文章編號(hào) 1674 7054 2021 02 0236 08 文心蘭炭疽病生防潛力菌的鑒定及其抑菌性的測(cè)定 汪玉玲 宋希強(qiáng) 郭向陽(yáng) 王洪星 郭梨錦 海南大學(xué) 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 林學(xué)院 ?？?570228 摘 要 為獲得對(duì)文心蘭 Oncidium hybridum 炭疽病具有生物防治潛力的菌株 前期從健康文心蘭 博大 1號(hào) 葉片中分離得到1株內(nèi)生菌株WB75 通過(guò)平板對(duì)峙法和發(fā)酵液抑菌性判定該菌具有防治炭疽病的生防 潛力 平板對(duì)峙結(jié)果表明 菌 株 WB75對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率 為 58 79 菌 株 WB75的發(fā)酵原液和高溫處 理后的發(fā)酵液對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率分別 為 77 69 和 41 26 由此推 測(cè) WB75抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較 差 菌 株 WB75對(duì) 8種 熱帶生炭疽 菌 Colletotrichum tropicicola 鷹嘴豆枯萎鐮刀 菌 Fusarium delphinoides 腐皮鐮孢 菌 Fusarium solani 隔孢假殼科真 菌 Paraconiothyrium thysanolaenae 尖孢鐮刀 菌 Fusarium oxysporum 畫(huà)眉草彎孢 菌 Curvularia eragrostidis 芒果球座 菌 Guignardia mangiferae 巨座殼科真菌 Muyocopron alcornii 文心蘭致病菌 12株 均有較好的抑制作用 抑制 率 38 42 91 53 通過(guò)生理生化特 性 和 16S rDNA gyrA和 gyrB多基因序列比對(duì) 鑒定菌 株 WB75為解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 這株解淀粉芽孢桿菌是對(duì)文心蘭病害具有拮抗作用的潛在生防菌 關(guān)鍵詞 文心蘭 炭疽病 解淀粉芽孢桿菌 生物防治 中圖分類(lèi)號(hào) S 482 2 92 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 引用格式 汪玉玲 宋希強(qiáng) 郭向陽(yáng) 等 文心蘭炭疽病生防潛力菌的鑒定及其抑菌性的測(cè) 定 J 熱帶生物學(xué) 報(bào) 2021 12 2 236 243 DOI 10 15886 ki rdswxb 2021 02 013 文心蘭 Oncidium hybridum 在栽培過(guò)程中易受各種病原菌的侵害 1 如炭疽病 炭疽病主要由膠孢 炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 引起 在炭疽病發(fā)病初期 文心蘭葉片上產(chǎn)生淡褐色凹陷的小斑 點(diǎn)后變大 病斑顏色由淡褐色轉(zhuǎn)成褐色最后成黑褐色 后期病斑處形成黑色小顆粒體 高濕度時(shí)可溢出粉 紅色黏狀物的分生孢子堆 受光照影響而常呈輪紋狀 2 文心蘭炭疽病影響文心蘭的產(chǎn)量和品質(zhì)及其經(jīng) 濟(jì)價(jià)值 目前文心蘭炭疽病的防治主要通過(guò)噴灑化學(xué)藥劑 但此防治方法易造成農(nóng)藥殘留和使病原菌產(chǎn) 生耐藥性等問(wèn)題 3 生物防治是利用了生物物種間的相互關(guān)系 以一種或一類(lèi)生物防治另一種或另一類(lèi) 生物 與施用化學(xué)藥劑相比 生物防治具有對(duì)環(huán)境友好 綠色 無(wú)公害且不易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性 對(duì) 病原菌有高度特異性等優(yōu)點(diǎn) 4 5 篩選新型生防菌株以及研究其抗菌物質(zhì)已成為目前的研究熱點(diǎn) 芽孢 桿菌屬是應(yīng)用較廣泛的生防菌 能有效防控病害 如炭疽病 褐斑病 莖腐病等 6 7 目前關(guān)于生防菌在 文心蘭上應(yīng)用的研究較少 其拮抗機(jī)制尚不明確 本研究從健康文心蘭葉片分離 出 1株具有潛在廣譜拮 抗活性的內(nèi)生菌菌 株 WB75 筆者研 究 WB75對(duì)文心蘭主要致病菌的廣譜性防效 并通 過(guò) 16S rDNA gyrA和 gyrB等基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定其分類(lèi)地位 以期獲得能有效防控文心蘭炭疽病的菌株 為文心 蘭炭疽病及其他多種病害的生物防治提供優(yōu)良的拮抗菌株 收稿日期 2020 12 04 修回日期 2021 03 08 