園藝學(xué)報(bào) 2023 50 10 2271 2287 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2022 0835 http www ahs ac cn 2271 收稿日期 2023 04 28 修回日期 2023 05 09 基金項(xiàng)目 廣東省種業(yè)振興項(xiàng)目 2022 NPY 00 026 廣東省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目 2022B020208003 廣州市重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目 202103000085 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)果菜產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 2022KJ110 通信作者 Author for correspondence E mail caobh01 茄子青枯病抗性相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因的篩 選及鑒定 王亦棲 顏爽爽 余炳偉 甘雨薇 邱正坤 朱張生 陳長(zhǎng)明 曹必好 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省蔬菜工程技術(shù)研究 中心 廣州 510642 摘 要 茄子在生產(chǎn)中易受青枯病侵襲 為挖掘茄子青枯病抗性基因 前期以茄子高抗青枯病自交 系和感病自交系為試材進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析 獲得 4 個(gè)與調(diào)控青枯病抗性相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因 分別命 名為 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 序列分析發(fā)現(xiàn) 4 個(gè) E3 連接酶的結(jié)構(gòu)域在 7 個(gè)物種中 較為保守 SmSP1 及 SmSPL2 屬 RING 型 E3 連接酶 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 屬 CRL DDB 型 E3 的底物 受體 亞細(xì)胞定位表明 除 SmDDA1a2 定位于細(xì)胞核 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 定位于細(xì)胞核及 其他細(xì)胞部位 4 個(gè)基因在茄子抗感材料的根 莖及葉中均有表達(dá) 葉中最高 青枯菌及外源激素可誘導(dǎo) 4 個(gè)基因的表達(dá) 且在抗性材料中的表達(dá)量高于感病材料 水楊酸可誘導(dǎo) SmSP1 的表達(dá) 茉莉酸甲酯可 誘導(dǎo) SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的表達(dá) 乙烯利可誘導(dǎo) 4 個(gè)基因的表達(dá) VIGS 基因沉默結(jié)果顯 示 在抗性材料中沉默 SmSP1 和 SmDDA1a2 后 導(dǎo)致植株青枯病抗性下降 沉默 SmSPL2 和 SmDDA1a1 后 對(duì)植株青枯菌抗性沒(méi)有影響 以上結(jié)果表明 SmSP1 和 SmDDA1a2 可能參與茄子青枯病抗性的調(diào)控 關(guān)鍵詞 茄子 青枯病 E3 泛素連接酶 表達(dá)分析 功能鑒定 中圖分類號(hào) S 641 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2023 10 2271 17 Screening and Identification of E3 Ubiquitin Ligase Genes Relate to Bacterial Wilt Resistance in Eggplant WANG Yixi YAN Shuangshuang YU Bingwei GAN Yuwei QIU Zhengkun ZHU Zhangsheng CHEN Changming and CAO Bihao Key Laboratory of Biology Genetic Improvement of Horticultural Crops Ministry of Agriculture and Rural Affairs Guangdong Vegetable Engineering Technology Research Center College of Horticulture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstract Eggplant is vulnerable to bacterial wilt in production In order to investigate eggplant bacterial wilt resistance genes previously the transcriptome of highly resistant inbred line and susceptible inbred line were performed and analyzed Four E3 ubiquitin ligase genes related to bacterial wilt resistance including SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 and SmDDA1a2 were obtained Sequence analysis showed that the domains of four E3 ligase proteins were conservative among seven species