番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 劉 燕 妮 毛 芙 蓉 范 惠 冬 鄭 士 金 吉 林 省 蔬 菜 花 卉 科 學(xué) 研 究 院 長(zhǎng) 春 1 3 0 0 3 3 摘 要 以 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 等 7 株 病 原 細(xì) 菌 為 檢 測(cè) 材 料 以 特 異 性 基 因 t o m A 為 檢 測(cè) 靶 標(biāo) 設(shè) 計(jì) L A M P 引 物 t o m A 1 0 7 t o m A 8 和 相 應(yīng) 的 環(huán) 引 物 t o m A 1 0 7 L F 2 1 t o m A 1 0 7 L B 2 1 針 對(duì) 靶 標(biāo) 基 因 進(jìn) 行 引 物 篩 選 及 引 物 的 特 異 性 和 靈 敏 度 測(cè) 試 結(jié) 果 表 明 t o m A 1 0 7 能 特 異 性 檢 測(cè) 出 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 檢 測(cè) 靈 敏 度 達(dá) 5 1 0 2 c o p y L 環(huán) 引 物 的 加 成 將 反 應(yīng) 進(jìn) 程 縮 短 三 分 之 一 使 整 個(gè) 檢 測(cè) 過(guò) 程 控 制 在 5 0 m i n 內(nèi) 完 成 該 方 法 非 常 適 用 于 C m m 菌 株 的 現(xiàn) 場(chǎng) 快 速 檢 測(cè) 關(guān) 鍵 詞 番 茄 潰 瘍 病 菌 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 L A M P 檢 測(cè) 中 圖 分 類 號(hào) S 4 3 6 4 1 2 1 S 4 3 2 4 2 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 A 文 章 編 號(hào) 2 0 9 6 5 8 7 7 2 0 2 3 0 3 0 1 3 4 0 4 E s t a b l i s h m e n t o f a L A M P M e t h o d f o r D e t e c t i o n o f C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s L I U Y a n n i M A O F u r o n g F A N H u i d o n g Z H E N G S h i j i n J i l i n A c a d e m y o f V e g e t a b l e s a n d F l o w e r s C h a n g c h u n 1 3 0 0 3 3 C h i n a A b s t r a c t I n t h i s s t u d y e i g h t b a c t e r i a l s t r a i n s i n c l u d i n g C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s C m m w e r e u s e d a s t e s t m a t e r i a l s w i t h t h e s p e c i f i c g e n e t o m A a s t h e d e t e c t i o n t a r g e t L A M P p r i m e r s t o m A 1 0 7 a n d t o m A 8 a s w e l l a s t h e c o r r e s p o n d i n g l o o p p r i m e r s t o m A 1 0 7 L F 2 1 a n d t o m A 1 0 7 L B 2 1 w e r e d e s i g n e d T h e p r i m e r s p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y t e s t s w e r e c o n d u c t e d f o r t h e t a r g e t g e n e a n d t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r i m e r t o m A 1 0 7 c o u l d s p e c i f i c a l l y d e t e c t C m m T h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f p r i m e r t o m A 1 0 7 r e a c h e d 5 1 0 2 c o p i e s L f o r C m m T h e a d d i t i o n o f l o o p p r i m e r s s h o r t e n e d t h e r e a c t i o n p r o c e s s b y o n e t h i r d e n a b l i n g t h e e n t i r e d e t e c t i o n p r o c e s s t o b e c o m p l e t e d w i t h i