中國農(nóng)學(xué)通報 ChineseAgriculturalScienceBulletin 中國農(nóng)學(xué)通報 2023 39 34 41 46 ChineseAgriculturalScienceBulletin 0 引言 草 莓 病 毒 病 在 世 界 各 地 分 布 廣 泛 目 前 已 報 道 的 可 侵 染 草 莓 的 病 毒 有20 多 種 草 莓 受 侵 染 后 主 要 表 現(xiàn) 為 葉 片 失 綠 畸 形 生 長 量 減 少 植 株 矮 化 產(chǎn) 量 下 基金項目 陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新計劃 藍莓草莓綠色高效生產(chǎn)技術(shù)集成與示范推廣 NYKJ 2022 YL XN 30 第 一 作 者 簡 介 王 培 女 1985 年 出 生 山 西 大 同 人 農(nóng) 藝 師 碩 士 研 究 生 研 究 方 向 為 草 莓 育 種 及 栽 培 技 術(shù) 通 信 地 址 710061 陜 西 省 西 安 市 雁 塔 區(qū) 長安南路140 號 Tel 029 85253935 E mail 124658545 收稿日期 2022 12 08 修回日期 2023 05 16 草莓莖尖組培繁育體系優(yōu)化及 SRAP 遺傳穩(wěn)定性檢驗 王 培 李軍見 王高奇 耿騰飛 西安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 西安710061 摘 要 以組培苗遺傳穩(wěn)定和植株健 壯為標(biāo)準(zhǔn) 優(yōu)化草莓莖尖組培繁育體系 以期為草莓工廠化育苗提供 科研和技術(shù)依據(jù) 以 鳳冠 和 天仙醉 草莓為材料 設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑濃度梯 度 調(diào)整培養(yǎng)基基礎(chǔ)配 方 調(diào) 查 莖 尖 分 化 情 況 增 殖 苗 形 態(tài) 增 殖 系 數(shù) 生 根 苗 葉 片 及 根 系 等 性 狀 并 比 對 組 培 前 后 植 株SRAP 標(biāo) 記 擴 增 條 帶 的 差 異 篩 選 出 初 代 培 養(yǎng) 基 配 方MS 6 BA0 5mg L NAA0 01mg L 增 殖 培 養(yǎng) 基 配 方 MS 6 BA0 3mg L NAA0 01mg L 生 根 培 養(yǎng) 基 配 方1 2MS 硝 酸 鈣0 45g L 組 培 前 后 植 株DNA 使 用19 對SRAP 引 物 特 異 性 擴 增 得 到 的72 個 基 因 位 點 條 帶 未 發(fā) 生 變 化 以 上 條 帶 形 成 的DNA 指 紋 沒 有 差異 研究得到的草莓莖尖組培繁 育體系具備植物生長調(diào)節(jié)劑 種類少且濃度低 繼代次數(shù)少 增殖系數(shù) 低 組培時間短 組培苗健壯且基因穩(wěn)定等特征 關(guān)鍵詞 草莓 莖尖 組織培養(yǎng) 相關(guān)序列擴增多態(tài)性標(biāo)記 基因穩(wěn)定性 中圖分類號 S668 4 文獻標(biāo)志碼 A 論文編號 casb2022 1016 Optimization of Tissue Culture of Tip shoot of Strawberry and SRAP Detection of Genetic Stability of Tissue Culture Seedling WANG Pei LI Junjian WANG Gaoqi GENG Tengfei Xi an Institute of Agricultural Science Xi an 710061 Abstract The aim of this study was to optimize strawberry tip shoot tissue culture breeding system based on the genetic stability and robustness of tissue culture seedlings and to provide scientific and technical basis for strawberry factory cultivation Taking two main strawberry varieties of Fengguan and Tianxianzui as samples the concentration gradient of plant growth regulator was set the basic formula of medium was adjusted and the tip shoot differentiation the morphology of proliferating seedlings the proliferation coefficient the leaf and root of rooting seedlings were investigated