 wpi week post inoculation 左右病部變褐 葉片會出現(xiàn)褪色失綠 在侵染 4 5 wpi 葉片頂部和中部出現(xiàn)角狀紅褐色病斑 病斑擴(kuò)大后葉片干枯死亡 不同接種方法病害發(fā)生情況有 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 6 所不同 針刺接種 圖 2 E 8 11 d 出現(xiàn)水漬狀病斑 病斑從針刺部位緩慢擴(kuò)增 病斑不會連成片 滲壓 接種 圖 2 F 的葉片細(xì)菌僅局限于接種位點(diǎn) 接種 1 d 后按壓部位水漬狀致敏反應(yīng)消失 7 d 后出現(xiàn)水漬 狀病斑 細(xì)菌侵染到次級葉脈時(shí)會沿著葉脈擴(kuò)展 摩擦接種 圖 2 G 病原后 6 d 接種部位出現(xiàn)大量水漬狀 病斑 有明顯菌膿和菌膜 形成了明顯的角狀病斑 葉片發(fā)病死亡所需時(shí)間最短 噴霧接種 圖 2 H 11 14 d 葉片邊緣向內(nèi)出現(xiàn)水漬狀病斑數(shù)量遞減 發(fā)病后期也會出現(xiàn)角狀病斑 Fig 2 Pathogenicity of the bacterial isolate YM2 on strawberry A B Disease symptoms in the field C D Symptoms on strawberry leaves two weeks after artificial inoculation of Xanthomonas fragariaeYM2 Disease symptoms on strawberry leaves after stab inoculation E seepage inoculation F friction inoculation G spray inoculation H 2 3 病原菌生理生化鑒定 Biolog 微生物鑒定儀讀板結(jié)果顯示 表 2 陽性反應(yīng) 35 個(gè) 陰性反應(yīng) 7 個(gè) 邊界值 52 個(gè) 碳源利 用測試表明該病原菌能利用 D 麥芽糖 D 海藻糖 D 纖維二糖 蔗糖 D 松二糖等碳源 26 種 能與萘 啶酮酸 林肯霉素等 7 種化學(xué)敏感物質(zhì)反應(yīng) 致病菌鹽耐受性弱 對酸敏感 能利用 L 乳酸 檸檬酸等有 機(jī)酸 菌株 YM2 鑒定結(jié)果中所有黃單胞屬 SIM 值之和為 0 528 只能將菌株 YM2 鑒定為黃單胞菌屬細(xì)菌 Table 2 Metabolic characters of strain YM2 in GENIII microplate Micropore and name Utilization Micropore and name Utilization Micropore and name Utilization Negative control Inosine D glucuronic acid Dextrin Lactate Glucuronamide D maltose Fusidic acid Mucic acid D trehalose D serine Quinic acid 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 7 D cellobiose D sorbitol D saccharic acid Gentiobiose D mannitol Vancomycin Sucrose D arabitol Tetrazolium violet D turanose Myo inositol Tetrazolium blue Stachyose Glycerol p Hydroxy phenylacetic acid Positive control D glucose 6 PO4 Methyl pyruvate pH 6 D fructose 6 PO4 D lactic acid pH 5 D aspartic acid L lactic acid D raffinose D serine Citric acid D lactose Troleandomycin Keto glutaric acid D melibiose Rifamycin SV D malic acid Methyl D glucoside Minocycline L malic acid D salicin Gelatin Bromo succinic acid N acetyl D glucosamine Glycyl L proline Nalidixic acid N acetyl D mannosamine L alanine Lithium chloride N acetyl D galactosamine L arginine Potassium tellurite N acetyl neuraminic acid L aspartic acid Tween 40 1 NaCl L glutamic acid Amino butyric acid 4 NaCl L histidine Hydroxy butyric acid 8 NaCl L pyroglutamic acid Hydroxy D butyric acid D glucose L serine Keto butyric acid D mannose Lincomycin Acetoacetic acid D fructose Guanidine HCl Propionic acid D galactose Niaproof 4 Acetic acid 3 methyl glucose Pectin Formic acid D fucose D galacturonic acid Aztreonam L fucose L galactonic acid lactone Sodium butyrate L rhamnose D gluconic acid Sodium bromate Note Positive Negative Boundary value 2 4 病原菌的分子系統(tǒng)發(fā)育分析 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 