基金項(xiàng)目 海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目 ZDKJ201815 海南省自然科學(xué)基金創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 2018CXTD331 海南省高 層次人才項(xiàng)目 2019RC111 第一作者 汪玉玲 1994 女 海南大學(xué)林學(xué)院2018級(jí)碩士研究生 E mail 1192337913 通信作者 郭梨錦 1990 男 博士 講師 研究方向 林業(yè)生態(tài)學(xué) E mail guolijin2018 第 12 卷 第 2 期 熱 帶 生 物 學(xué) 報(bào) Vol 12 No 2 2021 年 6 月 JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY Jun 2021 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為海南博大蘭花科技有限公司文心蘭產(chǎn)業(yè)園區(qū)的文心蘭 博 大 1號(hào) 品種 供試內(nèi)生菌菌 株 WB75分離自健康文心蘭 博 大 1號(hào) 植株 供試病原真菌 膠孢炭疽 菌 C gloeosporioides 熱帶生炭疽 菌 Colletotrichum tropicicola 鷹嘴豆枯萎鐮刀 菌 Fusarium delphinoides 腐皮鐮孢 菌 Fusarium solani 隔孢假殼科真 菌 Paraconiothyrium thysanolaenae 尖孢鐮刀 菌 Fusarium oxysporum 畫(huà)眉草彎孢 菌 Curvularia eragrostidis 芒果球座 菌 Guignardia mangiferae 巨座殼科真菌 Muyocopron alcornii 這些病原真菌菌株均分離自文心蘭感病植株 8 并保存于海南大學(xué)熱帶特色林木 花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的分離培養(yǎng)采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的 LB培養(yǎng)基 真菌的分離培養(yǎng)采用青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PDA培養(yǎng)基 1 2 拮抗文心蘭炭疽病菌株的抑菌率 平板對(duì)峙法 用滅過(guò)菌的打孔器 內(nèi) 徑 5 mm 將病原菌 已活化 打成菌餅 用滅菌牙簽將其挑到平板中心 將內(nèi)生菌菌 株 WB75點(diǎn)接在距離平板中心約 為 3 cm處的四 周 對(duì)照只接病原菌 將處理和對(duì)照置 于 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 待對(duì)照組病原菌長(zhǎng)滿平板即結(jié)束實(shí)驗(yàn) 并計(jì) 算抑菌率 9 抑菌率為對(duì)照與處理菌落之差占對(duì)照菌落直徑的百分比 發(fā)酵液的制作 將 2 3塊內(nèi)生菌菌 株 WB75菌餅放 入 200 mL LB液體培養(yǎng)基中 封好口后放 在 28 180 r min 1 搖床上培 養(yǎng) 7 d 將發(fā)酵 液 10 000 r min 1 離 心 5 min 用 5層滅菌紗布包住漏斗過(guò)濾離心后的 發(fā)酵 液 3次 過(guò)濾后的發(fā)酵液一部分 用 0 22 m無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾獲得無(wú)菌發(fā)酵液 另一部分用高壓滅 菌 鍋 121 滅 菌 30 min 得到高溫處理后的發(fā)酵液 高溫發(fā)酵液 處理為發(fā)酵液 無(wú)菌發(fā)酵液或高溫發(fā) 酵液 與 PDA培養(yǎng)基的混合液體 體積比 為 1 5 將 2種含發(fā)酵液的培養(yǎng)基分別倒板 對(duì)照僅為 PDA培 養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)重 復(fù) 3次 將打成菌餅的病原菌放在培養(yǎng)皿的中心 待對(duì)照組病原菌長(zhǎng)滿平板 測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和 對(duì)照組菌落的直徑 計(jì)算抑菌率 1 3 內(nèi)生菌致病性驗(yàn)證 驗(yàn)證內(nèi)生菌的致病性 將內(nèi)生菌菌株進(jìn)行活化 再用打孔器 內(nèi) 徑 5 mm 打成 菌餅 取長(zhǎng)勢(shì)一致的文心蘭無(wú)菌組培幼苗 接種在改 良 DE培養(yǎng)基中 每 瓶 3株 處理組為在培 養(yǎng) 7 d且無(wú) 污染的組培苗中間放入 