n 5 0 m i n u t e s T h i s m e t h o d i s h i g h l y s u i t a b l e f o r r a p i d o n s i t e d e t e c t i o n o f C m m b a c t e r i a l s t r a i n s K e y w o r d s C m m L A M P D e t e c t i o n 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 B a c t e r i a l c a n k e r o f t o m a t o 是 由 密 執(zhí) 安 棒 狀 桿 菌 密 執(zhí) 安 亞 種 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s 以 下 簡(jiǎn) 稱 為 C m m 引 起 的 系 統(tǒng) 性 維 管 束 病 害 1 C m m 可 通 過(guò) 多 種 方 式 進(jìn) 行 傳 播 主 要 通 過(guò) 帶 菌 種 子 和 種 苗 進(jìn) 行 遠(yuǎn) 距 離 傳 播 通 過(guò) 農(nóng) 事 操 作 及 雨 水 進(jìn) 行 近 距 離 傳 播 自 然 條 件 下 C m m 在 種 子 上 可 存 活 8 個(gè) 月 以 上 在 植 物 病 殘 體 上 可 在 土 壤 糞 肥 中 存 活 2 3 年 2 C m m 在 番 茄 的 整 個(gè) 生 育 過(guò) 程 中 均 可 侵 染 植 株 引 發(fā) 病 害 病 害 一 旦 發(fā) 生 便 很 難 防 治 相 關(guān) 研 究 表 明 番 茄 植 株 染 病 后 不 會(huì) 馬 上 表 現(xiàn) 癥 狀 只 有 當(dāng) 植 物 體 內(nèi) 的 C m m 濃 度 達(dá) 到 1 1 0 8 1 1 0 9 c f u m L 收 稿 日 期 2 0 2 0 0 1 1 3 基 金 項(xiàng) 目 吉 林 省 重 點(diǎn) 科 技 攻 關(guān) 項(xiàng) 目 2 0 1 4 0 2 0 4 0 3 2 N Y 作 者 簡(jiǎn) 介 劉 燕 妮 1 9 8 8 女 助 理 研 究 員 碩 士 從 事 蔬 菜 病 害 綜 合 防 治 研 究 通 訊 作 者 毛 芙 蓉 女 碩 士 副 研 究 員 E m a i l 1 8 5 0 4 3 1 5 1 2 3 1 6 3 c o m 時(shí) 番 茄 才 會(huì) 表 現(xiàn) 出 被 害 癥 狀 3 因 此 進(jìn) 行 番 茄 細(xì) 菌 性 病 原 菌 的 早 期 檢 測(cè) 能 及 早 干 預(yù) 治 療 以 便 有 效 控 制 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 的 發(fā) 生 蔓 延 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 技 術(shù) l o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n L A M P 是 一 項(xiàng) 體 外 快 速 擴(kuò) 增 D N A 的 技 術(shù) 4 其 特 點(diǎn) 為 選 取 檢 測(cè) 基 因 的 6 個(gè) 特 異 性 位 點(diǎn) 設(shè) 計(jì) 引 物 進(jìn) 行 特 異 性 擴(kuò) 增 具 有 高 特 異 性 整 個(gè) 反 應(yīng) 過(guò) 程 可 在 恒 溫 水 浴 鍋 內(nèi) 完 成 操 作 簡(jiǎn) 單 檢 測(cè) 結(jié) 果 可 通 過(guò) 肉 眼 觀 察 具 有 簡(jiǎn) 便 高 效 的 特 點(diǎn) 目 前 L A M P 檢 測(cè) 方 法 已 廣 泛 應(yīng) 用 于 醫(yī) 療 檢 測(cè) 5 6 養(yǎng) 殖 7 水 產(chǎn) 8 食 品 安 全 9 農(nóng) 業(yè) 1 0 1 1 等 行 業(yè) 領(lǐng) 域 本 研 究 在 傳 統(tǒng) P C R 基 礎(chǔ) 之 上 探 索 L A M P 檢 測(cè) 體 系 建 立 了 一 套 針 對(duì) 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 的 快 速 檢 測(cè) 方 法 該 方 法 快 速 高 效 受 環(huán) 境 限 制 小 操 作 簡(jiǎn) 單 更 適 用 于 推 廣 應(yīng) 用 1 材 料 與 方 法 1 1 供 試 菌 株 本 研 究 以 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 等 7 株 病 原 細(xì) 東 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 2 3 4 8 3 1 3 4 1 3 7 Journal of Northeast Agricultural Sciences D O I 1 0 1 6 4 2 3 j c n k i 1 0 0 3 8 7 0 1 2 0 2 3 0 3 0 2 8 劉 燕 妮 等 番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 