SmSP1 and Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2272 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 SmSPL2 belonged to RING type E3 ligase SmDDA1a1 and SmDDA1a2 belonged to CRL DDB type E3 substrate receptor The subcellular localization results indicated that SmDDA1a2 was localized in the nucleus and SmSP1 SmSPL2 and SmDDA1a1 were localized in the nucleus and other cell sites The four genes were expressed in the roots stems and leaves of eggplant and the highest expression was found in the leaves The expression of four genes were induced by Ralstonia solanacearum and exogenous hormones and higher in resistant materials than in susceptible materials SmSP1 was induced by salicylic acid SmSPL2 SmDDA1a1 and SmDDA1a2 were induced by methyl jasmonate and all four genes were induced by ethephon Function identification by VIGS demonstrated that silencing of SmSP1 and SmDDA1a2 in resistant materials led to the decline of plant resistance to bacterial wilt and silencing of SmSPL2 and SmDDA1a1 in resistant materials did not affect the plant resistance to bacterial wilt These results suggested that SmSP1 and SmDDA1a2 may be involved in the regulation of eggplant bacterial wilt resistance Keywords eggplant bacterial wilt E3 ubiquitin ligase expression analysis functional identification 茄子 Solanum melongena 在生產(chǎn)中易受病害侵襲 尤其是青枯病 印度尼西亞最早報(bào)道了茄 科青枯病 盧同 1998 茄科青枯病是一種危害巨大的全球土傳性細(xì)菌病害 由茄科勞爾氏菌 Ralstonia solanacearum 引起 菌系復(fù)雜 寄主多達(dá)幾百種 對(duì)茄科植物危害尤其巨大 喬俊卿 等 2013 青枯菌通過(guò)植物根進(jìn)入導(dǎo)管組織 從中繁殖并分泌胞外多糖以堵塞導(dǎo)管 最終導(dǎo)致植物缺水 而死 Peng et al 2021 目前缺乏對(duì)青枯病具免疫抗性的茄子主栽培品種 且尚未有防治青枯病 的特效藥 因而篩選茄子抗青枯病基因 改善茄子青枯病抗性迫在眉睫 泛素化是生物最常見(jiàn)的蛋白修飾方式之一 主要由泛素 26S 蛋白酶體系統(tǒng) 26S ubiquitin proteasome system UPS 對(duì)靶蛋白進(jìn)行降解 UPS 主要包括泛素 Ub 泛素激活酶 E1 泛素結(jié) 合酶 E2 泛素連接酶 E3 和 26S 蛋白酶體 Vierstra 2009 在 ATP 的作用下 泛素通過(guò) E1 E2 及 E3 將其轉(zhuǎn)移至靶蛋白 該過(guò)程重復(fù)多次 當(dāng)泛素累積 4 個(gè)以上時(shí)形成泛素鏈 由 26S 蛋白酶體 將靶蛋白降解 而泛素單體則重新進(jìn)入系統(tǒng)被循環(huán)使用 Scheffner et al 1995 Berndsen Wolberger 2014 E3 泛素連接酶可特異性識(shí)別靶蛋白 在泛素化過(guò)程中起決定性作用 E3 種類多 數(shù)量大 包含單體 RING 型 E3 連接酶及多亞基的 CRL 型 Cyr et al 2002 Bae Kim 2014 E3 連接酶 CRL 型 E3 連接酶主要由作為支架的 cullin 蛋白結(jié)合 E2 的 RING 型 really interesting new gene 蛋 白及底物受體和銜接子組成 Cullin 的 4 種類型之一的 CUL4 主要作為支架起作用 而 DDD DDB1 DET1 DDA1 復(fù)合物的亞基則是其核心亞基 是 CRL4 進(jìn)化上保守的基礎(chǔ)成分 Yanagawa et al 2004 Olma et al 2009 Dielen et al 2010 E3 泛素連接酶在植物抗病中發(fā)揮重要作用 Karki 等 2021 發(fā)現(xiàn)小麥酵母菌中一種富含半胱 氨酸的小分泌蛋白 ZtSSP2 可以與小麥 E3 連接酶 TaE3UBQ 互作 而 TaE3UBO 可正調(diào)控小麥葉枯 病抗性 此外 煙草 E3 連接酶基因 NtRNF217 和馬鈴薯 E3 連接酶 ATL 家族基因 StACRE 都可正調(diào) 控青枯病抗性 Park et al 2012 Liu et al 2021 除正調(diào)控外 Qin 等 2019 研究表明 U box 型 E3 連接酶 GhPUB17 能負(fù)調(diào)控棉花黃萎病菌抗性 E3 連接酶也可調(diào)控激素途徑 