The differences of the amplified bands of SRAP markers in plants before and after tissue culture were compared The medium formula suitable for primary culture was MS 6 BA 0 5 mg L NAA 0 01 mg L The medium formula for proliferation culture was MS 6 BA 0 3 mg L NAA 0 01 mg L And the medium formula for rooting culture was 1 2 MS calcium nitrate 0 45 g L 19 pairs of SRAP primers were used for specific amplification of plant DNA before and after tissue culture the obtained 72 gene locus bands did not change and there was no difference in DNA fingerprints formed by the above bands The tip shoot tissue culture breeding system of strawberry obtained in this study had the characteristics of few plant growth regulators and low concentration low proliferation coefficient short tissue culture time robust seedling and stable gene Keywords strawberry tip shoot tissue culture sequence related amplified polymorphism genetic stability中國農(nóng)學(xué)通報 降 品 質(zhì) 變 劣 等 現(xiàn) 象 嚴(yán) 重 時 可 引 起 毀 滅 性 災(zāi) 害 1 在 中 國 危 害 嚴(yán) 重 的 主 要 有 草 莓 輕 型 黃 邊 病 毒 SMYEV 草 莓 皺 縮 病 毒 SCV 草 莓 鑲 脈 病 毒 SVBV 和 草 莓 斑 駁 病 毒 SMoV 4 種 草 莓 病 毒 目 前 尚 無 有 效 化 學(xué) 藥 劑 進 行 防 治 最 好 的 解 決 辦 法 是 采 用 脫 毒 種 苗 進 行 無 病 毒 栽 培 2 因 此 眾 多 學(xué) 者 在 草 莓 種 苗 脫 毒 方 面 進 行 了大量的研究 建立了以草莓莖尖組織培養(yǎng)為主體 結(jié) 合 熱 處 理 脫 毒 超 低 溫 脫 毒 或 化 學(xué) 試 劑 脫 毒 等 方 法 為 補 充 的 多 種 脫 毒 體 系 1 3 5 隨 著 草 莓 組 培 技 術(shù) 的 發(fā) 展 生產(chǎn)中組培苗開始大量使用 但有時會出現(xiàn)種性變異 花 而 不 實 等 現(xiàn) 象 針 對 該 現(xiàn) 象 學(xué) 者 們 也 開 展 了 草 莓 離 體 培 養(yǎng) 條 件 下 遺 傳 變 異 方 面 的 研 究 苗 徐 靜 等 6 通 過 對 草 莓 試 管 苗DNA 甲 基 化 的MSAP 檢 測 發(fā) 現(xiàn) 隨 繼 代 次 數(shù) 的 增 加 組 培 苗DNA 甲 基 化 敏 感 多 態(tài) 性 整 體 呈 下 降 趨 勢 代 雄 偉 7 研 究 發(fā) 現(xiàn) 整 個 組 培 過 程 黃 毛 草 莓 甲 基 化 水 平 呈 現(xiàn) 降 低 和 升 高 交 替 出 現(xiàn) 的 動 態(tài) 變 化 趨 勢 這與組培過程中細胞功能分化 激素的使用以及外 界 環(huán) 境 的 影 響 密 切 相 關(guān) 劉 振 8 研 究 發(fā) 現(xiàn) 培 養(yǎng) 基 中 添 加NAA 對 草 莓 葉 片 分 化 的 再 生 植 株 的 遺 傳 穩(wěn) 定 性 影 響 較 大 王 國 平 等 9 認 為 在 草 莓 離 體 培 養(yǎng) 過 程 中 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 的 種 類 和 含 量 繼 代 次 數(shù) 以 及 組 織 培 養(yǎng) 的 時 間 都 有 可 能 會 導(dǎo) 致 染 色 體 數(shù) 目 或 性 狀 畸 變 的 出 現(xiàn) 趙 密 珍 10 認 為 離 體 培 養(yǎng) 過 程 中 加 入 的 某 些 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 可 能 是 引 起 草 莓 的 組 培 苗 莖 數(shù) 花 序 數(shù) 增 多 等 現(xiàn) 象 的 原 因 Haque 等 11 認 為 大 量 變 異 會 