1個(gè)內(nèi)生菌菌餅 對(duì)照組則放無(wú)菌 的 PDA菌餅 5個(gè)重復(fù) 用封口膜封口后放在培 養(yǎng)箱中培養(yǎng) 培養(yǎng)條件 光照 黑暗 14 h 10 h 光 強(qiáng) 40 mol m 2 s 1 溫度 約 25 相對(duì)濕度 約 75 記 錄苗的株高 根數(shù) 凈重等指標(biāo) 定期觀察菌苗共生狀況 記錄是否致病或致死 10 使用針刺法 11 接種細(xì) 菌驗(yàn)證其在文心蘭植株上的致病性 實(shí)驗(yàn)采用博大蘭花科技有限公司提供 的 8月齡文心蘭盆栽苗 依次 用 75 酒精和無(wú)菌水消毒清洗葉片 晾干后在葉片正面采用一次性無(wú)菌針灸針輕微刺傷 每處傷口進(jìn)行 數(shù)次針刺 所占面積小于菌餅底面積 1片葉子上處 理 6 8處傷口 之后將菌餅貼于傷口之上 并將濕潤(rùn) 的無(wú)菌濾紙鋪在接種的葉片上保濕 對(duì)照接種相同大小的無(wú) 菌 PDA菌餅 處理設(shè) 置 3個(gè)重復(fù) 所有文心 蘭植株在28 相對(duì)濕度約60 的條件下培養(yǎng) 觀察并記錄葉片是否發(fā)病 1 4 內(nèi)生菌菌株抑菌廣譜性的測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法 12 與熱帶生炭疽 菌 C tropicicola 鷹嘴豆枯萎鐮 刀 菌 F delphinoides 腐皮鐮孢 菌 F solani 隔孢假殼科真 菌 P thysanolaenae 尖孢鐮刀 菌 F oxysporum 畫(huà)眉草彎孢 菌 C eragrostidis 芒果球座 菌 G mangiferae 巨座殼科真 菌 M alcornii 共 12株病原真菌進(jìn) 行對(duì)峙培養(yǎng) 每個(gè)處理重復(fù)3次 方法與1 2相同 1 5 內(nèi)生菌菌株的分類(lèi)鑒定 1 5 1 形態(tài)鑒定 先將活化內(nèi)生菌菌株 LB 平板 轉(zhuǎn) 入 50 mL LB液體培養(yǎng)基中 在搖床 28 150 r min 1 上搖 培 24 h 取少量菌液稀釋后進(jìn)行革蘭氏染色 菌液培 養(yǎng) 3 4 d后進(jìn)行芽孢染色 內(nèi)生菌菌株在 LB平板上培養(yǎng)3 4 d后觀察菌落形態(tài)等特征并拍照 1 5 2 生理生化鑒定 內(nèi)生菌菌株生理生化鑒定用 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 13 中的方法 1 5 3 分子生物學(xué)鑒定 用細(xì) 菌 DNA 提取試劑盒提取內(nèi)生菌菌株基因 組 DNA 分別用細(xì)菌 16S rDNA 通用引物 14 gyrA 15 和 gyrB基因 16 引物 表 1 進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng) 1 瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)后交由華大基因有限公司測(cè)序 測(cè)序結(jié)果上傳 至 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) 以獲得序列登錄號(hào) 17 所得序列 在 NCBI 第 2 期 汪玉玲等 文心蘭炭疽病生防潛力菌的鑒定及其抑菌性的測(cè)定 237 上的 BLAST 進(jìn)行相似性分析 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Bootstrap 1000 用 MEGA7 0構(gòu)建 Neighbor Joining法 1 6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)整理 繪畫(huà)分別采用Excel 2019和Origin 9 1軟件處理 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗菌的抑菌率 前期分離得到內(nèi)生菌 株 WB75 以文心蘭炭疽病為指示菌 進(jìn)行平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)的 抑菌率為 58 79 0 46 圖 1 A 并對(duì)菌 株 WB75的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌測(cè)定 發(fā)酵液原液的抑制率為 77 69 3 79 高溫發(fā)酵液的抑制率下降至 41 26 4 08 呈現(xiàn)大幅下降現(xiàn)象 說(shuō)明高溫對(duì)菌 株 WB75 發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生較大影響 與對(duì)照組相比 實(shí)驗(yàn)組膠孢炭疽菌菌絲均表現(xiàn)出了明顯被抑制 的現(xiàn)象 