的 建 立3 期 劉 燕 妮 等 番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 1 3 5 菌 為 檢 測(cè) 材 料 分 別 為 由 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 種 子 病 理 中 心 提 供 的 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s 廣 東 省 微 生 物 保 存 中 心 提 供 的 番 茄 青 枯 假 單 胞 菌 和 茄 青 枯 假 單 胞 菌 P s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m 本 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存 的 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s e s u b s p s e p e d o n i c u m 和 馬 鈴 薯 瘡 痂 病 菌 S t r e p t o m y c e s s c a b i e s 由 吉 林 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 植 物 病 理 實(shí) 驗(yàn) 室 提 供 的 黃 瓜 角 斑 病 菌 P s e u d o m o n a s s y r i n g a e p v L a c h r y m a n s 和 西 瓜 果 斑 病 菌 P s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e s s u b s p c i t r u l l i 1 2 L A M P 反 應(yīng) 體 系 的 建 立 1 2 1 細(xì) 菌 基 因 組 D N A 的 提 取 將 供 試 菌 活 化 培 養(yǎng) 后 轉(zhuǎn) 到 液 體 培 養(yǎng) 基 中 恒 溫 振 蕩 培 養(yǎng) 至 菌 液 濃 度 為 1 0 8 c f u m L 將 培 養(yǎng) 的 菌 株 使 用 細(xì) 菌 基 因 組 提 取 試 劑 盒 提 取 菌 體 D N A 并 用 N D 1 0 0 0 分 光 光 度 計(jì) 檢 測(cè) 提 取 的 D N A 質(zhì) 量 和 濃 度 2 0 保 存 備 用 1 2 2 L A M P 引 物 設(shè) 計(jì) 參 照 P C R 的 試 驗(yàn) 結(jié) 果 1 2 針 對(duì) t o m A 基 因 設(shè) 計(jì) L A M P 反 應(yīng) 內(nèi) 外 引 物 及 環(huán) 引 物 見 表 1 引 物 由 生 工 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 上 海 合 成 利 用 設(shè) 計(jì) 合 成 的 內(nèi) 外 引 物 及 環(huán) 引 物 使 用 通 用 型 恒 溫 實(shí) 時(shí) 熒 光 試 劑 盒 廣 州 華 峰 生 產(chǎn) 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 使 用 時(shí) 引 物 均 稀 釋 到 1 0 0 M 1 2 3 L A M P 反 應(yīng) 體 系 反 應(yīng) 體 系 2 L A M P r e a c t i o n m i x t u r e 1 2 5 L 熒 光 染 料 0 2 5 L B s t 酶 0 5 L 引 物 1 0 L 內(nèi) 外 引 物 終 濃 度 分 別 為 1 6 0 2 M 環(huán) 引 物 1 0 0 M 0 2 L 終 濃 度 為 0 8 M D N A 模 板 2 0 L 水 定 容 至 2 5 L 反 應(yīng) 程 序 6 3 保 持 7 0 m i n 環(huán) 引 物 加 成 后 使 用 廣 州 華 峰 生 產(chǎn) 的 凍 干 通 用 型 恒 溫 實(shí) 時(shí) 熒 光 試 劑 盒 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 反 應(yīng) 體 系 復(fù) 溶 液 1 5 L 引 物 1 0 L 內(nèi) 外 引 物 終 濃 度 分 別 為 1 6 0 2 M 環(huán) 引 物 1 0 0 M 0 2 L 終 濃 度 為 0 8 M D N A 模 板 2 5 L 水 定 容 至 2 5 L 反 應(yīng) 程 序 6 3 保 持 7 0 m i n 1 2 4 L A M P 方 法 引 物 篩 選 將 設(shè) 計(jì) 好 的 不 同 引 物 加 到 反 應(yīng) 體 系 中 進(jìn) 行 等 溫 擴(kuò) 增 采 用 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 P C R 儀 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 并 在 每 個(gè) 循 環(huán) 結(jié) 束 時(shí) 讀 取 熒 光 信 號(hào) 值 1 2 5 L A M P 方 法 特 異 性 檢 測(cè) 以 供 試 菌 株 的 D N A 模 板 為 