園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2022 0741 http www ahs ac cn 2257 收稿日期 2023 04 21 修回日期 2023 09 03 基金項目 新疆自治區(qū)科技援疆項目 2020E02094 農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新穩(wěn)定支持項目 xjnkywdzc 2022004 通信作者 Author for correspondence E mail 779556527 609160628 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研 究 何亞芳 1 2 包慧芳 2 王 寧 2 詹發(fā)強 2 張學(xué)軍 3 史應(yīng)武 2 楊 蓉 2 侯新強 2 龍宣杞 2 1 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 烏魯木齊 830046 2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所 新疆特殊環(huán)境微生物重 點實驗室 烏魯木齊 830091 3 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心 烏魯木齊 830091 摘 要 以新疆喀什地區(qū)伽師縣鹽堿地土壤為材料 通過平板對峙法和瓊脂擴散法篩選獲得對腐皮 鐮刀菌 Fusarium solani BM1 具有顯著拮抗作用的菌株 JS6 1 和 JS3 4 兩菌株發(fā)酵上清液對甜瓜果腐 病病原菌的抑菌圈直徑分別為 22 90 和 21 05 mm 通過形態(tài)學(xué)觀察 生理生化試驗和 16s rRNA 基因序列 分析初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus velezensis JS6 1 和暹羅芽孢桿菌 Bacillus siamensis JS3 4 抑菌譜 測定結(jié)果表明兩株菌對尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum KW1 香梨黑斑病菌鏈格孢菌 Alternatia alternata HB2 香梨腐爛病菌 Valsa mali var pyri FL1 等 9 種植物病原菌均有較強的抑制作用 酶活及產(chǎn)鐵載體測 定結(jié)果表明 兩株菌可產(chǎn)生纖維素酶 蛋白酶 淀粉酶 葡聚糖酶和鐵載體等物質(zhì) 采用酸沉淀法提取 兩株菌脂肽類物質(zhì) 并以腐皮鐮刀菌 Fusarium solani BM1為指示菌進行抑菌試驗結(jié)果表明 兩株菌脂肽 類粗提物對病原菌的抑菌圈直徑分別為 20 55 和 19 05 mm 對病原菌孢子萌發(fā)抑制率分別為 100 和 93 77 綜上 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 對鐮刀菌屬病原菌具有較好的拮抗效果 具有進一步開發(fā)為生防菌 劑的潛力 關(guān)鍵詞 甜瓜 鐮刀菌 果腐病 生防菌 采后保鮮 中圖分類號 S 652 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 0513 353X 2023 10 2257 14 Screening of Antagonistic Bacteria Against Fusarium spp Causing Melon Fruit Rot and the Antagonistic Properties HE Yafang 1 2 BAO Huifang 2 WANG Ning 2 ZHAN Faqiang 2 ZHANG Xuejun 3 SHI Yingwu 2 YANG Rong 2 HOU Xinqiang 2 and LONG Xuanqi 2 1 College of Life Sciences and Technology Xinjiang University Urumqi 830046 China 2 Xinjiang Key Laboratory of Special Environmental Microbilogy Institute of Microbiology Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830091 China 3 The Research Center of Hami melon Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830091 China Abstract In this study the antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 against Fusarium solani BM1 were screened from the saline alkali soil of Jiashi County Kashgar Xinjiang by plate confrontation method and the agar diffusion method The diameters of the inhibition zone of the melon and fruit rot pathogens were 22 90 and 21 05 mm respectively JS6 1 and JS3 4 were identified as Bacillus