水稻 OsWRKY45 及 TGA3 也受 UPS 降解以調(diào)控水楊酸 SA 信號(hào) Pontier et al 2002 Matsushita et al 2013 UPS 也可調(diào)控茉莉酸 JA 及乙烯 Eth 信 號(hào)基因的表達(dá) Pauwels 等 2015 研究表明 RING 型 E3 連接酶 KEG keep on going 正調(diào)控 JA 王亦棲 顏爽爽 余炳偉 甘雨薇 邱正坤 朱張生 陳長(zhǎng)明 曹必好 茄子青枯病抗性相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因的篩選及鑒定 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 10 2271 2287 2273 途徑信號(hào)基因 JAZ12 的表達(dá) E3 連接酶 EBF1 及 EBF2 可靶向乙烯信號(hào)途徑基因 EIN3 EIL 并將 EIN3 EIL 進(jìn)行降解 Binder et al 2007 此外 有報(bào)道表明 E3 連接酶可通過(guò)激素途徑調(diào)控植物 抗性 在蘋果中 U box 型 E3 泛素連接酶 MdPUB29 可通過(guò)調(diào)節(jié) SA 途徑來(lái)提高蘋果對(duì)輪紋病菌的 防御 Han et al 2019 CRL3 BTB Cullin3 BC3B 降解 SA 信號(hào)途徑基因 NPR1 防止植株在未 受脅迫時(shí)產(chǎn)生 SA 的自身免疫 Petroski Deshaies 2005 Furniss Spoel 2015 茄子抗青枯病的分子機(jī)制復(fù)雜 而目前有關(guān) E3 泛素連接酶調(diào)控其抗青枯病的研究較少 本團(tuán) 隊(duì)前期以茄子高抗及高感青枯病茄子自交系為材料 開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組分析 獲得 4 個(gè)調(diào)控茄子抗青枯病 相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因 本研究中繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)特性分析及功能鑒定 以探討茄子對(duì)青枯 病抗性的調(diào)控機(jī)理 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)于 2020 年至 2021 年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院完成 茄子高抗青枯病自交系 E 31 和茄子高 感青枯病自交系 E 32 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院曹必好教授提供 Cao et al 2009 肖熙鷗 等 2012 2016 正常培養(yǎng)條件為 26 光照 14 h 22 黑暗 10 h 本氏煙草 Nicotiana benthamiana 正常 培養(yǎng)條件為 22 光照 14 h 20 黑暗 10 h 1 2 生物信息分析 茄子基因組 v4 Barchi et al 2019 由 SGN https 組中 RING 型 E3 連接酶基因的鑒定參考 Stone 等 2005 Gingerich 等 2005 Xu 等 2009 和 Lee 等 2008 的方法 茄子 E 31 和 E 32 經(jīng)青枯菌處理 7 d 后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自本團(tuán)隊(duì)前期的研究 Chen et al 2018 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的轉(zhuǎn)錄本編號(hào)分別為 Unigene0012274 Unigene0058253 Unigene0022527 和 Unigene0022528 RING 型 SCF 型 BTB 型 DWD 型 E3 和 DDA1 蛋白 CRL DDB 型 E3 底物受體 的表達(dá)水平數(shù)據(jù)及熱圖從 figshare 網(wǎng)站 https DOI 10 6084 m9 figshare 21155974 使用 TBtools v1 098745 軟件 Chen et al 2020 和 pheatmap 構(gòu)建熱圖 基因結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果和同源蛋白序列來(lái)自 NCBI https www ncbi nlm nih gov 同源蛋白序列比對(duì)使用 DNAMAN 8 軟件 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用 Mega X 軟件 1 3 RNA 提取 cDNA 合成 qRT PCR 及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 茄子葉片 RNA 的提取使用上海 Promage RNA 提取試劑盒 cDNA 合成使用 EZB 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 qRT PCR mix 使用 YEASEN Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 擴(kuò)增體系 Mix 5 L 上 下游 引物各 0 3 L cDNA 模板 300 ng L 1 0 5 L ddH 2 O 3 9 L 基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用 2 ct 及 2 ct Livak Schmittgen 2001 t 檢驗(yàn) 單因素方差分析及 least significant difference LSD 