檢 測(cè) 對(duì) 象 無(wú) 菌 水 為 空 白 對(duì) 照 驗(yàn) 證 L A M P 檢 測(cè) 的 特 異 性 檢 測(cè) 結(jié) 果 通 過(guò) 三 種 不 同 方 法 進(jìn) 行 判 斷 分 別 為 采 用 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 P C R 儀 器 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 在 每 個(gè) 循 環(huán) 結(jié) 束 時(shí) 讀 取 熒 光 信 號(hào) 值 對(duì) L A M P 產(chǎn) 物 用 2 瓊 脂 糖 凝 膠 進(jìn) 行 電 泳 檢 測(cè) 將 L A M P 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 離 心 使 管 蓋 上 的 顯 色 物 質(zhì) 進(jìn) 入 產(chǎn) 物 觀 察 顯 色 情 況 1 2 6 L A M P 方 法 靈 敏 度 檢 測(cè) 提 取 番 茄 潰 瘍 病 菌 的 D N A 并 進(jìn) 行 不 同 濃 度 的 稀 釋 使 其 終 濃 度 分 別 為 5 1 0 6 5 1 0 5 5 1 0 4 5 1 0 3 5 1 0 2 5 0 5 c o p y L 作 為 各 個(gè) 梯 度 的 D N A 模 板 以 無(wú) 菌 水 為 空 白 對(duì) 照 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 的 靈 敏 度 檢 測(cè) 結(jié) 果 判 斷 同 1 2 5 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 L A M P 引 物 篩 選 使 用 設(shè) 計(jì) 引 物 t o m A 8 和 t o m A 1 0 7 對(duì) C m m 進(jìn) 行 特 異 性 擴(kuò) 增 圖 1 結(jié) 果 顯 示 引 物 t o m A 8 擴(kuò) 增 效 果 不 理 想 不 能 特 異 性 擴(kuò) 增 目 標(biāo) 片 段 引 物 t o m A 1 0 7 能 較 好 地 擴(kuò) 增 出 目 的 片 段 可 進(jìn) 行 后 續(xù) 試 驗(yàn) 2 2 L A M P 檢 測(cè) 加 環(huán) 試 驗(yàn) 對(duì) 篩 選 出 的 t o m A 1 0 7 引 物 組 進(jìn) 行 環(huán) 引 物 加 成 處 理 將 處 理 后 的 引 物 組 重 進(jìn) 進(jìn) 行 L A M P 反 應(yīng) 通 過(guò) 試 驗(yàn) 結(jié) 果 圖 2 可 看 出 加 環(huán) 后 反 應(yīng) 時(shí) 間 從 3 5 1 7 m i n 縮 減 為 2 0 5 6 m i n 反 應(yīng) 時(shí) 間 縮 短 接 近 三 分 之 一 擴(kuò) 增 速 度 明 顯 加 快 2 3 t o m A 基 因 L A M P 特 異 性 檢 測(cè) 利 用 供 試 菌 株 對(duì) 篩 選 優(yōu) 化 的 t o m A 1 0 7 引 物 組 進(jìn) 行 特 異 性 檢 測(cè) 圖 3 結(jié) 果 顯 示 三 種 檢 測(cè) 方 法 均 證 明 t o m A 1 0 7 基 因 只 能 從 C m m 樣 品 中 獲 得 預(yù) 期 的 P C R 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 而 在 番 茄 青 枯 假 單 胞 菌 馬 表 1 L A M P 反 應(yīng) 所 需 引 物 引 物 名 稱 t o m A 1 0 7 F 3 t o m A 1 0 7 B 3 t o m A 1 0 7 F I P t o m A 1 0 7 B I P t o m A 8 F 3 t o m A 8 B 3 t o m A 8 F I P t o m A 8 B I P t o m A 1 0 7 L F 2 1 t o m A 1 0 7 L B 2 1 引 物 序 列 5 3 C G C T G G G C C T T G A C C G A C C C A C C G A T C G A T C C T T C C T A C T C C G G A T C G C A G C A G C G T A G A G C A C G A C A T G G C G G C G T G A C C T C G A T C A C G G A T G C G T A A C G C T C C A T C A C A G T G G A A G G C C G G C G G A G T G G A C C A T G T C G T G C T C T T C G G G C C A T T G A A C T G T T C G G C G A G G G C C C G T C G A A C T A C C T G A A G A T C G A A A T G G G C C T T C A C G C A T C G G T C A A G C C C A G C G G G A G A T C A G A C C A T G G C C C T T T A G C G