velezensis and Bacillus He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2258 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 siamensis by morphological observation physiological and biochemical tests as well as 16s rRNA gene sequence analysis respectively The results of bacteriostatic spectrum showed that the two strains had strong inhibitory effect to nine plant pathogens such as Fusarium oxysporum KW1 Alternatia alternata HB2 fragrant pear rot pathogen Valsa mali var pyri FL1 and so on The results of enzyme activity and iron carrier determination showed that the two strains could produce cellulase protease amylase glucanase and iron carrier Lipopeptides of two strains were extracted by acid precipitation method and bacteriostatic experiments were carried out against Fusarium solani BM1 The results showed that the diameters of bacteriostatic zone of the lipopeptides were 20 55 and 19 05 mm and the inhibition rate against spore germination of pathogenic bacteria were 100 and 93 77 respectively In conclusion JS6 1 and JS3 4 have good antagonistic effect against Fusarium solani and are expected to be used in the biological control of melon fruit rot Keywords melon Fusarium spp fruit rot biocontrol bacteria postharvest preservation 甜瓜 Cucumis melo L 為新疆特色瓜果資源 據(jù)統(tǒng)計中國甜瓜總產(chǎn)量約為 305 6 萬 t 其中新 疆甜瓜總產(chǎn)量約為 165 萬 t 占全國產(chǎn)量的 50 以上 Ritschel et al 2004 楊鴻基 等 2022 然 而甜瓜由于采摘期短又值高溫季節(jié) 且果實糖度高 含水量大 貯藏和運輸過程中極易受到病菌侵 染而腐爛變質(zhì) 造成巨大經(jīng)濟損失 Cui et al 2022 其中由腐皮鐮刀菌 尖孢鐮刀菌等鐮刀菌屬 Fusarium spp 病原菌侵染引起的果腐病是主要病害 Sharma et al 2018 武華文 2020 由 于化學(xué)殺菌劑防腐保鮮存在藥劑殘留 環(huán)境污染和易產(chǎn)生耐藥性等問題 Deng et al 2015 低成 本 安全無毒 污染小的生物保鮮已成為果蔬防腐保鮮技術(shù)發(fā)展的新方向 魏雪 等 2021 張曉勇 等 2021 本研究中采集了新疆喀什地區(qū)伽師縣鹽堿地土壤 通過平板對峙法和瓊脂擴散法篩選出對甜瓜 果腐病致病菌具有明顯拮抗作用的生防菌 并進行抑菌活性研究 評估其生防潛力及作用機理 以 期為甜瓜鐮刀菌果腐病的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源 為后續(xù)生防制劑的研制與應(yīng)用提供理論基 礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗材料 土壤樣品 采自新疆喀什地區(qū)伽師縣鹽堿地 抑菌譜供試菌株 致病菌腐皮鐮刀菌 Fusarium solani BM1 香梨腐爛病菌 Valsa mali var pyri FL1 和香梨黑斑病菌鏈格孢菌 Alternatia alternata HB2 均由本實驗室分離及保存 甜瓜枯萎病 菌 Fusarium oxysporum KW1 由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供 馬鈴薯黑痣病菌立枯絲核 菌 Rhizoctonia solani ZN5 馬鈴薯早疫病菌茄病鏈格孢菌 Alternatia solani ZN6 西瓜枯萎病尖 孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum ZN10 水稻惡苗串珠鐮刀菌 Fusarium moniliforme ZN12 番茄 早疫病菌茄鏈格孢菌 Alternatia solani ZN18 和核桃腐爛病 Cytcospora sp ZN19 由中國農(nóng)業(yè)大 學(xué)種子健康中心贈與 何亞芳 包慧芳 王 寧 詹發(fā)強 張學(xué)軍 史應(yīng)武 楊 蓉 侯新強 龍宣杞 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究 園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 2259 1 2 拮抗菌篩選 稱取 5 g 土壤樣品于 45 mL 無菌水中 28 180 r min 1 恒溫搖床上震蕩 30 min 用無菌水依 次稀釋 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 倍 分別取 100 L 各梯度土壤稀釋液涂布至 NA 培養(yǎng)基平板上 于 30 恒溫培養(yǎng) 2 d 選擇梯度合適的平板 挑取形態(tài)差異明顯的單菌落在 NA 培養(yǎng)基上劃線純化并 編號保存?zhèn)溆?