對 生 產(chǎn) 產(chǎn) 生 不 利 影 響 如 造 成 果 實 產(chǎn) 量 下 降 和 畸 形 果 的 產(chǎn) 生 等 因此 草莓組培過程中 關(guān)注組培苗的遺傳變異情 況 非 常 必 要 但 很 少 有 對 現(xiàn) 有 報 道 的 草 莓 組 培 繁 育 體 系進行遺傳穩(wěn)定性的檢驗 本研究采用草莓莖尖組織 培養(yǎng) 設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑濃度梯度 調(diào)整培養(yǎng)基基礎(chǔ) 配方 調(diào)查莖尖分化情況 增殖苗形態(tài) 增殖系數(shù) 生根 苗 葉 片 和 根 系 等 性 狀 比 對 組 培 前 后 植 株DNA 的 相 關(guān) 序 列 擴 增 多 態(tài) 性 sequence related amplified polymorphism SRAP 標(biāo) 記 條 帶 的 差 異 旨 在 以 組 培 苗 遺傳穩(wěn)定和健壯為標(biāo)準(zhǔn) 優(yōu)化草莓莖尖組培繁育體系 為草莓工廠化育苗提供技術(shù)依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 材 料 見 表1 MS 和1 2MS 培 養(yǎng) 基 購 自 阜 陽 曼林生物技術(shù)有限公司 瓊脂 瓊脂糖購自北京奧博星 生 物 技 術(shù) 有 限 責(zé) 任 公 司 蔗 糖 購 自 天 津 市 科 密 歐 化 學(xué) 試 劑 公 司 硝 酸 鈣 分 析 純 購 自 天 津 市 天 力 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司 6 BA NAA 購 自Sigma 公 司 快 捷 型 植 物 基 因 組DNA 提 取 系 統(tǒng) DP321 2 Taq PCR Mix KT201 購 自 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 引 物 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 組 培 和SRAP 遺 傳 穩(wěn) 定 性 檢 驗 試 驗 于2021 年11 月 2022 年11 月 在 西 安 市 現(xiàn) 代 農(nóng)業(yè)展示中心組培及分子實驗室進行 1 2 試驗方法 1 2 1 組培方法 1 取 樣 在 設(shè) 施 內(nèi) 剪 取 草 莓 植 株 上 生 長 充 實 小 葉 尚 未 展 開 且 帶 有 未 粘 泥 土 頂 芽 的 匍 匐 莖 莖 粗2 4mm 長 約10 15cm 將 匍 匐 莖 裝 入 塑 料 袋 并 密 封 放入冰箱4 冷藏備用 2 培 養(yǎng) 條 件 培 養(yǎng) 基 以MS 或1 2MS 為 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 瓊 脂5 2 g L 蔗 糖30 g L 根 據(jù) 不 同 培 養(yǎng) 階 段 加 入不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑以及硝酸鈣 培 養(yǎng) 基pH5 8 121 高 壓 蒸 汽 滅 菌20min 培 養(yǎng) 室 溫 度 25 2 相 對 濕 度45 60 光 照 強 度2000 3000lx 光照時長12h d 3 外植體處理 剪取草莓匍匐莖頂端頂芽 先用 加 入 洗 衣 粉 或 洗 潔 精 的 水 溶 液 震 蕩 浸 泡5min 再 用 自 來 水 流 水 沖 洗30min 之 后 在 超 凈 工 作 臺 上 用75 酒 精 表 面 消 毒0 5 1 0 min 無 菌 水 沖 洗3 遍 0 20 HgCl2 浸 泡8 11 min 無 菌 水 沖 洗3 遍 放 入 無 菌 水 中 待用 4 初 代 培 養(yǎng) 設(shè) 計 正 交 試 驗 在MS 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 中 添 加 不 同 濃 度 的 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 設(shè) 置15 個 處 理 表2 每 個 處 理 每 個 品 種 接 種10 瓶 每 瓶1 個 莖 尖 在 體 式 顯 微 鏡 下 切 取0 1 0 3mm 已 消 毒 的 莖 尖 生長點 接種在初代培養(yǎng)基上 培養(yǎng)30d 表 1 試驗材料 品種名稱 天仙醉 鳳冠 采樣點 陜西省西安市長安區(qū)草莓種植戶 陜西省西安市高陵區(qū)東張寺村 采樣時間 2021 年11 月25 日 2021 年11 月26 日 表 2 草莓初代培養(yǎng)正交試驗處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 1 0 1 0 1 0 1 0 0 01 0 05 0 10 0 20 0 30 0 01 0 05 0 10 0 20 處理編號 