多重比較均用 SPSS 軟件完成 1 4 基因的克隆 載體構(gòu)建及大腸桿菌和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 利用 Primer 5 0 及 CE Design https 軟件設(shè)計(jì)引物 表 1 以茄子 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增體系同上 擴(kuò)增程序?yàn)?95 預(yù)變性 3 min 95 高溫變 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2274 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 性 30 s 55 退火 30 s 34 個(gè)循環(huán) 72 延伸 75 s 將 pEAQ EGFP 質(zhì)粒及 pTRV2 質(zhì)粒進(jìn)行 37 2 h 酶切反應(yīng) 1 瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)到酶切后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶失活 85 5 min 利用 YEASEN 一步法快速克隆試劑盒 Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit 進(jìn)行線性化質(zhì)粒與目的基因 的連接 表 1 亞細(xì)胞定位及 VIGS 試驗(yàn)引物信息表 Table 1 List of the primers for subcellular localization and VIGS assays 名稱 Name 序列 5 3 Sequence 質(zhì)粒 Plasmid 酶切位點(diǎn) Restriction site SmSP1 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGGCTCCATGGGGCGGA pEAQ EGFP Age I R gcccttgctcaccataccggt ATGGCGAAAAGTTTTCACA pEAQ EGFP Age I SmSPL2 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGTCAATACACGACCAAGCGG pEAQ EGFP Age I gcccttgctcaccataccggt AGAATCATATATCCTTACGGAACT pEAQ EGFP Age I SmDDA1a1 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggtATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pEAQ EGFP Age I R gcccttgctcaccataccggt GGTGGACACCTTAAGATGCT pEAQ EGFP Age I SmDDA1a2 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pEAQ EGFP Age I gcccttgctcaccataccggt GGTGGACACCTTAAGATGCT pEAQ EGFP Age I pEAQ EGFP Universal F AGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACT R GGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTT pTRV2 SmSP1 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGCTCCATGGGGCGGA pTRV2 EcoR I cgtgagctcggtaccggatcc TCAATGGCGAAAAGTTTTCACA pTRV2 BamH I pTRV2 SmSPL2 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGTCAATACACGACCAAGCGG pTRV2 EcoR I R cgtgagctcggtaccggatcc TCAAGAATCATATATCCTTACGGA pTRV2 BamH I pTRV2 SmDDA1a1 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pTRV2 EcoR I cgtgagctcggtaccggatcc TCAGGTGGACACCTTAAGATGCT pTRV2 BamH I pTRV2 SmDDA1a2 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pTRV2 EcoR I R cgtgagctcggtaccggatcc TCAGGTGGACACCTTAAGATGCT pTRV2 BamH I pTRV2 Universal F TGAGGGAAAAGTAGAGAACG CCTATGGTAAGACAATGAGT 注 序列中的小寫字母表示目的基因片段與載體片段的同源臂 Note The lowercase letters in the sequence represent the homologous arms of the target gene fragment and the vector fragment 連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌 DH5 感受態(tài)中 利用移 液槍輕輕吸打混勻 冰浴 30 min 42 金屬浴 90 s 冰浴 2 min 后加入 600 L LB 液體培養(yǎng)基 胰 蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 NaCl 10 g L 1 中 放置于 37 搖床 200 r min 1 活化 1 h 后 5 000 r