制備 PDA 培養(yǎng)基平板 在其中央接種直徑為 9 mm 的腐皮鐮刀菌 BM1 菌餅作為指 示菌 采用十字交叉法將分離純化好的單菌落點接于距離菌餅中心 2 5 cm處 以只接種病原菌的平 板為對照 每個處理重復(fù) 3 次 置于 28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d 后觀察抑菌效果 測量抑菌帶寬度 挑選抑菌效果良好的拮抗菌菌株進行復(fù)篩 將拮抗菌分別接種于 NA 平板上劃線培養(yǎng) 48 h 挑取單菌落接種至滅菌的 LB 液體培養(yǎng)基 王 瑞昊 等 2021 中 于 30 180 r min 1 恒溫搖床振蕩培養(yǎng) 12 h 得到拮抗菌種子液 將種子液按 照 1 的接種量接種至 100 mL LB 液體培養(yǎng)基中 于 30 180 r min 1 恒溫搖床培養(yǎng) 48 h 將發(fā)酵 液移入無菌離心管 于 10 000 r min 1 離心 20 min 制得拮抗菌發(fā)酵上清液 將 100 L 的病原菌孢 子懸浮液 10 7 CFU mL 1 均勻涂布于 PDA 培養(yǎng)基平板上 采用滅菌的打孔器 直徑 9 mm 在 平板上打孔 并加入 50 L 發(fā)酵上清液 于 28 培養(yǎng) 4 d 后觀察并記錄抑菌圈直徑 1 3 抑菌譜測定 將篩選出的拮抗菌株分別與 9 種抑菌譜供試菌株進行平板對峙試驗 將病原菌菌餅接種于 PDA 培養(yǎng)基中央 將拮抗菌以十字交叉法點接于距離病原菌菌餅中心位置 2 5 cm處 以只接種病原菌的 平板為對照 置于 28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 7 d 后觀察抑菌效果 待對照病原菌長滿平板后 測 量抑菌帶寬度 抑菌率 對照菌落直徑 處理菌落直徑 對照菌落直徑 100 1 4 拮抗菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定 將拮抗菌用劃線法接種至 NA 培養(yǎng)基平板上 30 培養(yǎng) 48 h 進行菌落形態(tài)特征 觀察 記錄菌落生長情況 顏色 質(zhì)地和形態(tài)特征等 并進行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察 生理生化試驗 參照 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊 東秀珠和蔡妙英 2001 及 伯杰氏細菌鑒 定手冊 Buchanan Gibbons 1984 的方法對菌株進行生理生化測定 生長特性測定 挑取單菌落接種至 100 mL LB 液體培養(yǎng)基中 30 180 r min 1 搖床振蕩培 養(yǎng) 12 h 作為種子液 分別設(shè)置不同梯度 pH 值 3 0 5 0 7 0 9 0 11 0 不同 NaCl 濃度 2 5 5 7 5 8 8 5 9 9 5 10 和不同溫度 4 25 37 50 和 60 按 1 的接種量 接入 LB 液體培養(yǎng)基中 30 180 r min 1 培養(yǎng) 48 h 觀察生長情況并記錄 16S rRNA 分子生物學(xué)鑒定 使用細菌基因組 DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株的 DNA 利用細 菌通用引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 Myo et al 2019 擴增 16S rRNA 基因序列 PCR 預(yù)混液體系 50 L 2 PCR 緩沖液 25 L DNA 模板 2 L 上 下游引物各 1 L 用 ddH 2 O 補至 50 L 反應(yīng)條件 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 45 s 57 退火 30 s 72 延伸 90 s 30 個循環(huán) 72 延伸 10 min 采用 1 5 瓊脂糖凝膠電 泳進行 PCR 產(chǎn)物檢測后將 PCR 擴增產(chǎn)物送至生工生物工程 上海 股份有限公司進行 16S rRNA 測序 將測序所得序列提交至 https NCBI 數(shù)據(jù)庫申請基因登錄 號 采用 MEGA7 0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2260 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 1 5 拮抗菌生長曲線和產(chǎn)鐵載體測定 挑取活化后的拮抗菌單菌落接種至 50 mL LB 液體培養(yǎng)基中 于 30 搖床 180 r min 1 振蕩培 養(yǎng) 12 h 后獲得種子液 按 1 的接種量轉(zhuǎn)接至含有 