G C G A T G A C G A G A G C A1 3 6 東 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 4 8 卷 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 等 病 原 細(xì) 菌 中 均 不 能 獲 得 目 標(biāo) 片 段 表 明 t o m A 1 0 7 基 因 能 通 過(guò) L A M P 檢 測(cè) 的 方 法 特 異 性 檢 測(cè) 出 C m m 2 4 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 靈 敏 度 檢 測(cè) 對(duì) 篩 選 出 的 t o m A 1 0 7 引 物 組 進(jìn) 行 靈 敏 度 檢 測(cè) 圖 4 結(jié) 果 顯 示 三 種 檢 測(cè) 方 法 均 證 明 當(dāng) 病 菌 濃 度 達(dá) 到 5 1 0 2 c o p y L 時(shí) t o m A 1 0 7 基 因 能 很 好 地 擴(kuò) 增 出 目 的 片 段 可 用 于 檢 測(cè) C m m 3 討 論 與 結(jié) 論 本 研 究 建 立 的 以 t o m A 基 因 為 檢 測(cè) 靶 標(biāo) 的 L A M P 檢 測(cè) 方 法 檢 測(cè) 靈 敏 度 為 5 1 0 2 c o p y L 檢 測(cè) 時(shí) 間 2 0 5 6 m i n 反 應(yīng) 時(shí) 間 短 檢 測(cè) 靈 敏 度 高 技 術(shù) 設(shè) 備 要 求 低 可 在 植 物 體 發(fā) 病 前 3 快 速 檢 測(cè) 出 植 物 體 是 否 被 感 染 可 以 作 為 早 期 檢 測(cè) 手 段 及 早 預(yù) 防 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 的 發(fā) 生 蔓 延 目 前 檢 測(cè) 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 的 方 法 主 要 是 P C R 為 提 高 檢 測(cè) 的 靈 敏 度 出 現(xiàn) 了 免 疫 捕 捉 P C R 超 分 支 滾 環(huán) 擴(kuò) 增 技 術(shù) 基 于 鎖 式 探 針 的 實(shí) 時(shí) 熒 光 P C R 1 3 1 4 為 縮 短 檢 測(cè) 時(shí) 間 建 立 了 D i r e c t P C R 和 N e s t e d P C R 及 檢 測(cè) 活 菌 避 免 假 陽(yáng) 性 的 E M A q P C R 1 5 1 7 但 這 些 技 術(shù) 普 遍 存 在 反 應(yīng) 時(shí) 間 較 長(zhǎng) 操 作 復(fù) 雜 的 特 點(diǎn) 不 適 于 大 面 積 推 廣 應(yīng) 用 也 有 學(xué) 者 使 用 L A M P 檢 測(cè) 方 法 進(jìn) 行 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 注 1 為 t o m A 8 引 物 2 為 t o m A 1 0 7 引 物 圖 1 L A M P 引 物 篩 選 擴(kuò) 增 結(jié) 果 圖 2 L A M P 檢 測(cè) 加 環(huán) 試 驗(yàn) 結(jié) 果 注 1 2 為 定 量 P C R 儀 讀 取 數(shù) 據(jù) 3 為 電 泳 圖 4 為 顯 色 反 應(yīng) 圖 M 為 M a r k e r a 為 C m m b 為 番 茄 青 枯 假 單 胞 菌 c 為 茄 青 枯 假 單 胞 菌 d 為 馬 鈴 薯 環(huán) 腐 病 菌 e 為 黃 瓜 角 斑 病 菌 f 為 西 瓜 果 斑 病 菌 g 為 馬 鈴 薯 瘡 痂 病 菌 h 為 空 白 對(duì) 照 下 同 圖 3 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 特 異 性 檢 測(cè) 結(jié) 果 注 a 為 5 1 0 6 c o p y L b 為 5 1 0 5 c o p y L c 為 5 1 0 4 c o p y L d 為 5 1 0 3 c o p y L e 為 5 1 0 2 c o p y L f 為 5 0 c o p y L g 為 5 c o p y L h 為 空 白 對(duì) 照 圖 4 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 靈 敏 度 檢 測(cè) 結(jié) 果 R F U R F U C y e l e s R F U C y e l e s A m p l i f i c a t i o n R F U C y e l e s R F U C y e l e s A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n3 期 劉 燕 妮 等 番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 1 3 7 的 檢 測(cè) 但 是 選 擇 的 是 具 有 高 保 守 性 的 1 6 S r R N A 序 列 及 高 變 異 性 的 I T S 序 列 