6 BA 濃度 mg L NAA 濃度 mg L 42 5 增 殖 培 養(yǎng) 設(shè) 計 單 一 變 量 試 驗 在MS 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 中 添 加 不 同 濃 度 的6 BA 設(shè) 置3 個 處 理 表3 每 個 處 理 每 個 品 種 接 種10 瓶 每 瓶 接 種 個 體 形 態(tài) 大 小 近 乎 一 致 的 無 菌 單 芽5 個 接 種 單 芽 后 30 d 轉(zhuǎn) 接1 次 培養(yǎng)60d 6 生根培養(yǎng) 設(shè)計單一變量試驗 將增殖苗接種 到MS 處 理1 和1 2MS 硝 酸 鈣0 45g L 處 理2 2 種 培 養(yǎng) 基 中 進 行 生 根 培 養(yǎng) 每 個 處 理 每 個 品 種 各10 瓶 每 瓶 接 種5 株 個 體 形 態(tài) 完 好 株 高 和 大 小 近 乎 一 致 的 無根或剪根幼苗 培養(yǎng)25 30d 7 試驗調(diào)查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計 初代培養(yǎng)中 不以品種 分類 觀察所有莖尖的分化情況 增殖和生根培養(yǎng)中 每 個 品 種 隨 機 取10 個 樣 本 調(diào) 查 增 殖 形 態(tài) 和 系 數(shù) 生 根 植 株 的 株 高 葉 片 數(shù) 根 長 根 系 條 數(shù) 株 高 是 指 草 莓植株中最高葉片距離植株基部的高度 統(tǒng)計增殖系 數(shù) 時 若 出 現(xiàn) 芽 塊 與 單 芽 等 量 大 小 的 芽 塊 視 為1 個 單 芽 采 用Excel 2003 和SASV8 統(tǒng) 計 軟 件 進 行 數(shù) 據(jù) 處 理和分析 1 2 2 遺傳穩(wěn)定性檢驗方法 1 引物合成 設(shè)計SRAP 標(biāo)記引物 表4 12 13 2 DNA 提 取 及 檢 測 使 用 快 捷 型 植 物 基 因 組 DNA 提 取 系 統(tǒng) DP321 提 取 供 試 材 料 組 培 前 后 植 株 的 第 3 片 展 開 葉 DNA 使 用 核 酸 分 析 儀 Nano Drop2000 檢測DNA 濃度和純度 3 SRAP PCR 檢 測 采 用25 L 的 擴 增 體 系 2 Taq PCR Mix 12 5 L 正 反 引 物 各1 L DNA 模 板 1000ng 加ddH2O 至25 L 擴 增 條 件 為 94 預(yù) 變 性 5 min 94 變 性1 min 35 退 火1 min 72 延 伸 1 min 5 個 循 環(huán) 94 變 性1 min 50 退 火1 min 72 延 伸1min 35 個 循 環(huán) 72 延 伸10min 2 瓊 脂 糖凝膠電泳 凝膠成像儀照相觀察 4 數(shù) 據(jù) 統(tǒng) 計 根 據(jù) 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 結(jié) 果 人 工 讀 帶 以相同遷移位置上有帶記為 1 無帶或缺失 模糊 不清條帶記為 0 建立0 1 數(shù)據(jù)矩陣 2 結(jié)果與分析 2 1 莖尖組培 2 1 1 初代培養(yǎng) 經(jīng)過5d 初代培養(yǎng)后 莖尖生長點逐漸 變 綠 萌 動 15d 出 現(xiàn) 新 芽 和 愈 傷 組 織 的 分 化 在 不 同 處 理 下 草 莓 莖 尖 分 化 存 在 明 顯 差 異 表5 比 較 不 同 處 理 下 莖 尖 分 化 情 況 當(dāng)NAA 濃 度 0 05mg L 時 會 出 現(xiàn) 表 4 SRAP 標(biāo)記引物 引物方向 正向 引物名稱 me1 me2 me3 me4 me5 me6 me7 me8 引物序列 5 3 TGAGTCCAAACCGGATA TGAGTCCAAACCGGAGC TGAGTCCAAACCGGAAT TGAGTCCAAACCGGACC TGAGTCCAAACCGGAAG TGAGTCCAAACCGGTAA TGAGTCCAAACCGGTCC TGAGTCCAAACCGGTGC 引物方向 反向 引物名稱 em1 em2 em3 em4 em5 em6 em7 em8 引物序列 5 3 GACTGCGTACGAATTAAT GACTGCGTACGAATTGAC GACTGCGTACGAATTTGA GACTGCGTACGAATTAAC GACTGCGTACGAATTGCA GACTGCGTACGAATTCAA GACTGCGTACGAATTCTG GACTGCGTACGAATTCGA 10 11 12 13 14 15 1 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 0 30 0 01 0 05 0 10 0 20 0 30 處理編號 6 BA 濃度 mg L NAA 濃度 mg L 續(xù)表 2 表 3 草莓增殖培養(yǎng)單一變量試驗處理 處理編號 1 2 3 6 