100 mL LB 培養(yǎng)液內(nèi) 同樣條件培養(yǎng) 每 2 h 取 樣 1 次 96 h 后結(jié)束取樣 通過比色法測定菌液的 OD 600 值 以 LB 培養(yǎng)液為空白對照 產(chǎn)鐵載體 定性測定 挑取拮抗菌單菌落接種至 MKB CAS 固體平板 楊常娥 等 2017 30 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d 每個處理重復(fù) 3 次 產(chǎn)鐵載體 定量測 參照文獻 何翔 等 2020 將培養(yǎng) 12 h 的拮抗菌種子液按 1 接種量轉(zhuǎn) 接 100 mL 無菌 MKB 液體培養(yǎng)基中 30 180 r min 1 振蕩培養(yǎng) 72 h 10 000 r min 1 離心 10 min 取上清液與等體積的 CAS 檢測液混合 靜置 1 h 后在紫外可見分光光度計 630 nm 處測量吸光度值 As 空白培養(yǎng)基 630 nm 處的吸光度值為對照 Ar 鐵載體活性單位 Su Ar As Ar 100 1 6 菌株產(chǎn)酶能力測定 淀粉酶測定 將活化好的拮抗菌接種淀粉酶檢測培養(yǎng)基平板 劉延波 等 2020 中 于 30 培養(yǎng) 72 h 在培養(yǎng)皿中加入碘液 顯色后棄去培養(yǎng)皿中的碘液 觀察是否產(chǎn)生透明圈 蛋白酶 幾丁質(zhì)酶測定 將活化好的拮抗菌分別接種于蛋白酶檢測 幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基 韓松 2011 陳顯玲 2014 中 于 30 培養(yǎng) 72 h 觀察是否產(chǎn)生透明圈 纖維素酶測定 將活化好的拮抗菌接種于纖維素酶檢測培養(yǎng)基 金偉 等 2017 中 于 30 培養(yǎng) 72 h 在培養(yǎng)皿中加入 1 mg mL 1 的剛果紅染液 染色 1 h 棄染液 加入 1 mol L 1 的氯化鈉 溶液脫色 30 min 棄去脫色液觀察是否產(chǎn)生透明圈 葡聚糖酶測定 將活化好的拮抗菌接種于葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基 韓松 2011 中 于 30 培養(yǎng) 72 h 觀察是否產(chǎn)生水解圈 根據(jù)菌株產(chǎn)酶定性結(jié)果進行定量測定 纖維素酶 葡聚糖酶和淀粉酶的酶活力的定量采用 DNS 法 蛋白酶酶活力測定采用福林酚法 崔小蕾 2017 1 7 脂肽類粗提物的提取 抑菌活性測定及對病原菌孢子萌發(fā)的影響 將拮抗菌發(fā)酵液于 4 8 000 r min 1 離心 20 min 取上清液 用 6 mol L 1 的鹽酸調(diào)節(jié)至 pH 2 0 4 冰箱沉淀過夜后 4 8 000 r min 1 離心 20 min 取上清液 用甲醇溶解沉淀 并采用 1 mol L 1 NaOH 調(diào)節(jié)至 pH 7 0 室溫萃取 8 h 4 10 000 r min 1 離心 20 min 取上清液 同樣方法萃取 3 次 合并萃取液 以腐皮鐮刀菌 F solani BM1 為指示菌 采用瓊脂擴散法測定脂肽粗提物拮抗效果 田丹丹 等 2020 用 28 恒溫培養(yǎng)箱中生長 7 d 的病原菌制備成孢子懸浮液 并調(diào)整濃度至 10 7 CFU mL 1 分 別與稀釋 10 10 2 10 3 10 4 倍的脂肽粗提液按照 1 1 混合 以無菌 NB 培養(yǎng)液與孢子懸浮液等體 積混合為對照 每組試驗重復(fù) 3 次 于 28 下 180 r min 1 振蕩培養(yǎng) 10 h 觀察孢子萌發(fā)情況 計 算孢子萌發(fā)抑制率 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗菌的分離篩選 從新疆喀什地區(qū)伽師縣鹽堿地土壤中共分離純化出 58 株細菌菌株 通過平板對峙試驗 篩選 何亞芳 包慧芳 王 寧 詹發(fā)強 張學(xué)軍 史應(yīng)武 楊 蓉 侯新強 龍宣杞 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究 園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 2261 出 11 株對甜瓜果腐病病原菌有較強拮抗作用的菌株 其中 5 株抑菌帶寬度大于 5 mm 表 1 菌株 JS6 1 與 JS3 4 的抑菌帶寬度最寬 分別為 7 39 和 6 67 mm 拮抗效果較強 表 1 圖 1 采用瓊脂擴散法對初篩所獲得的 5 株具有較強抑菌活性的菌株進行復(fù)篩 發(fā)現(xiàn)菌株 JS6 1 和 JS3 4 的發(fā)酵上清液對甜瓜果腐病病原菌的抑制效果顯著高于其他菌株 其抑菌圈直徑分別為 22 90 和 21 05 mm 表 1 圖 1 表 1 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選結(jié)果 Table 1 Screening results of antagonistic bacteria against Fusarium melon fruit rot 菌株 Strain 抑菌帶寬度 mm Inhibition zone width 發(fā)酵上清液抑菌圈直徑 mm The fermentation supernatant inhibition zone diameter JS6 1 7 39 0 07 a 22 90 0 74 a JS3 4 6 67 0 08 b 21 05 0 