圖1 C E 暗示發(fā)酵液中含有豐富的抑菌活性物質(zhì) 抑制了菌絲生長(zhǎng) 2 2 內(nèi)生菌菌株的無(wú)致病力測(cè)定 將分離獲得的菌 株 WB75進(jìn)行致病性測(cè)定 7 d 后觀察發(fā)現(xiàn) 刺傷接 種與對(duì)照組接無(wú) 菌 PDA菌餅的傷口均無(wú)病斑產(chǎn)生 使用菌苗共 生 DE培養(yǎng)基 在組培苗中共生培養(yǎng) 2個(gè)月 植株未出現(xiàn)病癥現(xiàn)象 結(jié)果說(shuō)明 菌株WB75對(duì)植物無(wú)致病性作用 2 3 內(nèi)生菌抑菌廣譜性測(cè)定 菌 株 WB75對(duì)不同病原菌的拮抗性表現(xiàn)如 圖 2 所示 菌 株 WB75對(duì)不同 表 1 引物序列 Tab 1 Primer sequence 引物名稱 Primer 堿基序列 Bases sequence 16S通用引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 gyrA p gyrA f 5 CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT 3 p gyrA r 5 CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT 3 gyrB UP1S 5 GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA 3 UP2rS 5 AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC 3 圖 1 菌株WB75對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用 A WB75與病原菌的平板對(duì)峙作用 C WB75發(fā)酵原液抑菌 E WB75高溫后發(fā)酵液抑菌 B D F 空白對(duì)照 Fig 1 Inhibition effect of the endophyte strain WB75 on Colletotrichum gloeosporioides A The flatbed confrontation between WB75 and pathogenic fungi C Fungal inhibition of WB75 fermentation broth E Fungal inhibition in WB75 fermentation broth after high temperature B D F Blank control A B C D E F G H I J K L 圖 2 菌株WB75對(duì)不同病原菌的拮抗性表現(xiàn) A 腐皮鐮孢 菌 F solani WB11 B 腐皮鐮孢 菌 F solani WB23 C 腐皮鐮孢 菌 F solani WG1 D 腐皮鐮孢 菌 F solani W47 E 鷹嘴豆枯萎鐮刀 菌 F delphinoides WB6 F 尖孢鐮刀 菌 F oxysporum W38 G 尖孢鐮刀 菌 F oxysporum WB1 H 芒果球座 菌 G mangiferae WB35 I 隔孢假殼科真 菌 P thysanolaenae WG2 J 畫(huà)眉草彎孢 菌 C eragrostidis WG3 K 熱帶生炭疽 菌 C tropicicola WB19 L 巨座殼科真 菌 M alcornii WG4 左邊 為 WB75與病原菌的對(duì)峙圖 右 邊為對(duì)照組病原菌 Fig 2 Antagonism of the endophyte strain WB75 to different pathogenic fungi The left side shows the confrontation between WB75 and pathogenic fungi while the right side shows the control group 238 熱 帶 生 物 學(xué) 報(bào) 2021 年 病原菌的抑制率 表 2 分析結(jié)果表明 WB75對(duì)分 離獲得 的 8種 熱帶生炭疽菌 鷹嘴豆枯萎鐮刀 菌 腐皮鐮孢菌 隔孢假殼科真菌 尖孢鐮刀菌 畫(huà)眉草彎孢菌 芒果球座菌 巨座殼科真菌 12株 文心蘭病菌均有抑制作用 其中 對(duì) F solani 的 2株 病原菌 WG1和 WB23 抑制率超 過(guò) 80 對(duì) WG1 抑制作用最強(qiáng) 抑制率達(dá)到 了 91 53 其次對(duì) WB23抑制率也達(dá) 到 82 79 對(duì) 7株病原真菌 W38 WB1 WB11 WB19 WB35 WB6和 WG2 的抑制率超 過(guò) 50 對(duì) W47 WG3和 WG4的抑 制效果差一些 利用十字交叉法每天測(cè)量病原菌直徑 繪制 生長(zhǎng)曲線 圖 3 發(fā)現(xiàn)菌 株 WB75對(duì) F solani