BA 濃度 mg L 0 1 0 3 0 5 NAA 濃度 mg L 0 01 0 01 0 01 表 5 不同處理對草莓初代培養(yǎng)莖尖分化比例的影響 接種后 30 d 注 分化良好表示分化出1 個以上的健壯 黃綠色單芽 未出現(xiàn)愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象 分化差表示分化出大量愈傷組織或 及 玻璃化現(xiàn)象 莖尖狀況 分化良好的莖尖 分化差的莖尖 處理1 100 0 處理2 50 50 處理3 33 67 處理4 50 50 處理5 50 50 處理6 75 25 處理7 66 7 33 3 處理8 60 40 處理9 50 50 處理10 50 50 處理11 50 50 處理12 0 100 處理13 0 100 處理14 0 100 處理15 0 100 王 培 等 草 莓 莖 尖 組 培 繁 育 體 系 優(yōu) 化 及SRAP 遺 傳 穩(wěn) 定 性 檢 驗 43中國農(nóng)學(xué)通報 愈 傷 組 織 和 玻 璃 化 現(xiàn) 象 也 由 此 可 推 知 相 比 于6 BA NAA 濃 度 的 增 加 更 易 產(chǎn) 生 愈 傷 組 織 和 玻 璃 化 現(xiàn) 象 處 理1 添 加 的 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 濃 度 最 低 莖 尖 分 化 最 好 30 d 內(nèi) 每 個 莖 尖 平 均 分 化 出2 個 健 壯 芽 且 基 部 沒 有愈傷組織附著 適合草莓莖尖初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 MS 6 BA0 5mg L NAA0 01mg L 2 1 2 增 殖 培 養(yǎng) 在 不 同 處 理 下 草 莓 初 代 單 芽 增 殖 情 況 存 在 明 顯 差 異 表6 處 理1 的2 個 品 種 雖 然 以 幼 苗 為 增 殖 形 態(tài) 的 植 株 達 到93 以 上 沒 有 出 現(xiàn) 愈 傷 組 織 和 玻 璃 化 現(xiàn) 象 但 植 株 生 長 勢 弱 增 殖 系 數(shù) 較 低 處 理3 的2 個 品 種 雖 然 增 殖 系 數(shù) 適 合 但 出 現(xiàn) 大 量 的 愈 傷 組 織 和 玻 璃 化 現(xiàn) 象 處 理2 的2 個 品 種 增 殖 形 態(tài) 以 幼 苗 為 主 苗 健 壯 基 部 會 產(chǎn) 生 極 少 量 的 愈 傷 組 織 且增殖系數(shù)最大 綜合考慮植株形態(tài) 增殖系數(shù) 植株 健壯程度 愈傷組織和玻璃化出現(xiàn)情況等方面 適合草 莓 增 殖 培 養(yǎng) 的 培 養(yǎng) 基 為MS 6 BA 0 3 mg L NAA 0 01mg L 2 1 3 生 根 培 養(yǎng) 在 不 同 處 理 下 2 個 品 種 的 株 高 葉 片 數(shù) 根 數(shù) 根 系 長 度 存 在 顯 著 差 異 表7 其 中 2 個 品 種 的 株 高 根 數(shù) 根 系 長 度 均 是 處 理2 顯 著 大 于 處 理1 但 鳳 冠 處 理1 的 葉 片 數(shù) 顯 著 大 于 處 理2 天 仙 醉 處 理2 的 葉 片 數(shù) 顯 著 大 于 處 理1 綜 合 考 慮 植 株 株 高 和 根 系 發(fā) 育 情 況 1 2MS 硝 酸 鈣0 45g L 的 培 養(yǎng) 基 更 加 適 合 生 根 培 養(yǎng) 同 時 鳳 冠 在2 種 處 理 下 變 化 相 對 較 小 且 葉 片 數(shù) 在MS 培 養(yǎng) 基 中 更 大 可 能 與 品 種 自 身 較抗鹽堿的特性有關(guān) 表 6 不同處理對草莓增殖分化的影響 處理編號 1 2 3 品種 鳳冠 天仙醉 鳳冠 天仙醉 鳳冠 天仙醉 植物形態(tài) 幼芽或幼苗 幼芽或幼苗 叢芽 芽塊 或幼苗 叢芽 芽塊 或幼苗 芽塊 愈傷組織 或幼苗 芽塊 愈傷組織 或幼苗 芽 愈傷組織 的比例 4 6 2 14 6 15 83 6 90 4 幼苗的比例 96 93 8 85 4 85 16 4 9 6 增殖系數(shù) 3 05 2 92 5 07 4 61 4 04 4 27 2 2 組培苗基因穩(wěn)定性檢測 前 期 研 究 已 對64 對SRAP 引 物 組 合 進 行 篩 選 其 中19 對 引 物 產(chǎn) 生 了 清 晰 穩(wěn) 定 多 態(tài) 性 好 的 條 帶 共 擴 增 出72 條 條 帶 將 這19 對 引 物 對 鳳 冠 和 天 仙 醉 組 培 前 后 植 株 進 行DNA SRAP 擴 增 具 體 擴 增 結(jié) 果 見 表8 鳳 冠 和 天 仙 醉 組 培 前 后72 個 基 因 位 點 未 發(fā) 生變化 以上條帶數(shù)據(jù)形成的DNA 指紋沒有差異 3 結(jié)論 1 在 保 證 組 培 植 株 健 壯 的 前 提 下 盡 量 減 少 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 