28 b JS1 1 5 74 0 17 c 13 29 0 11 c JS55 2 5 12 0 11 d 9 81 0 47 d JS15 5 08 0 21 d 9 27 0 30 d 注 表中數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 同列不同字母表示差異顯著 P 0 05 Note The data were average SD The different letters indicate significant difference at 0 05 level 圖 1 拮抗菌 JS6 1 A JS3 4 B 及其發(fā)酵上清液 C 對腐皮鐮刀菌的拮抗作用 Fig 1 Antagonistic effect of antagonistic bacteria JS6 1 A JS3 4 B and their fermentation supernatant C on Fusarium solani 2 2 拮抗菌抑菌譜測定 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 對供試 9 株病原菌都有不同程度的抑制作用 表現(xiàn)出較明顯的廣譜性抑 制效果 抑菌率為 50 76 表 2 圖 2 菌株 JS6 1 對病原真菌 KW1 ZN6 和 ZN18 的拮抗效 果優(yōu)于 JS3 4 而 JS3 4 對病原真菌 ZN5 ZN12 和 ZN19 的拮抗效果優(yōu)于 JS6 1 表 2 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 的抑菌譜 Table 2 Antibacterial spectrum of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 病原菌 抑菌率 Inhibition rate Pathogen JS6 1 JS3 4 香梨腐爛病菌 Valsa mali var pyri FL1 58 02 1 28 c 59 26 1 44 b 馬鈴薯黑痣病菌立枯絲核菌 Rhizoctonia solani ZN5 51 85 0 42 de 56 79 1 28 bc 番茄早疫病菌茄鏈格孢菌 Alternatia solani ZN18 58 02 1 26 c 53 09 1 91 de 核桃腐爛病 Cytcospora sp ZN19 70 41 2 22 a 75 37 1 18 a 甜瓜枯萎病 Fusarium oxysporum KW1 59 32 0 84 c 54 60 0 74 cd 水稻惡苗串珠鐮刀菌 F moniliforme ZN12 54 26 1 48 d 58 52 1 29 b 馬鈴薯早疫病菌茄病鏈格孢菌 A solani ZN6 62 28 1 18 b 57 72 2 17 bc 西瓜枯萎病尖孢鐮刀菌 F oxysporum ZN10 50 12 0 65 e 50 65 1 01 e 香梨黑斑病菌鏈格孢菌 A alternata HB2 58 25 1 26 c 57 98 1 87 bc He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2262 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 圖 2 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 抑菌譜圖 Fig 2 Antibacterial spectrum of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 2 3 拮抗菌鑒定 2 3 1 形態(tài)學(xué)鑒定 拮抗菌株 JS6 1 菌落為圓形 白色 不透明 邊緣不整齊 表面褶皺 革蘭氏染色呈陽性 菌 體桿狀 拮抗菌株 JS3 4 菌落呈圓形 乳白色 表面干燥有褶皺 革蘭氏染色呈陽性 菌體桿狀 圖 3 圖 3 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 菌落及菌體形態(tài) Fig 3 Colony and morphology of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 2 3 2 拮抗菌生理生化測定 對上述兩株拮抗菌的生理生化特性 表 3 進行分析 對碳源的利用試驗表明 兩株菌均可利 何亞芳 包慧芳 王 寧 詹發(fā)強 張學(xué)軍 史應(yīng)武 楊 蓉 侯新強 龍宣杞 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究 園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 2263 用葡萄糖 淀粉 甘油 果糖 蔗糖 甘露醇 麥芽糖 海藻糖 但對乳糖的利用存在一定差異 且均不可利用鼠李糖和殼聚糖 對氮源利用試驗結(jié)果表明 兩株菌均可利用硫酸銨 L 酪氨酸 草酸銨 磷酸二氫銨 檸檬酸二銨 但對谷氨酸的利用存在一定差異 兩株菌在明膠液化 淀粉水 解 v p 試驗和接觸酶反應(yīng)均呈陽性 檸檬酸鹽利用 吲哚試驗和 H 2 S 試驗均呈陰性 而甲基紅試 驗中兩株菌存在一定差異 對兩株菌生長特性進行分析 NaCl 濃度 pH 耐受和溫度耐受試驗結(jié)果 表明 JS6 1 在 NaCl 濃度 2 5 9 5 pH 5 0 11 0 溫度 15 50 時生長良好 在 4 條件下 生長較弱 JS3 4 在 NaCl 濃度 2 5 9 0 pH 5 0 9 0 溫度 4 50 時生長良好 在 NaCl 濃 度為 9 