植物保護(hù)學(xué)報(bào)JournalofPlantProtection 2023 50 2 402 412 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2023 2021102 基金項(xiàng)目 河南省科技攻關(guān) 192102110164 河南省自然科學(xué)基金青年 202300410200 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail chaoxu01 zm2006 收稿日期 2021 05 06 河南省草莓棒孢葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性 薛彩英 1 武海燕 2 馬慶周 1 侯夢(mèng)圓 1 徐惠媛 1 徐 超 1 張 猛 1 1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 鄭州450002 2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)試中心 鄭州450002 摘 要 為 明 確 河 南 省 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 采 用 組 織 分 離 法 對(duì) 其 進(jìn) 行 分 離 純 化 通 過(guò) 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 手 段 對(duì) 其 進(jìn) 行 鑒 定 并 對(duì) 其 致 病 性 寄 主 范 圍 及 生 物 學(xué) 特 性 進(jìn) 行 測(cè) 定 同 時(shí) 對(duì) 其 前 期 侵 染 過(guò) 程 進(jìn) 行 顯 微 觀 察 結(jié) 果 表 明 從 草 莓 病 葉 中 共 分 離 得 到5 株 形 態(tài) 特 征 一 致 的 菌 株 其 菌 落 中 央 略 隆 起 呈 淺 灰 褐 色 邊 緣 呈 白 色 氣 生 菌 絲 絨 毛 狀 且 致 密 分 生 孢 子 呈 圓 柱 形 或 倒 棍 棒 形 大 小 為 30 252 m 5 10 m 呈 半 透 明 至 淺 棕 色 假 隔 膜6 17 個(gè) 基 臍 加 厚 基 于ITS EF 1 和TUB 序 列 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 結(jié) 果 顯 示 代 表 菌 株ZM170455 與 不 同 寄 主 來(lái) 源 的 多 主 棒 孢 霉Corynespora cassi icola 聚 為 同 一 分 支 該 病 原 菌 寄 主 范 圍 廣 除 草 莓 外 還 能 侵 染 黃 瓜 辣 椒 和 空 心 菜 等10 種 經(jīng) 濟(jì) 作 物 形 成 典 型 病 斑 根 據(jù) 形 態(tài) 學(xué) 特 征 和 分 子 生 物 學(xué) 特 征 將 河 南 省 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 鑒 定 為 多 主 棒 孢 霉C cassiicola 多 主 棒 孢 霉 侵 染 前 期 其 分 生 孢 子 萌 發(fā) 產(chǎn) 生 芽 管 而 芽 管 頂 端 可 在 遠(yuǎn) 離 氣 孔 的 位 置 形 成 類(lèi) 似 附 著 胞 的 結(jié) 構(gòu) 多 主 棒 孢 霉 最 適 溫 度 范 圍 為25 30 最 適pH 為6 10 在 光 暗 交替條件下菌絲生長(zhǎng)最快 最適碳源為葡萄糖 最適氮源為KNO 3 和NaNO 3 關(guān)鍵詞 草莓棒孢葉斑病 多主棒孢 病原鑒定 侵染過(guò)程 形態(tài)學(xué)特征 生物學(xué)特性 Identificationandbiologicalcharacteristicsofthepathogencausing CorynesporaleafspotofstrawberryinHenanProvince Xue Caiying 1 Wu Haiyan 2 Ma Qingzhou 1 Hou Mengyuan 1 Xu Huiyuan 1 Xu Chao 1 Zhang Meng 1 1 CollegeofPlantProtection HenanAgriculturalUniversity Zhengzhou450002 HenanProvince China 2 AnalyticalInstrumentCenter HenanAgriculturalUniversity Zhengzhou450002 HenanProvince China Abstract To clarify the pathogen causing Corynespora leaf spot of strawberry in Henan Province iso lates were obtained from diseased leaves and purified by single spore or hyphal tip transfer and then identified based on the morphological and molecular biological methods Its pathogenicity host range and biological characteristics were determined and its infection at the early stage was observed under microscope Theseresultsshowedthatatotaloffivestrainswiththesamemorphologicalcharacteristics