添 加 的 種 類 和 濃 度 降 低 了 高 變 異 率 愈 傷 組 織的產(chǎn)生 與前人研究相比 14 23 本研究培養(yǎng)基中使用 的 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 種 類 和 濃 度 有 所 減 少 初 代 培 養(yǎng) 基 中 6 BA 濃 度 為0 5mg L NAA 濃 度 為0 01mg L 增 殖 培 表 7 不同處理對草莓生根培養(yǎng)的影響 品種 鳳冠 天仙醉 處理編號 1 2 1 2 株高 cm 2 074B 3 149A 1 337B 3 133A 葉片數(shù) 片 7 5A 5 9B 5 2B 7 4A 根數(shù) 條 3 6B 5 2A 4 8B 8 4A 根系長度 cm 2 265B 3 149A 1 757B 4 850A 注 不同大寫表示在 P 0 05 水平上呈顯著差異 表 8 組培前后植株 DNA SRAP 的擴增條帶數(shù)據(jù) 引物組合 me3 em1 me5 em1 me2 em2 me2 em3 me2 em4 me5 em6 me1 em7 me3 em7 me6 em7 me1 em8 me5 em8 me3 em8 me6 em8 me8 em8 me6 em1 me6 em2 me6 em3 me7 em1 me7 em4 鳳冠 組培前 0011000010 110 1111 111 1111 111 1101 1011 10101 10 1101 111 111 10101 111 111 11 111 1101 組培后 0011000010 110 1111 111 1111 111 1101 1011 10101 10 1101 111 111 10101 111 111 11 111 1101 天仙醉 組培前 0000000011 110 1111 111 1011 111 0001 1011 10101 01 1010 101 111 10101 111 111 11 111 0101 組培后 0000000011 110 1111 111 1011 111 0001 1011 10101 01 1010 101 111 10101 111 111 11 111 0101 44養(yǎng) 基 中6 BA 濃 度 為0 3mg L NAA 濃 度 為0 01mg L 生根培養(yǎng)基中未添加植株生長調(diào)節(jié)劑 初代培養(yǎng)基中 NAA 濃 度 達 到 及 超 過0 05 mg L 將 影 響 植 株 分 化 會 出 現(xiàn) 大 量 的 愈 傷 組 織 和 玻 璃 化 現(xiàn) 象 增 殖 培 養(yǎng) 基6 BA 濃 度 低 有 助 于 分 化 出 較 多 幼 苗 這 些 結(jié) 論 與 李 曉 亮 等 21 的 研 究 較 一 致 生 根 培 養(yǎng) 基 中 不 添 加 植 株 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 可 以 有 效 提 高 植 株 健 壯 程 度 在 生 根 的 同 時 完 成 復(fù) 壯 使 用1 2MS 培 養(yǎng) 基 降 低 培 養(yǎng) 基 的 鹽 分 能 夠 有 效 促 進 植 株 生 根 結(jié) 合 生 產(chǎn) 中 的 表 現(xiàn) 品 種 越 不 耐 鹽 堿 在1 2MS 培 養(yǎng) 基 中 長 勢 越 好 但 需 要 注 意 的 是 1 2MS 培 養(yǎng) 基 需 額 外 添 加 硝 酸 鈣 否 則 會 在 生 根 培 養(yǎng) 后期出現(xiàn)新葉褐變壞死的現(xiàn)象 2 控 制 繼 代 次 數(shù) 和 增 殖 系 數(shù) 減 少 組 培 時 長 避 免 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 在 植 株 體 內(nèi) 過 度 累 積 降 低 變 異 風(fēng) 險 本 研 究 將 繼 代 次 數(shù) 控 制 在2 代 增 殖 系 數(shù) 控 制 在5 以 下 有 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 使 用 的 時 間 為3 個 月 這 些 結(jié) 論 與 胡 盼 盼 等 24 的 總 結(jié) 較 一 致 雖 然 使 用 該 方 法 得 到 組培苗數(shù)量少 但組培苗質(zhì)量好 加之優(yōu)質(zhì)組培苗本身 生 長 勢 旺 盛 可 以 通 過 在 防 蟲 網(wǎng) 室 中 進 行 匍 匐 莖 快 速 繁殖增加種苗數(shù)量 3 組 培 苗SRAP 基 因 穩(wěn) 定 性 檢 測 證 明 草 莓 莖 尖 組 培 擴 繁 體 系 的 可 靠 性 前 人 研 究 表 明 SRAP 分 子 標(biāo)記由于具有簡單 高效 高共顯性 重復(fù)性 易測序等 優(yōu) 點 已 應(yīng) 用 在 多 種 作 物 的 種 質(zhì) 資 源 鑒 定 評 價 中 25 劉 振 8 采 用SRAP 分 子 