WG1 和 F solani WB23 的抑制作用 在 48 72 h達(dá)到峰值 對(duì) C tropicicola WB19 的抑制作 用 在 72 96 h達(dá)到峰值 對(duì) F oxysporum WB1 F solani WB11 F oxysporum W38 的抑制作用 在 96 120 h達(dá)到峰值 對(duì) G mangiferae WB35 P thysanolaenae WG2 F delphinoides WB6 和 F solani W47 的抑制作用 在 120 144 h達(dá)到峰 值 病原菌將不再生長(zhǎng) 而對(duì)照組仍無(wú)限生長(zhǎng) 對(duì) C eragrostidis WG3 的抑制作用 在 144 168 h達(dá) 到峰值 而 對(duì) M alcornii WG4 的抑制效果相對(duì) 較差 在 144 h后增速下降 但相對(duì)于對(duì)照組 M alcornii WG4 在菌 株 WB75的影響下 仍有一定 的抑制效果 試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明相同屬的一些菌株具 有一些相似的性質(zhì) 2 4 內(nèi)生菌菌株的分類(lèi)鑒定 2 4 1 內(nèi)生菌菌株形態(tài)和生理生化特征 在 LB固體培養(yǎng)基上 菌 株 WB75呈乳白色 表面有皺 褶 菌落粗糙且邊緣略顯不規(guī)則 圖 4 A 菌株 WB75是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞呈短桿狀 單個(gè)或 成對(duì) 極易成鏈狀 圖 4 B 菌 株 WB75形態(tài) 革蘭 氏染色 芽孢染色等顯示芽孢屬特征 圖 4 C 結(jié) 合該菌株的生理生化特征 表 3 參照 常見(jiàn)細(xì)菌 系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 判定該菌株為解淀粉芽孢桿菌 2 4 2 內(nèi)生菌菌株WB75的16S rDNA gyrA gyrB基因序列分析 對(duì)菌 株 WB75的 16S rDNA 進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增 得到 長(zhǎng) 1 422 bp的 PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物 經(jīng)過(guò) 與 NCBI的 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì) 其序列與解淀粉芽孢桿 菌 Bacillus amyloliquefaciens NZCP05 3376 1 和貝萊斯芽孢桿 菌 Bacillus velezensis NZCP011937 1 相似性較高 圖 5 A 菌 株 WB75的 16S 表 2 菌株WB75對(duì)不同病原菌的抑制率 Tab 2 Inhibition rates of the endophyte strain WB75 against different pathogens 供試菌株 All strains 菌落直徑 cm Colony diameter 抑制率 Inhibition rate病原菌Pathogen 拮抗菌 Antagonistic endophyte W38 WB75 3 76 0 16 54 72 1 94 CK 8 30 0 0 W47 WB75 4 27 0 13 44 83 1 63 CK 7 73 0 53 0 WB1 WB75 3 98 0 30 52 58 3 64 CK 8 40 0 0 WB11 WB75 3 67 0 08 53 29 1 02 CK 7 85 0 13 0 WB19 WB75 3 23 0 05 57 08 0 69 CK 7 53 0 84 0 WB23 WB75 1 42 0 13 82 79 1 53 CK 8 23 0 03 0 WB35 WB75 2 43 0 64 52 29 12 61 CK 5 10 0 75 0 WB6 WB75 3 24 0 14 53 69 1 97 CK 6 98 0 06 0 WG1 WB75 0 67 0 04 91 53 9 06 CK 7 87 0 57 0 WG2 WB75 2 16 0 17 55 77 3 49 CK 4 88 0 89 0 WG3 WB75 3 08 0 19 45 77 3 33 CK 5 67 0 19 0 WG4 WB75 5 05 0 05 38 42 0 61 CK 8 17 0 29 0 第 2 期 汪玉玲等 文心蘭炭疽病生防潛力菌的鑒定及其抑菌性的測(cè)定 239 rDNA核苷酸序列已提 交 GenBank 登錄號(hào)為 MW238381 用菌 株 WB75 gyrA基因引物測(cè)定 gyrA基因序列 獲得 943 bp 的基因片段 在 NCBI上比對(duì)分析以后 