5 時生長較弱 由此可見 兩株菌具有較強的鹽堿和溫度耐受能力 表 3 拮抗菌生理生化特性 Table 3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacteria 指標(biāo)分類 Index classification 測定指標(biāo) Identification index JS6 1 JS3 4 氮源利用 Nitrogen source utilization 硫酸銨 Ammonia sulfate 草酸銨 Sodium oxalate 檸檬酸二銨 Ammonium citrate L 酪氨酸 L tyrosine 磷酸二氫銨 Ammonium dihydrogen phosphate 谷氨酸 Glutamate 碳源利用 Carbon source utilization D 葡萄糖 D glucose 甘油 Glycerinum 蔗糖 Saccharose D 果糖 D fructose 乳糖 Lactose 淀粉 Amylum 甘露醇 Mannitol 鼠李糖 Rhamnose 殼聚糖 Chitosan 海藻糖 Trehalose 麥芽糖 Maltose 其他指標(biāo) Other indicators 接觸酶反應(yīng) Contact enzyme test 檸檬酸鹽利用 Citrate utilization 甲基紅 Methy red 明膠液化 Liquefy glutin 淀粉水解 Starch hydrolysis V P 試驗 V P test 吲哚試驗 Indole test 硫化氫 Hydrogen sulfide 生長特性 Growth characteristics NaCl 濃度 NaCl concentration 2 5 9 5 2 5 9 0 生長溫度 Growth temperature 15 50 4 50 pH 5 0 11 0 5 0 9 0 注 陽性 陰性 Note Positive Negative 2 3 3 分子生物學(xué)鑒定 結(jié)果顯示 菌株 JS6 1 與貝萊斯芽孢桿菌同源性達 99 以上 菌株 JS3 4 與暹羅芽孢桿菌同源 性達 99 以上 采用 MEGA7 0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 4 結(jié)果表明 菌株 JS6 1 與貝萊斯芽孢 桿菌在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上 根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征 生理生化試驗及 16S rRNA 基因分子 鑒定 此菌株初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌 基因登錄號為 ON799151 菌株 JS3 4 與暹羅芽孢桿菌在 系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個分支上 根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征 生理生化試驗及 16S rRNA 基因分子鑒定 此菌株初步鑒定為暹羅芽孢桿菌 基因登錄號為 ON799152 He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2264 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 圖 4 基于 16S rRNA 序列構(gòu)建的菌株 JS6 1 和 JS3 4 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 4 Phylogenetic tree of JS6 1and JS3 4 based on 16S rRNA gene sequences 2 4 拮抗菌菌株的生長曲線 由圖 5 可以看出 菌株 JS6 1 在培養(yǎng) 2 4 h 處于延遲生長期 4 10 h 處于對數(shù)生長期 10 h 后進入穩(wěn)定期 72 h 后進入衰退期 菌株 JS3 4 在 2 4 h 處于延遲生長期 4 12 h 處于對數(shù)生長 期 12 h 后進入穩(wěn)定期 生長速度相對穩(wěn)定 由此可知 可選取培養(yǎng) 10 12 h 的培養(yǎng)液作為兩株菌 種子液 圖 5 菌株 JS6 1 和 JS3 4 生長曲線 Fig 5 Growth curves of strains JS6 1 and JS3 4 2 5 拮抗菌菌株產(chǎn)鐵載體的能力 鐵載體可通過和病原菌競爭鐵元素從而達到抑制病原菌生長的效果 是一種重要的生防因子 由圖 6 可以看出 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 在 MKB CAS 培養(yǎng)基上生長良好 兩株菌周圍出現(xiàn)橙黃色 的顯色反應(yīng)以及暈圈 表明兩菌株均可產(chǎn)生鐵載體 如表 4所示 菌株 JS6 1的 As Ar的比值為 0 689 鐵載體活性為 31 10 菌株 JS3 4 的 As Ar 的比值為 0 789 鐵載體活性為 21 11 這表明菌株 JS6 1 分泌鐵載體的能力優(yōu)于菌株 JS3 4 何亞芳 包慧芳 王 寧 詹發(fā)強 張學(xué)軍 史應(yīng)武 楊 蓉 侯新強 龍宣杞 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究 園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 