標(biāo) 記 技 術(shù) 檢 測 不 同 途 徑 獲 得 的 草莓植株的遺傳穩(wěn)定性 檢測子代與母本的相似程度 為離體快繁和種質(zhì)資源保存提供了技術(shù)依據(jù) 本研究 將考察組培苗基因穩(wěn)定性作為莖尖組培體系是否合理 的 一 項 指 標(biāo) 采 用SRAP 分 子 標(biāo) 記 擴 增 得 到 的72 個 基 因位點不存在變異 證明組培苗種性穩(wěn)定 4 討論 研 究 以 鳳 冠 和 天 仙 醉 草 莓 為 材 料 這2 個 品 種 在 西 安 地 區(qū) 設(shè) 施 栽 培 中 表 現(xiàn) 出 早 熟 性 好 冬 季 連 續(xù) 結(jié) 果 能 力 強 果 個 大 等 優(yōu) 點 但 隨 著 種 植 年 限 的 增 加 也 出 現(xiàn) 了 不 同 程 度 的 品 種 退 化 和 產(chǎn) 量 下 降 現(xiàn) 象 經(jīng) 分 子 檢 測 證 實 這2 個 品 種 已 有 病 毒 侵 染 雖 然 前 人 已 建 立 紅顏 14 19 白雪公主 20 甜查理 14 京藏香 14 鬼 怒 甘 21 石 莓7 號 22 阿 蘇 的 小 雪 18 童 子 一 號 23 等 品 種 的 莖 尖 組 培 體 系 但 未 見 有 這2 個 品 種 組 培 方 面 的 報 道 值 得 注 意 的 是 不 同 品 種 組 培 使 用 的 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 種 類 及 數(shù) 量 繼 代 次 數(shù) 和 培 養(yǎng) 時 間 均 不 相 同 即 使 是 同 一 品 種 如 紅 顏 莖 尖 組 培 體 系 也 不 盡相同 因此在進行大規(guī)模組培生產(chǎn)前 需要針對不同 品種對組培體系進行調(diào)整和優(yōu)化 在建立草莓組培繁育體系時 要將保持品種種性 植株健壯 脫病脫毒作為標(biāo)準(zhǔn) 而不是一味追求增殖數(shù) 量 在 保 持 品 種 種 性 方 面 可 以 使 用ISSR MSAP 6 RAPD SCAR 26 SSR 27 SRAP 等 技 術(shù) 進 行 基 因 穩(wěn) 定 性 檢 測 還 可 以 進 行 田 間 栽 培 種 性 鑒 定 試 驗 只 有 證 明 組 培 苗 未 發(fā) 生 變 異 后 才 可 使 用 在 生 產(chǎn) 中 組 培 苗 進 入栽培種植環(huán)節(jié)后 雖然已脫去了病毒和病菌 但并不 意 味 著 在 種 植 過 程 中 不 會 再 染 病 由 于 組 培 苗 相 對 于 常 規(guī) 苗 生 長 勢 更 旺 盛 所 以 應(yīng) 當(dāng) 注 意 灰 霉 病 白 粉 病 蚜蟲 螨蟲等病蟲害的防治 然 而 本 研 究 在 增 殖 培 養(yǎng) 過 程 中 會 出 現(xiàn) 占 比 約 15 的 叢 芽 其 基 部 產(chǎn) 生 極 少 量 的 愈 傷 組 織 因 此 仍 存 在 變 異 的 可 能 下 一 步 研 究 中 將 進 一 步 細 分 該 培 養(yǎng) 階 段 植 物 生 長 調(diào) 節(jié) 劑 的 濃 度 梯 度 以 期 找 到 更 加 利 于 植 株幼苗分化且兼顧植株健壯度和增殖系數(shù)的濃度 同 時 在組培體系的遺傳穩(wěn)定性檢驗中 下一步研究中將 擴大基因標(biāo)記的數(shù)量 并結(jié)合組培苗田間種性鑒定 從 基因和表型2 個方面檢驗遺傳穩(wěn)定性 參考文獻 1 周 厚 成 何 水 濤 草 莓 病 毒 病 研 究 進 展 J 果 樹 學(xué) 報 2003 5 421 426 2 李 軍 見 王 富 榮 王 培 北 方 草 莓 栽 培 原 理 與 技 術(shù) M 西 安 陜 西 科 學(xué)技術(shù)出版社 2019 75 3 霍 辰 思 樊 新 萍 劉 偉 草 莓 病 毒 病 脫 毒 技 術(shù) 及 病 毒 檢 測 研 究 進 展 J 果樹資源學(xué)報 2020 1 4 66 71 4 彭 芳 芳 魏 召 新 洪 林 等 草 莓 脫 毒 技 術(shù) 研 究 進 展 J 南 方 農(nóng) 業(yè) 2019 13 25 32 35 5 蘇 代 發(fā) 童 江 云 楊 俊 譽 等 草 莓 病 毒 病 及 其 研 究 進 展 J 云 南 大 學(xué)學(xué)報 自然科學(xué)版 2019 41 6 1221 1237 6 苗 徐 靜 文 壯 文 曉 鵬 草 莓 組 培 苗 遺 傳 穩(wěn) 定 性 的ISSR 檢 測 及 DNA 甲基化變異 J 分子植物育種 2019 17 2 531 538 7 代 雄 偉 黃 毛 草 莓 Fragaria nilgerrensisSchltdl 組 培 再 生 過 程 中 基 因組DNA 甲基化動態(tài)變化 D 昆明 云南大學(xué) 2020 41 44 8 劉 振 草 莓 離 體 再 生 體 系 的 建 立 及 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 D 保 定 河 北 