were isolated from the diseased parts of strawberry leaves Their colonies were all grayish brown with central uplift white edge and dense and villous hyphae Conidia of the strains were cylindrical or in verted rod shaped 30 252 m 5 10 m in size translucent to light brown with 6 17 pseudoseptums and thickened basal umbilici Phylogenetic analysis based on the ITS EF 1 and TUB sequences showedthattherepresentativestrainZM170455waswellclusteredwiththe Corynespora cassiicolaiso lates from different hosts Besides strawberry this isolate could also infect other ten commercial crops including cucumber pepper and water spinach resulting in typical disease spots According to its mor phological and molecular biological characteristics the pathogen of Corynespora leaf spot of straw berry in Henan Province was finally identified as C cassiicola During the early infection stage of C cassiicolaonstrawberry itsconidiagerminatedtoproducegermtubes andatthetopofthegermtubes appressorium like structures formed away from the stomas The optimum temperature range for hyphal growth of C cassiicola was 25 30 and the optimal pH range was 6 10 Alternation of light and dark was the most favorable for mycelia growth Glucose was the optimum carbon source for hyphal growthofC cassiicolawhiletheoptimumnitrogensourceswerepotassiumnitrateandsodiumnitrate Key words Corynespora leaf spot of strawberry Corynespora cassiicola pathogen identification infectionprocess morphologicalcharacteristic biologicalcharacteristic 草 莓 為 薔 薇 科 草 莓 屬 多 年 生 漿 果 類(lèi) 草 本 植 物 是世界上栽培面積最廣的水果種類(lèi)之一 王曉立等 2020 其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高 富含多種維生素 礦質(zhì)元素 以及抗氧化物質(zhì) 在提高人體免疫力 抗衰老和促進(jìn) 腸 胃 吸 收 等 方 面 有 較 好 功 效 王 鳴 謙 等 2021 自 2003 年 以 來(lái) 我 國(guó) 草 莓 的 種 植 規(guī) 模 及 生 產(chǎn) 總 量 均 超 過(guò) 美 國(guó) 躍 居 世 界 首 位 王 曉 立 等 2020 至2018 年 我 國(guó) 草 莓 種 植 面 積 達(dá)17 33 hm 2 總 產(chǎn) 量500 萬(wàn)t 主 栽 品 種 有 甜 查 理 寧 玉 紅 顏 和 章 姬 等 廣 泛 分 布 于 山 東 遼 寧 安 徽 江 蘇 和 河 南 等 省 張 運(yùn) 濤 等 2019 目前 對(duì)草莓產(chǎn)量和品質(zhì)影響最大的病害有 炭疽病 灰霉病和根腐病等 而草莓棒孢葉斑病為本 課 題 組 于2018 年 在 草 莓 葉 部 發(fā) 現(xiàn) 的 一 種 新 病 害 Zhangetal 2018 隨 后 其 在 我 國(guó) 山 東 省 以 及 美 國(guó) 佛 羅 里 達(dá) 州 發(fā) 生 Onofre et al 2019 溫 浩 等 2019 而且有進(jìn)一步擴(kuò)散并流行的趨勢(shì) 作為一種 新病害 關(guān)于草莓棒孢葉斑病較深入的報(bào)道較少 如 溫浩等 2019 測(cè)定了草莓棒孢葉斑病病原菌對(duì)雙苯 菌 胺 等9 種 殺 菌 劑 的 敏 感 性 薛 彩 英 等 2022 描 述 了 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 內(nèi) 小 柱 孢 酮 脫 水 酶 基 因 CcSCD1 的 致 病 相 關(guān) 功 能 而 有 關(guān) 其 孢 子 萌 發(fā) 菌 絲 生 長(zhǎng) 等 生 物 學(xué) 特 性 方 面 的 研 究 未 見(jiàn) 報(bào) 道 而 病 原 菌 孢 子 萌 發(fā) 菌 絲 生 