發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens NZCP053376 1 菌 株 gyrA基因的一致性達(dá)到 99 以上 圖 5 B 系統(tǒng) 發(fā)育樹(shù)結(jié)果 圖 5 B 顯示 菌 株 WB75 與解淀粉芽 孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens NZCP053376 1 分支較近 支持率較高 用菌 株 WB75 的 gyrB基 因得到序列為 1 145 bp 的基因片段 與 B amylo liquefaciens CP017953 1 和解淀粉芽孢桿菌 Bac illus amyloliquefaciens MH428832 1 以 67 的支 持率聚成同一分支 圖 5 C 綜 合 3個(gè)基因的序列 比對(duì)結(jié)果分析 說(shuō)明菌 株 WB75是解淀粉芽孢 桿菌 圖 3 不同病原菌在菌株WB75拮抗下的生長(zhǎng)速率 Fig 3 Growth rates of different pathogens under antagonism of the endophyte strain WB75 20 m 200 m A B C 圖 4 菌株WB75形態(tài)學(xué)鑒定 A 菌株WB75菌落正面 B 革蘭氏染色 C 芽孢染色 Fig 4 Morphological identification of the endophyte strain WB75 A The front side of endophyte strain WB75 B Gram staining C Staining diagram of spore 表 3 菌株WB75的生理生化特性 Tab 3 Physio biochemical characteristics of endophyte strain WB75 生理生化指標(biāo) Biolog 結(jié)果 Result 接觸酶試驗(yàn) Catalase test V P 試驗(yàn) Voges Proskauertest 明膠液化 Hydrolysis of gelatin 甲基紅試驗(yàn) Methyl red test 革蘭氏染色 Gram stain 木糖醇 xylitol 硝酸鹽還原 Nitrate reduction 赤蘚糖醇 Erythritol sugar alcohol 色氨酸脫氨酶 Tryptophan eaminase 纖維素分解 Cellulose decomposition 檸檬酸鹽利用 Citrate utilization 淀粉水解 Starch hydrolysis 注 和 分別表示陽(yáng)性和陰性 Note and mean positive and negative 240 熱 帶 生 物 學(xué) 報(bào) 2021 年 3 討 論 菌株 WB75對(duì)炭疽菌屬和鐮刀菌屬 等 13株病原真菌 有 38 42 91 53 的抑制作用 對(duì) F solani WG1 腐皮鐮孢菌抑制作用最強(qiáng) 抑制率達(dá) 到 91 53 通過(guò)形態(tài)觀察 生理生化特性以及分子生物學(xué)手 段 菌株 WB75被鑒定為解淀粉芽孢桿菌 層出鐮刀菌引起蘭花葉斑病 18 尖孢鐮孢菌引起墨 蘭 Cymbidium sinense莖腐病和建 蘭 Cymbidium 圖 5 內(nèi)生菌菌株的16s gyrA gyrB基因序列分析 A 16S 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) B gyrA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) C gyrB 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig 5 Sequence analysis of 16S gyrA and gyrB genes of the endophyte strain WB75 A Phylogenetic tree division based on 16S gene sequence B Phylogenetic tree division based on gyrA gene sequence C Phylogenetic tree division based on gyrB gene sequence 第 2 期 汪玉玲等 文心蘭炭疽病生防潛力菌的鑒定及其抑菌性的測(cè)定 241 ensifolium莖腐病 19 引起蝴蝶 蘭 Phalaenopsis aphrodite莖腐病 20 膠孢炭疽菌是墨蘭 大花蕙蘭 Cymbidium hybrid 和鐵皮石 斛 Dendrobium officinale 炭疽病的病原菌 21 本研究發(fā)現(xiàn)菌 株 WB75對(duì)以上 鐮刀菌屬和炭疽菌屬均具有較好的拮抗效果 周平蘭等 22 研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬能拮抗蘭花炭疽病病原 