大 學(xué) 2017 29 30 9 王 國 平 劉 福 昌 草 莓 病 毒 種 類 鑒 定 及 培 育 無 病 毒 種 苗 的 技 術(shù) 研 究 J 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 1990 23 4 43 49 10 趙 密 珍 日 本 四 季 草 莓 育 種 與 夏 秋 草 莓 生 產(chǎn) 概 況 J 中 國 果 樹 2006 2 61 62 11 HAQUE M S NATH U K IQBAL M S et al Assessment of field performance and genetic diversity analysis of tissue culture variants of strawberry J Journal of agricultural technology 2015 11 1 107 125 12 LI G QUIROS C F Sequence related amplified polymorphism SRAP a new marker system based on a simple PCR reaction Its application to mapping and gene tagging in Brassica J Theoretical andappliedgenetics 2001 103 2 455 461 王 培 等 草 莓 莖 尖 組 培 繁 育 體 系 優(yōu) 化 及SRAP 遺 傳 穩(wěn) 定 性 檢 驗 45中國農(nóng)學(xué)通報 13 魏 麗 麗 朱 世 東 賈 慶 美 等 草 莓SRAP 反 應(yīng) 體 系 優(yōu) 化 及 引 物 篩 選 J 中國農(nóng)學(xué)通報 2014 30 25 159 165 14 楊波 新疆 草莓 病毒 病檢 測及 脫毒 繁育 體系 建立 D 石河 子 石河 子大學(xué) 2018 22 35 15 張 黎 鳳 錢 雯 婕 魏 紅 英 等 紅 顏 草 莓 莖 尖 組 培 快 繁 技 術(shù) 研 究 J 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2017 7 71 74 16 王 曉 玲 唐 麗 萍 范 雨 等 紅 顏 草 莓 莖 尖 組 織 培 養(yǎng) 的 器 官 發(fā) 生 途 徑 研究 J 四川林業(yè)科技 2017 38 6 40 44 17 姚 思 揚 紅 顏 草 莓 組 培 快 繁 技 術(shù) 的 優(yōu) 化 D 長 春 吉 林 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 2019 52 18 鄧淵 兩個 草莓 品種 莖尖 脫毒 快繁 體系 的建 立 D 呼和 浩特 內(nèi)蒙 古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 11 15 19 楊 肖 芳 苗 立 祥 張 豫 超 等 浙 江 省 紅 顏 草 莓 鑲 脈 病 毒 SVBV 的 調(diào)查與莖尖脫毒技術(shù)研究 J 核農(nóng)學(xué)報 2015 29 9 1694 1700 20 竇 炎 丹 白 雪 公 主 草 莓 快 繁 和 超 低 溫 處 理 體 系 的 建 立 以 及 抗 生 素抗性研究 D 石家莊 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 2019 12 15 21 李曉亮 張軍云 張鐘 等 草莓莖尖 組織培養(yǎng) 和快繁體 系的建立 J 作物雜志 2016 4 68 74 173 22 趙 艷 華 程 和 禾 陳 龍 等 草 莓 品 種 石 莓7 號 的 組 織 培 養(yǎng) 與 離 體 快 繁 J 河北果樹 2019 1 9 10 23 王禹 耿月偉 譚巍 等 童子一號 草莓組織 培養(yǎng)快繁 體系的建 立 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019 10 10 14 24 胡 盼 盼 趙 霞 李 剛 等 草 莓 組 培 苗 體 細 胞 無 性 系 變 異 研 究 J 中 國農(nóng)業(yè)通報 2016 32 16 77 82 25 柳 李 旺 龔 義 勤 黃 浩 等 新 型 分 子 標(biāo) 記 SRAP 與TRAP 及 其 應(yīng)用 J 遺傳 2004 26 5 777 781 26 王 志 剛 張 志 宏 李 賀 等 利 用RAPD 和SCAR 標(biāo) 記 鑒 定 草 莓 品 種 J 園藝學(xué)報 2007 3 591 596 27 SALES E K BUTARDO N G Molecular analysis of somaclonal variation in tissue culture derived bananas using MSAP and SSR markers J Internationaljournalofbiological 2014 8 6 615 622 46