1 8 1 9 而 非 功 能 基 因 本 研 究 選 擇 了 與 致 病 性 相 關(guān) 的 t o m A 基 因 更 能 避 免 假 陽(yáng) 性 的 出 現(xiàn) 本 研 究 建 立 的 番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 特 異 性 強(qiáng) 靈 敏 度 高 且 操 作 簡(jiǎn) 單 僅 一 臺(tái) 水 浴 鍋 就 能 進(jìn) 行 檢 測(cè) L A M P 檢 測(cè) 結(jié) 果 可 通 過(guò) 肉 眼 觀 察 顏 色 變 化 來(lái) 判 斷 而 不 必 用 凝 膠 電 泳 縮 短 了 檢 測(cè) 周 期 比 常 規(guī) P C R 和 實(shí) 時(shí) 熒 光 P C R 能 更 早 得 到 反 應(yīng) 結(jié) 果 雖 然 P C R 檢 測(cè) 的 靈 敏 度 1 2 要 高 于 L A M P 快 速 檢 測(cè) 但 P C R 檢 測(cè) 條 件 要 求 比 較 高 L A M P 檢 測(cè) 更 快 速 便 捷 只 需 一 個(gè) 恒 等 溫 的 環(huán) 境 即 可 更 適 用 于 生 產(chǎn) 應(yīng) 用 參 考 文 獻(xiàn) 1 徐 佳 王 春 燕 張 慶 萍 番 茄 潰 瘍 病 病 原 細(xì) 菌 對(duì) 5 種 藥 物 敏 感 程 度 的 研 究 J 東 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 6 4 1 4 8 6 8 9 2 吳 俐 番 茄 潰 瘍 病 的 發(fā) 生 規(guī) 律 及 防 治 技 術(shù) J 安 徽 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 下 半 月 刊 2 0 1 2 2 2 3 6 3 G i t a i t i s R D B e a v e r R W V o l o u d a k i s A E D e t e c t i o n o f C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s i n s y m p t o m l e s t o m a t o t r a n s p l a n t s J P l a n t D i s e a s e 1 9 9 1 7 5 8 3 4 8 3 8 4 N o t o m i T O k a y a m a H M a s u b u c h i H e t a l L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A J N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h 2 0 0 0 2 8 1 2 6 3 5 馮 潔 張 泉 錢 淼 等 肝 螺 桿 菌 L A M P 快 速 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 及 初 步 應(yīng) 用 J 中 國(guó) 動(dòng) 物 傳 染 病 學(xué) 報(bào) 2 0 1 9 2 7 4 5 0 5 5 6 陳 鈺 羅 力 涵 李 莎 等 結(jié) 核 分 枝 桿 菌 L A M P 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 及 應(yīng) 用 J 中 國(guó) 國(guó) 境 衛(wèi) 生 檢 疫 雜 志 2 0 1 7 4 0 4 2 4 2 2 4 7 7 許 宗 麗 黃 溢 泓 李 志 源 等 豬 偽 狂 犬 病 病 毒 L A M P 可 視 化 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 J 中 國(guó) 動(dòng) 物 檢 疫 2 0 1 7 3 4 1 0 7 9 8 2 8 余 艷 玲 彭 昊 馮 世 文 等 羅 非 魚 無(wú) 乳 鏈 球 菌 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 L A M P 檢 測(cè) 技 術(shù) 的 建 立 及 應(yīng) 用 J 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 9 4 7 1 3 2 0 0 2 0 3 9 李 曉 霞 賈 淼 金 君 華 等 原 料 乳 中 金 黃 色 葡 萄 球 菌 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增 L A M P 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 及 應(yīng) 用 J 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 7 3 3 5 1 1 7 1 1 1 7 5 1 0 王 芝 涵 王 春 偉 高 海 馨 等 引 起 玉 米 穗 腐 病 的 禾 谷 鐮 刀 菌 L A M P 快 速 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 J 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 