min 1 離心 3 min 去上清液 余約 100 L 培養(yǎng)基將菌體吸打重懸后涂布于添加 50 mg L 1 卡那霉素 Kan 的 LB 固體培養(yǎng)基 1 瓊脂 上 倒置于 37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 d 待攜帶重組質(zhì) 粒的大腸桿菌生長(zhǎng)后 以大腸桿菌菌落為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 篩選出陽(yáng) 性菌落并測(cè)序 對(duì)應(yīng)引物見(jiàn)表 1 挑取陽(yáng)性菌落于 5 mL LB 液體培養(yǎng)基 37 200 r min 1 培養(yǎng) 1 d 后 利用擎科質(zhì)粒小提試 劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒提取 將 100 500 g 的重組質(zhì)粒與 GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)混合 并用移液槍輕 輕吸打混勻 冰浴 30 min 液氮冷凍 5 min 37 金屬浴 90 s 冰浴 2 min 后加入 600 L YEP 液體 培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 10 g L 1 NaCl 5 g L 1 28 200 r min 1 活化 1 h 后 5 000 r min 1 離心 3 min 去上清液 余約 100 L 培養(yǎng)基將菌體吸打重懸后涂布于添加 50 mg L 1 Kan 的 YEP 固體培養(yǎng)基 1 瓊脂 上 倒置于 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 36 48 h 待農(nóng)桿菌生長(zhǎng)后 挑 取菌落進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 篩選出陽(yáng)性菌落 并挑取陽(yáng)性菌落于裝有 1 mL 含 Kan 抗性 YEP 液體培養(yǎng)基的 2 mL 離心管中 28 200 r min 1 培養(yǎng) 36 h 后用 50 的甘油保存 于 80 冰箱 王亦棲 顏爽爽 余炳偉 甘雨薇 邱正坤 朱張生 陳長(zhǎng)明 曹必好 茄子青枯病抗性相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因的篩選及鑒定 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 10 2271 2287 2275 1 5 亞細(xì)胞定位 將攜帶 pEAQ EGFP SmSP1 pEAQ EGFP SmSPL2 pEAQ EGFP SmDDA1a1 和 pEAQ EGFP SmDDA1a2 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在 YEP 固體培養(yǎng)基上劃線 28 培養(yǎng) 2 d 后挑取單菌落至 YEP 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 將農(nóng)桿菌菌液 5 000 r min 1 離心 5 min 去上清液 加入侵染液 10 mmol L 1 MgCl 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 AS 并重懸菌體 28 黑暗靜置活化 1 2 h 選取健康的生長(zhǎng)至 6 7 片葉的本氏煙草進(jìn)行亞細(xì)胞定位 將攜帶重組質(zhì)粒與核定位信號(hào)質(zhì)粒 nuclear localized signal NLS Sun et al 2020 的農(nóng)桿菌侵染液 1 1 體積比 混合后 注射 至煙草葉片 使之呈水漬狀 將煙草放置于 22 黑暗環(huán)境中 2 3 d 后 利用熒光顯微鏡可視化 GFP 熒光并拍照 重復(fù) 3 次 1 6 表達(dá)組織特異性分析 取 4 片真葉期高抗和高感青枯病茄子自交系健康植株的根 莖下部 莖上部 依據(jù)根到葉的距 離進(jìn)行平均劃分 和葉片 進(jìn)行 RNA 提取及 qRT PCR 檢測(cè) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù) 數(shù)據(jù)處理方法采用 2 ct 顯著性差異采用 t 檢驗(yàn) 相應(yīng)引物見(jiàn)表 2 表 2 qRT PCR 引物信息 Table 2 List of the primers of qRT PCR 用途 Application 名稱 Name 序列 5 3 Sequence 表達(dá)組織特異性分析 Expression tissue specificity analysis 青枯菌 激素處理 R solanacearum hormone treatment VIGS 實(shí)驗(yàn) VIGS assay qPCR SmSP1 F CAAGTATGCTTCAATGGGTT R GAGGTCCTTTCTATTATCTGCT qPCR SmSPL2 CATCCCCTACCTCTTGTG AAATCCCATCCTTTGAGC qPCR SmDDA1a1 F ATCAAGGAAATGCAGGCA TGGACACCTTAAGATGCT qPCR SmDDA1a2 CGCCTGTGACTTATCGCCCTAC R CTCGCTTTGGTCTCAACTTCTC SA 途徑信號(hào)基因表達(dá) SA pathway signaling gene expression qPCR TAG F GCAAGTGACCCTGAACTACGAAG GGGTTTTCCACATCCCTGACAAG qPCR NPR1 CTTGGACTGGGTGTTGCTAATG TGCCCATCCAATGTAATGTCTG qPCR EDS1 F GTTTCGCAGACAAGTTGAGCC