2265 表 4 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 產(chǎn)鐵載體能力 Table 4 The ferritic capacity of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 菌株編號 Strain number As Ar 鐵載體活性 Siderophore activity JS6 1 0 689 0 008 31 10 0 06 JS3 4 0 789 0 015 21 11 0 11 2 6 拮抗菌菌株產(chǎn)酶的能力 2 6 1 溶菌酶定性測定 利用選擇性培養(yǎng)基檢測拮抗菌的產(chǎn)酶活性 產(chǎn)生透明圈代表菌株次生代謝物中含有相應(yīng)的酶 結(jié)果表明 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在淀粉酶 蛋白酶 纖維素酶和葡聚糖酶 4 種檢測培養(yǎng)基上均能產(chǎn) 生脫色圈或透明圈 但在幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基上未形成水解圈 說明兩菌株在生長代謝過程中均產(chǎn) 生纖維素酶 蛋白酶 淀粉酶和葡聚糖酶 圖 6 可能不產(chǎn)幾丁質(zhì)酶 或產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力比較弱 圖 6 纖維素酶 A 蛋白酶 B 淀粉酶 C 和葡聚糖酶 D 選擇性培養(yǎng)基檢測及產(chǎn)鐵載體 E 檢測 Fig 6 Cellulase A protease B amylase C and glucanase D selective medium detection and siderophore detection E 2 6 2 溶菌酶活性測定 結(jié)果 圖 7 表明 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在發(fā)酵期間產(chǎn)蛋白酶 纖維素酶 淀粉酶和葡聚糖酶的 能力整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢 在發(fā)酵 96 h 時產(chǎn)蛋白酶活最高 分別為 13 55 和 13 05 U mL 1 菌株 JS6 1 纖維素酶活在發(fā)酵 72 h 最高 為 5 55 U mL 1 而菌株 JS3 4 纖維素酶活在發(fā)酵 48 h 最 高 為 6 15 U mL 1 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在發(fā)酵 48 h 產(chǎn)淀粉酶和葡聚糖酶活最高 分別為 2 5 和 2 59 U mL 1 5 43 和 7 66 U mL 1 綜上所述 菌株 JS3 4 除蛋白酶外 其他 3 種酶均為 48 h 酶活 最高 而 JS6 1 除蛋白酶和纖維素酶外 其他兩種酶均為 48 h 酶活最高 菌株 JS6 1 產(chǎn)蛋白酶活較 JS3 4 高 而發(fā)酵 48 h 后 JS3 4 產(chǎn)葡聚糖酶活較 JS6 1 高 兩株菌產(chǎn)纖維素酶活和淀粉酶活能力相 當(dāng) He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2266 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 圖 7 菌株 JS6 1 和 JS3 4 的產(chǎn)酶活性 Fig 7 The enzyme activity of strain JS6 1 and JS3 4 was determined 2 7 拮抗菌脂肽粗提物對甜瓜鐮刀菌果腐病的抑制作用 菌株 JS6 1 和 JS3 4 發(fā)酵上清液中的脂肽類粗提物對甜瓜果腐病致病菌抑菌圈直徑分別為 20 55 和 19 05 mm 圖 8 說明兩株菌脂肽類粗提物都能對致病菌腐皮鐮刀菌起較明顯的抑制作用 且 抑菌效果無顯著差異 圖 8 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽類粗提物對致病菌的拮抗作用 Fig 8 Antagonistic effects of crude lipopeptide extracts JS6 1 and JS3 4 on pathogenic bacteria 2 8 拮抗菌脂肽類粗提物對病原菌孢子萌發(fā)的影響 從表 5 可知 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽類粗提物對甜瓜果腐病致病菌孢子萌發(fā)的抑制率隨著稀 何亞芳 包慧芳 王 寧 詹發(fā)強 張學(xué)軍 史應(yīng)武 楊 蓉 侯新強 龍宣杞 甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究 園藝學(xué)報 2023 50 10 2257 2270 2267 釋倍數(shù)的升高而降低 其原液對孢子萌發(fā)的抑制作用最強 抑制率分別為 100 00 和 93 77 在顯 微鏡下觀察發(fā)現(xiàn) 與對照相比 脂肽類粗提物不僅影響孢子萌發(fā) 而且使萌發(fā)的孢子牙管變形 表 5 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽類粗提物稀釋倍數(shù)對致病菌孢子萌發(fā)的影響 Table 5 Antagonistic effects of l