9 3 5 3 5 8 1 5 8 5 1 1 黃 雯 徐 進(jìn) 張 昊 等 植 物 青 枯 菌 L A M P 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 J 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 6 4 9 1 1 2 0 9 3 2 1 0 2 1 2 毛 芙 蓉 李 飛 武 劉 燕 妮 等 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 的 定 性 P C R 檢 測(cè) 方 法 J 北 方 園 藝 2 0 1 5 5 1 2 8 1 3 1 1 3 閔 現(xiàn) 華 韓 躍 武 劉 箐 等 種 傳 番 茄 潰 瘍 病 菌 直 接 P C R 和 免 疫 捕 捉 P C R 檢 測(cè) 方 法 之 比 較 J 植 物 檢 疫 2 0 1 0 2 4 4 1 2 1 6 1 4 王 念 武 王 婷 沈 建 國(guó) 等 基 于 鎖 式 探 針 的 番 茄 潰 瘍 病 菌 實(shí) 時(shí) 熒 光 P C R 快 速 檢 測(cè) J 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 4 4 7 5 9 0 3 9 1 1 1 5 王 歡 劉 箐 劉 芳 等 番 茄 潰 瘍 病 一 步 法 快 速 超 靈 敏 檢 測(cè) 技 術(shù) 研 究 J 檢 驗(yàn) 檢 疫 科 學(xué) 2 0 0 6 S 1 3 5 3 7 1 6 閔 現(xiàn) 華 劉 箐 韓 躍 武 等 N e s t e d P C R 檢 測(cè) 種 傳 番 茄 細(xì) 菌 性 潰 瘍 病 菌 J 西 北 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 1 2 0 7 2 8 3 1 1 7 周 大 祥 熊 書 E M A q P C R 方 法 快 速 檢 測(cè) 番 茄 潰 瘍 病 菌 活 菌 研 究 J 西 南 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 7 3 0 1 9 9 1 0 4 1 8 封 立 平 尼 秀 媚 魏 曉 棠 等 番 茄 潰 瘍 病 菌 的 環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 核 酸 擴(kuò) 增 技 術(shù) 檢 測(cè) 方 法 J 食 品 安 全 質(zhì) 量 檢 測(cè) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 3 4 4 1 2 0 7 1 2 1 2 1 9 趙 賽 李 建 嫄 周 穎 等 番 茄 潰 瘍 病 菌 L A M P 快 速 檢 測(cè) 方 法 的 建 立 J 河 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2 0 1 5 3 8 3 1 9 2 3 責(zé) 任 編 輯 王 昱 上 接 第 2 1 頁(yè) 用 殼 鈣 鎂 仙 U 素 復(fù) 合 處 理 的 小 豆 產(chǎn) 量 最 高 是 7 種 氨 基 酸 水 溶 肥 與 植 物 生 長(zhǎng) 素 組 配 中 對(duì) 遼 紅 小 豆 2 號(hào) 增 產(chǎn) 效 果 最 好 的 組 合 模 式 為 氨 基 酸 水 溶 肥 與 植 物 生 長(zhǎng) 素 復(fù) 合 藥 劑 組 配 在 遼 寧 省 小 豆 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 上 的 應(yīng) 用 提 供 了 理 論 依 據(jù) 參 考 文 獻(xiàn) 1 王 學(xué) 君 董 曉 霞 董 亮 等 含 氨 基 酸 水 溶 肥 對(duì) 鹽 堿 地 小 麥 產(chǎn) 量 和 經(jīng) 濟(jì) 效 益 的 影 響 J 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 6 4 8 6 7 8 8 0 2 馮 先 明 王 保 明 彭 全 等 我 國(guó) 水 溶 肥 的 發(fā) 展 概 況 與 建 議 J 現(xiàn) 代 化 工 2 0 1 8 3 8 1 6 1 1 3 張 亞 平 套 種 大 豆 噴 施 含 氨 基 酸 水 溶 肥 料 肥 效 研 究 J 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 科 技 2 0 0 8 9 1 2 0 1 2 2 4 李 博 賑 呂 烈 武 黃 順 堅(jiān) 等 氨 基 酸 水 溶 肥 在 春 植 豇 豆 上 的 田 間 試 驗(yàn) J 農(nóng) 業(yè) 研 究 與 應(yīng) 用 2 0 1 3 5 1 4 1 6 5 申 海 林 鄒 利 人 陳 蕾 等 葉 面 肥 對(duì) 設(shè) 施 內(nèi) 葡 萄 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 的 影 響 J 東 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2 0 1 5 4 0 3 8 9 9 1 責(zé) 任 編 輯 劉 洪 霞