8 對病原菌 YM2 的 16S rDNA hrpB 基因進(jìn)行擴(kuò)增后 得到 1 080 bp 528 bp 的序列 分別與 X fragariae xf 52 登錄號 OL655450 1 序列相似度為 99 與 X fragariae PD885 登錄號 LT853882 1 序列相似 性 100 將 16S rDNA hrpB 基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 3 結(jié)果顯示 菌株 YM2 與 X fragariae 的遺 傳關(guān)系最近 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征 Biolog 鑒定與分子鑒定結(jié)果 最終將菌株 YM2 鑒定為草莓黃單胞菌 X fragariae 菌株登錄號為 OP847193 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 9 Fig 3 Construction of 16S rDNA A and hrpB B gene phylogenetic tree based on neighbor joining method 2 5 抗性評價(jià) 接種病原菌后 7 d 14 d 不同草莓品種草莓角斑病均出現(xiàn)不同程度的癥狀 但是不同品種草莓發(fā)病差 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 10 異不顯著 接菌 21 d 后 14 個(gè)草莓品種發(fā)病程度差異明顯 從表 3 可知 紅顏 和 甜查理 品種為高 抗品種 病情指數(shù)分別為 5 95 和 4 76 高抗品種占比為 14 28 中抗品種為 波特拉 全明星 越秀 白雪公主 京藏香 和 香野 中抗品種占比為 42 85 中感品種為 圣安德瑞斯 艷麗 和 鬼努甘 中感品種占比為 21 43 高感品種為 粉玉 2 號 章姬 和 蒙特瑞 病 情指數(shù)在 34 92 以上 高感品種占比為 21 43 Table 3 Resistance test of 14 strawberry varieties to bacterial angular leaf spot Note HR highly resistant MR Moderately resistant MS moderately susceptible HS Highly susceptible In the same column data with different lowercase letters showed significant differences P 0 05 3 結(jié)論與討論 本研究從云南曲靖發(fā)病草莓的葉片上分離得到 YM2 菌株 通過對其 進(jìn)行形 態(tài)學(xué)觀察 生理生化鑒定 特異性基因分子鑒定與致病性測定 發(fā)現(xiàn)菌株 YM2 與 X fragariae 的同源性最高 最終將 YM2 菌株鑒定 為草莓黃單胞菌 X fragariae 經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證 YM2 可導(dǎo)致草莓角斑病的發(fā)生 且與田間采集到 的草莓角斑病癥狀表現(xiàn)一致 表現(xiàn)為葉部出現(xiàn)水漬狀透明斑點(diǎn) 斑點(diǎn)可產(chǎn)生菌膿形成菌膜 發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉 片失綠 病斑合并成角狀或者葉片枯萎死亡 從接種葉片上再次分離得到了相同的致病菌 因此明確草莓 黃單胞菌 YM2 為草莓角斑病的致病菌 有研究表明對草莓角斑病有較好防治效果的植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum PM411 是通過降低 pH 值或產(chǎn)生有機(jī)酸起抑制作用 23 本研究對草莓黃單胞菌 YM2 生理生化測定結(jié)果表明致病菌不耐受鹽 不耐受強(qiáng)酸 能利用 L 乳酸等有機(jī)酸 與其表述的抑菌機(jī) Strawberry varieties Disease index Relative resistant index Resistance evaluation Fenyu No 2 35 71 1 45bc 0 08 0 02e HS Yuexiu 7 14 2 01g 0 49 0 30bc MR Benihoppe 5 95 1 09g 0 85 0 04a HR Sweet Charlie 4 76 2 21g 0 88 0 03a HR Akihime 34 92 1 35b 0 10 0 02e HS Portola 20 63 3 04ab 0 48 0 04bc MR San Andreas 30 95 0 08bc 0 20 0 02de MS Snow White 20 63 1 11f 0 47 0 02bc MR Jingzangxaing 14 29 2 44fg 0 63 0 01b MR All star 15 87 0 33fg 0 60 0 12b MR Yanli 25 00 0 02e 0 36 0 02cd MS Kinuama 30 16 0 06d 0 22 0 02de MS Xiangye 18 30 0 45f 0 53 0 01bc MR Monterey 39 68 1 12a HS 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 11 制結(jié)論一致 從不同接種方式導(dǎo)致草莓角斑病病害發(fā)生嚴(yán)重程度不同 發(fā)現(xiàn)有傷接種 摩擦接種 病原菌侵染速度 較無傷接種 噴霧接種 更快 植株發(fā)生癥狀更嚴(yán)重 特別是接種時(shí)葉脈損傷 能夠促進(jìn)細(xì)菌在維管組織 更廣泛的定植和細(xì)菌從葉片移動到鄰近的葉柄 有研究報(bào)道病原細(xì)菌在葉柄組織上長期存活 所以修剪去 除殘余葉柄組織可以減少草莓角斑病菌的引入田間的初始菌量 