R CTCTGTGTGAACCGATAACGC qPCR PAD4 ACATCGGCTGAAACCTCCTTATT TTTGATAAGTGGTGGGGAAATGA qPCR SGT1 F TTCTCGGTTTTGAGGAAGGG GCAGATACCAAGTGATGTCTACCA qPCR GluA GCCGACTGGGTGAGATGGTAA R ACATTGTTGTGCCCGTGGAC 內(nèi)參基因 Internal reference gene qPCR SmActin F GTCGGAATGGGACAGAAGGATG GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT 1 7 青枯菌接種處理和激素處理 采集大田中感染青枯病的茄子植株樣品 取根部以上 1 2 cm 的莖段 洗凈后用 75 酒精表面 消毒 30 s 無(wú)菌水清洗 2 次 剪碎浸泡于無(wú)菌水中 10 min 觀察到菌噴現(xiàn)象后用移液槍吸取 100 L 菌液涂布于 TTC 固體培養(yǎng)基上 蛋白胨 10 g L 1 酪 蛋 白 1 g L 1 葡 萄 糖 5 g L 1 瓊 脂 17 g L 1 121 20 min 滅菌 pH 7 0 7 2 待冷卻至 60 加入 0 005 TTC 溶液 30 倒置培養(yǎng) 2 3 d 將分離的青枯菌 1 號(hào)生理小種在 TTC 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)劃線 30 培養(yǎng) 2 3 d 獲得單菌落 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2276 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 并將單菌落接種至 TTC 液體培養(yǎng)基 30 200 r min 1 培養(yǎng)過(guò)夜 采用傷根灌菌法 將茄子的根部用小刀劃傷后每盆灌溉菌液 50 mL 保持植株水分充足 將青 枯菌接種于 4 5 片真葉期的高抗和高感茄子自交系幼苗 將幼苗放置于 28 30 14 h 光照 24 26 10 h 黑暗的環(huán)境中培養(yǎng) 后觀察并記錄植株發(fā)病情況 對(duì) 4 5 片真葉的高抗茄子自交系幼苗葉片噴施水楊酸 SA 7 2 mg L 1 茉莉酸甲酯 MeJA 1 mg L 1 及乙烯利 Eth 0 5 g L 1 Jia et al 2013 Jiang et al 2015 周大祥和熊書 2015 Hussain et al 2018 Mahesh Sharada 2018 Ahmad et al 2021 待所有葉片布滿水珠為止 接種和激素處理后 0 24 h 內(nèi)分 5 6 次取葉片樣品進(jìn)行 RNA 提取及 qRT PCR 檢測(cè) 引物如表 2 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù) 數(shù)據(jù)處理方法采用 2 ct 顯著性差異處理方法采用 LSD 多重比較 1 8 病毒誘導(dǎo)的基因沉默 VIGS 及信號(hào)基因表達(dá)分析 將攜帶 pTRV2 SmSP1 pTRV2 SmSPL2 pTRV2 SmDDA1a1 pTRV2 SmDDA1a2 重組質(zhì)粒的農(nóng) 桿菌菌液在 YEP 固體培養(yǎng)基上劃線 28 培養(yǎng) 2 d 后挑取單菌落至 YEP 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 將 農(nóng)桿菌菌液 5 000 r min 1 離心 5 min 去上清 加入侵染液 10 mmol L 1 MgCL 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 AS 重懸菌體 28 黑暗靜置活化 1 2 h 選取生長(zhǎng)至 4 5 片真葉的茄子高抗自交 系植株 將上述攜帶重組質(zhì)粒和 pTRV1 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染液 1 1 體積比 混合后 注射至該茄子 植株所有葉片 使之呈水漬狀 將茄子放置于 16 黑暗環(huán)境中 1 d 后正常培養(yǎng) 每隔 1 周進(jìn)行 RNA 檢測(cè)至目的基因在植株中沉默 將對(duì)照及沉默植株接種青枯菌觀察表型并統(tǒng)計(jì)病情發(fā)病率和病情指數(shù) 病情等級(jí)參考 Qiu 等 2019 的分級(jí) 茄子對(duì)青枯病抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)為 高抗 HR 病株率 20 抗病 R 20 病株率 40 耐病 MR 40 病株率 60 感病 S 60 病株率 佘小漫 等 2011 李濤 等 2017 對(duì) SA 途徑信號(hào)基因 EDS1 SMEL 006g263300 1 01 NPR1 SMEL 000g071090 1 01 TGA SMEL 010g361040 1 01 GluA SMEL 001g150160 1 01 PA D 4 SMEL 002g157190 1 01 及 SGT1 SMEL 006g251310 1 01 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行 qRT PCR 檢測(cè) 引物如表 2 所示 2 結(jié)果與分析 2 1 E3 泛素連接酶基因的克隆及其生物信息 利用本課題組前期所測(cè)青枯菌處理 7 d 后的茄子高抗 E 31 及高感 E 32 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) Chen et al 2018 獲得有表達(dá)的單體 RING 型 E3 連接酶基因 406 個(gè) CRL SCF 基因 260 個(gè) CRL BTB 基 因 83 個(gè) DWD 型 E3 