菌 許文江等 23 研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草桿菌 FJAT 9 986 能防治蝴蝶蘭葉基腐病菌 王士燕等 24 研究發(fā)現(xiàn)解 淀粉芽孢桿菌拮抗膠孢炭疽菌 尖孢鐮孢菌和腐皮鐮孢 菌 3種蘭花病原真菌 本研究中 菌 株 WB75發(fā) 酵液對(duì)病原真菌有很好的抑制效果 說(shuō)明發(fā)酵液中存在抑菌活性物質(zhì) 但菌株發(fā)酵液經(jīng) 過(guò) 121 高溫處 理后抑制效果顯著下降 說(shuō)明發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)不耐高溫 但 121 高溫處理后的菌 株 WB75發(fā) 酵液仍能溶解病原真菌菌絲 可較好地抑制病原真菌 芽孢桿菌屬是世界公認(rèn)的生防菌 被廣泛應(yīng)用于植物病害防治 25 有研究表明解淀粉芽孢桿菌主要 通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶等生防相關(guān)酶和含有抗菌肽合成基因 26 幾丁質(zhì)酶及嗜鐵素 27 等進(jìn)行抑菌 解淀粉芽孢 桿菌的廣譜抑菌性已有報(bào)道 能有效防治大白菜軟腐病菌和 8 種病原真菌 28 能有效抑制黃瓜枯萎病并 促進(jìn)黃瓜植株生長(zhǎng) 27 芽孢桿菌的內(nèi)生芽胞 具有耐熱 耐干燥和抑菌能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) 且其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn) 單 存儲(chǔ)期較長(zhǎng) 是一種開(kāi)發(fā)潛力很高的生防菌 29 本研究?jī)H確定菌 株 WB75為解淀粉芽孢桿菌 且初判斷其具有一定生防潛力 但對(duì)其拮抗機(jī)理的研 究不夠深入 對(duì)菌株發(fā)酵液含有的抑菌物質(zhì)的具體成分及其抑菌機(jī)理尚不明確 這些均有待進(jìn)一步研 究 菌株WB75對(duì)病原菌的室內(nèi)或田間防效試驗(yàn)也有待進(jìn)一步研究 致謝 海南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院丁瓊老師 植物保護(hù)學(xué)院劉銅老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)給予了指導(dǎo)與幫助 一并致謝 參考文獻(xiàn) 1 易綺斐 劉東明 陳紅鋒 等 蘭花主要病害及其防治 J 植物保護(hù) 2004 30 1 71 73 2 陳潔敏 蘭花炭疽病綜合防治技術(shù) J 北方園藝 2005 6 94 3 AGARAS B C NOGUERA F ANTA G G et al Biocontrol potential index of pseudomonads instead of their direct growth promotion traits is a predictor of seed inoculation effect on crop productivity under field conditions J Biological Control 2020 143 104209 4 王超 郭堅(jiān)華 席運(yùn)官 等 拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中應(yīng)用的研究進(jìn)展 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017 45 18 1 6 5 SEIXAS C D S KILLGORE B E Fungal pathogens of Miconia calvescens Melastomataceae from Brazil with reference to classical biological control J Mycologia 2007 99 1 99 111 6 劉彩云 許瑞瑞 季洪亮 等 一株生防內(nèi)生真菌的分離篩選 鑒定及抑菌特性 J 植物保護(hù)學(xué)報(bào) 2015 42 5 137 143 7 王培育 張婧 張春柳 等 文心蘭葉片褐斑病病原物鑒定及生防菌篩選 J 寧德師范學(xué)院學(xué) 報(bào) 自然科學(xué)版 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蘭花致病真菌拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定 J 林業(yè)科學(xué)研究 2016 29 5 682 686 25 連玲麗 謝荔巖 吳祖建 等 枯草芽孢桿 菌 SB1的抑菌活性及其對(duì)番茄青枯病的防治作用 J 植物病理學(xué)報(bào) 2011 41 2 