3 23 WOLF 和 KASTELEIN 22 24 表明噴霧 接種時(shí) 病原體氣溶膠使周圍的草莓植株具有高度傳染的風(fēng)險(xiǎn) 因此防止高架灌溉和植物組織損傷 能降 低草莓角斑病菌侵染率和向其他健康組織擴(kuò)散的速度 這將有助于更好地防治病害 噴霧接種在高感植物 中表現(xiàn)出很強(qiáng)的病癥發(fā)展 在易感植物中表現(xiàn)出明顯的病損 在中抗植物中表現(xiàn)出輕微的病發(fā) 而在部分 抗性基因型中則不出現(xiàn)或很少出現(xiàn)角斑 噴霧接種誘導(dǎo)典型疾病癥狀的最快速 最可靠的評價(jià)方法 2021 年 9 月云南省首次出現(xiàn)草莓角斑病的發(fā)生 發(fā)病率為 10 20 嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率為 40 14 云南 四季草莓主栽品種為 蒙特瑞 約占四季草莓栽培總面積的 80 其次為 圣安德瑞斯 約占四季草 莓栽培總面積的 14 云南四季草莓栽培面積約為 5 還種植有少量 圣安德瑞斯 波特拉 阿 爾比 和 秋怡 等品種 26 云南省曲靖市待補(bǔ)鎮(zhèn)是夏草莓之鄉(xiāng) 低緯度高海拔地區(qū) 夏季氣候冷涼 病 害調(diào)查結(jié)果表明曲靖市會澤縣草莓角斑病危害嚴(yán)重 單株草莓植株平均發(fā)病率為 55 6 部分高發(fā)地區(qū)發(fā) 病率高達(dá) 100 導(dǎo)致果實(shí)絕收 造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失 雖然草莓角斑病病原體主要影響葉片 但它可以通過 在花萼和花梗上引起水浸狀和壞死病變 直接減少果實(shí)產(chǎn)量高達(dá) 80 也可以通過減少植物初級產(chǎn)量間接 減少果實(shí)產(chǎn)量 15 生產(chǎn)上使用殺菌劑可以在一定程度上控制和減少草莓角斑病的危害 然而化學(xué)農(nóng)藥的大 面積使用致使生態(tài)和食品安全問題頻繁發(fā)生 因此預(yù)防草莓角斑病的最重要因素是種植無病植株和選育抗 病品種 本研究對不同草莓品種對草莓黃單胞菌的抗性篩選 結(jié)果表明 紅顏 和 甜查理 品種為高抗 品種 病情指數(shù)分別為 5 95 和 4 76 高抗品種占比為 14 28 中抗品種為 波特拉 全明星 越 秀 白雪公主 京藏香 和 香野 中抗品種占比為 42 85 中感品種為 圣安德瑞斯 艷 麗 和 鬼努甘 中感品種占比為 21 43 高感品種為 粉玉 2 號 章姬 和 蒙特瑞 高感品 種占比為 21 43 其中抗病品種 全明星 和感病品種 蒙特瑞 與 HILDEBRAND 2 的研究結(jié)果一致 云南是四季草莓 蒙特瑞 栽培面積最大的省份之一 27 這可能是近年來草莓角斑病在云南迅速蔓延的原 因 甜查理 和 紅顏 草莓不僅對草莓角斑病抗性強(qiáng) 且具有早熟 香味濃郁 酸甜適中 果實(shí)質(zhì)地 較硬 產(chǎn)量高特點(diǎn)等 也適宜在本地種植 推廣種植抗性品種有助于減輕草莓角斑病的發(fā)生 對于田間種 植抗性品種結(jié)合殺菌劑和生防細(xì)菌的技術(shù)措施防治草莓角斑病的效果還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證 彭夢林 等 云南省草莓角斑病病原菌的分離鑒定及抗性評價(jià) 12 參考文獻(xiàn) 1 GIAMPIERI F ALVAREZ SUAREZ J M BATTINO M Strawberry and human health effects beyond antioxidant activity J J Agric Food Chem 2014 62 18 3867 3876 2 HILDEBRAND D C SCHROTH M N WILHELM S Systemic invasion of strawberry by Xanthomonas fragariae causing vascular collapse J Phytopathology 1967 57 11 1260 1261 3 WANG H MCTAVISH C TURECHEK W W Colonization and movement of Xanthomonas fragariae in strawberry tissues J Phytopathology 2018 108 6 681 690 4 KENNEDY B W KING T H Angular leaf spot of strawberry caused by Xanthomonas fragariae sp Nov J Phytopathology 1962 52 9 873 875 5 EPPO Xanthomonas fragariae Kennedy King S EPPO Bull 1986 16 17 20 6 KENNEDY B KING T Angular leafspot a new disease of strawberry J Phytopathology 1960 50 4 641 642 7 ROBERTS P D TONES J B CHANDLER C K et al Survival of Xanthomnas fragariae on strawberry in summer nurseries in Florida detected by specific primers and nested polymerase chain reaction J Plant Dis 1996 80 11 1283 1288 8 TURECHEK W W PERES N A Heat treatment effects on strawberry plant survival and angular leaf spot caused by Xanthomonas fragariae in nursery production J Plant Dis 2009 93 3 299 308 9 FERNANDEZ PAVIA S P RODR GUEZ ALVARADO G GARAY S