基因 219 個(gè) DDA1 CRL DDB 型 E3 的底物受體 基因 4 個(gè) 從單體 RING 型 E3 和 DDA1 的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)中各挑選 2 個(gè)基因進(jìn)行克隆 分別命名為 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 SmDDA1a2 其中 SmSP1 在抗病材料接種青枯菌 7 d 后表達(dá)升高 在感病材料中降低 SmSPL2 在感病材料接種青枯菌 7 d 后表達(dá)升高 在抗病材料中下降 SmDDA1a1 在感病材料接種前 后的表達(dá)差異較大 SmDDA1a2 在抗病材料接種前后表達(dá)差異較大 圖 1 A SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 最大開(kāi)放閱讀框 ORF 分 別 為 1 029 bp 1 185 bp 330 bp 及 282 bp 分別編碼 343 395 110 及 94 個(gè)氨基酸 此外 SmSP1 和 SmSPL2 結(jié)構(gòu)域均為 GIDE 和 RING SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 均只有 DDA1 結(jié)構(gòu)域 且通過(guò)基因序列比對(duì)及茄子基因 王亦棲 顏爽爽 余炳偉 甘雨薇 邱正坤 朱張生 陳長(zhǎng)明 曹必好 茄子青枯病抗性相關(guān)的 E3 泛素連接酶基因的篩選及鑒定 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 10 2271 2287 2277 組 v4 Barchi et al 2019 分析發(fā)現(xiàn) SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 是同一個(gè)基因的不同可變剪切體 圖 1 B 圖 1 茄子高抗和高感自交系 E 31 和 E 32 接種青枯菌 0 d 和 7 d 后 4 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組熱圖 A 及其結(jié)構(gòu)域 B Fig 1 The transcriptome heat map A and domain B of four genes of eggplant inbred lines with high resistance and high susceptibility E 31 and E 32 inoculated with Ralstonia solanacearum 0 and 7 days SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 與擬南芥 Arabidopsis thaliana 水稻 Oryza sativa 番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 馬鈴薯 Solanum tuberosum 和 煙草 Nicotiana tabacum 的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì) 結(jié)果顯示 4 個(gè) E3 泛素連接酶的結(jié)構(gòu)域在上述 物種中都較為保守 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明 SmSP1 與辣椒 CaSP1 同源性最高 SmSPL2 與番茄 SlSPL2 及馬鈴薯 StSPL2 親緣關(guān)系最近 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 與番茄 SlDDA1 和馬鈴薯 StDDA1 高度同源 2 2 E3 泛素連接酶的亞細(xì)胞定位 對(duì) SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測(cè) 從結(jié)果推斷 SmDDA1a2 僅定位于細(xì)胞核 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 除定位于細(xì)胞核外 還在細(xì)胞的其他部位表達(dá) 圖 2 2 3 E3 泛素連接酶基因表達(dá)的組織特異性 對(duì) SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 在茄子高抗青枯病材料 E 31 和高感青枯病材料 E 32 中的表達(dá)組織特異性進(jìn)行分析 結(jié)果 圖 3 表明 4 個(gè)基因在兩個(gè)材料的根 莖和葉中均有 表達(dá) 且高抗材料均高于高感材料 表達(dá)具有組織器官特異性 葉中表達(dá)量最高 莖部次之 根中 最低 2 4 青枯菌誘導(dǎo) E3 連接酶基因表達(dá) 在茄子高抗和高感兩個(gè)自交系接種青枯菌后 4 個(gè)基因均被青枯菌誘導(dǎo)表達(dá) 但表達(dá)模式不同 隨接種時(shí)間的延長(zhǎng) SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的表達(dá)量在高抗性自交系中均呈 上升趨勢(shì) 在高感病自交系中呈下降趨勢(shì) 圖 4 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2278 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 2 5 激素誘導(dǎo) E3 泛素連接酶基因表達(dá) 利用水楊酸 SA 茉莉酸甲酯 MeJA 和乙烯利 Eth 對(duì)茄子青枯病高抗性自交系進(jìn)行處 理 結(jié)果 圖 5 表明 外施 SA 6 h 后可誘導(dǎo) SmSP1 表達(dá) 外施 MeJA 12 h 后可誘導(dǎo) SmSPL2 SmDDA1a1 和 S