219 224 26 李全勝 謝宗銘 張國(guó)麗 等 棉花黃萎病拮抗芽孢桿 菌 S12的篩選鑒定及拮抗機(jī)制的分析 J 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2015 38 3 402 408 27 季倩茹 陳靜 胡遠(yuǎn)亮 等 3種芽孢桿菌菌劑對(duì)黃瓜枯萎病的防效及其作用機(jī)制初探 J 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2020 39 5 101 107 28 王彪 崔文艷 何朋杰 等 解淀粉芽孢桿 菌 ASR 12粗蛋白對(duì)多種植物病菌的抑制作用 J 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2019 46 5 865 869 29 SCHALLMEY M SINGH A WARD O P Developments in the use of Bacillus species for industrial production J Cana dian Journal of Microbiology 2004 50 1 1 Identification of biocontrol potential microorganism and assessment of its antimicrobial activity against Oncidium hybridum Anthracnose WANG Yuling SONG Xiqiang GUO Xiangyang WANG Hongxing GUO Lijin Ministry of Education Key Laboratory of Genetics and Germplasm Enhancement of Tropical Forest Flowers College of Forestry Hainan University Haikou Hainan 570228 China Abstract Endophytes were isolated from healthy Oncidium hybridum leaves An endophyte strain WB75 was identified as a potential biocontrol agent via plate confrontation analysis by using Colletotrichum gloeosporioides as reference pathogen which causes O hybridum anthracnose The plate confrontation showed the endophyte strain WB75 had an inhibition rate of 58 79 against C gloeosporioides and that its fermentation broth and autoclaved fermentation broth had inhibition rates of 77 69 and 41 26 against C gloeosporioides respectively It was speculated that the endophyte strain WB75 had poor thermal stability The antagonism of the endophyte strain WB75 against other pathogens were detected by using the plant confrontation and these pathogens included 12 strains of 8 species of pathogens Colletotrichum tropicicola Fusarium delphinoides Fusarium solani Paraconiothyrium thysanolaenae Fusarium oxysporum Curvularia aeragrostidis Guignardia mangiferae Muyocopron alcornii which were isolated from different parts of O hybridum The plate confrontation showed that the inhibition rates of the endophyte strain WB75 against the 12 strains of pathogens ranged from 38 42 to 91 53 The endophyte strain WB75 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through its physiological biochemical characteristics and the sequence analysis of its 1