長(zhǎng) 等 生 物 學(xué) 特 性 與 植 物 真 菌 病 害 的 發(fā) 生 和 流 行 密 切 相 關(guān) 因 此 明 確 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病原菌種類(lèi)及生物學(xué)特性對(duì)于該病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和 有效防治具有重要意義 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 一 般 由 多 主 棒 孢 霉Corynes pora cassiicola 引 起 該 病 原 菌 是 一 種 世 界 性 分 布 的 植 物 病 原 真 菌 能 夠 侵 染 熱 帶 及 亞 熱 帶 地 區(qū) 近380 個(gè) 屬 的530 余 種 植 物 Dixon et al 2009 而 設(shè) 施 栽 培 的 溫 濕 度 條 件 更 利 于 其 滋 生 其 對(duì) 設(shè) 施 栽 培 的 黃 瓜 番 茄 芝 麻 豇 豆 和 茄 子 等 危 害 越 發(fā) 頻 繁 和 嚴(yán) 重 李 寶 聚 等 2012 楊 苗 2013 李 新 宇 等 2020 多 主 棒 孢 霉 種 內(nèi) 具 有 豐 富 的 遺 傳 多 樣 性 不 同 寄 主 來(lái) 源的多主棒孢霉分離物的生物學(xué)特性和致病力差異 較 大 Dixon et al 2009 李 博 勛 等 2019 如 田 守 波等 2020 從番茄葉部病斑上分離獲得了多主棒孢 霉 其 生 長(zhǎng) 最 適 溫 度 為25 30 最 適pH 范 圍 為4 8 在 光 暗 交 替 條 件 生 長(zhǎng) 最 快 更 適 宜 在 以 麥 芽 糖 和 乳 糖 為 碳 源 的 培 養(yǎng) 基 上 生 長(zhǎng) 孫 會(huì) 杰 等 2020 研 究 發(fā) 現(xiàn) 自 芝 麻 上 分 離 的 多 主 棒 孢 霉 在V8 等6 種 培 養(yǎng) 基 上 生 長(zhǎng) 最 快 最 適pH 為6 5 其 菌 絲 更 適 宜 在 全 光 照條件生長(zhǎng) 最適碳源為木糖 最適氮源為蛋白胨和 牛 肉 浸 膏 張 笛 等 2020 發(fā) 現(xiàn) 自 黃 瓜 上 分 離 的 多 主 棒 孢 霉 菌 絲 生 長(zhǎng) 最 適 溫 度 為25 28 最 適 碳 源 和 氮 源 分 別 為 甘 露 醇 和 甘 氨 酸 最 適pH 為6 8 光 照 條件更利于其菌絲生長(zhǎng) 傳 統(tǒng) 的 病 原 菌 鑒 定 主 要 根 據(jù) 菌 落 形 狀 孢 子 形 狀及大小等形態(tài)學(xué)特征 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展 將 病原菌多個(gè)具有高度保守性的基因序列聯(lián)合構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 該方法能更客觀反映物種間的進(jìn)化歷程 并 區(qū) 分 親 緣 關(guān) 系 較 近 的 菌 種 已 被 廣 泛 用 于 植 物 病 原 菌 的 鑒 定 和 檢 測(cè) Razaetal 2019 本 研 究 從 河 南省鄭州市草莓種植園中采集具有草莓棒孢葉斑典 型 癥 狀 的 病 葉 采 用 組 織 分 離 和 單 孢 純 化 法 從 病 葉 中 分 離 獲 得 菌 株 通 過(guò) 形 態(tài) 學(xué) 特 征 和 多 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育分析對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定 并對(duì)其致病力 寄主范圍 及 生 物 學(xué) 特 性 進(jìn) 行 測(cè) 定 同 時(shí) 對(duì) 其 前 期 侵 染 過(guò) 程 進(jìn) 行 組 織 學(xué) 觀 察 以 期 為 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 的 發(fā) 生 和 流 行及綠色防控提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 病 樣 及 植 物 2016 2019 年 多 次 從 河 南 省 鄭 州 市 中 牟 縣 和 新 鄭 市 草 莓 園 中 甜 查 理 紅 顏 和 章 姬等草莓品種上采集具有典型棒孢葉斑病癥狀的病 葉 致 病 性 試 驗(yàn) 草 莓 品 種 為 甜 查 理 草 莓 苗 購(gòu) 自 鄭 州 市 中 牟 縣 富 強(qiáng) 草 莓 采 摘 園 單 株 栽 于 直 徑10cm 高10cm 的 塑 料 盆 中 待 每 株3 4 片 葉 時(shí) 供 試 寄 主 范 圍 測(cè) 定 試 驗(yàn) 所 用 植 株 則 選 取 了10 種 在 草 莓 病 害 調(diào) 查 區(qū) 周 邊 普 遍 種 植 的 經(jīng) 濟(jì) 作 物 包 括 黃 瓜 空 心 菜 西 瓜 苦 瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 蘿 卜 番 茄 和 一 2 期 薛彩英等 河南省草莓棒孢葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性 403串紅 白洋蔥購(gòu)于超市 培 養(yǎng) 基 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂 potato dextrose agar PDA 培 養(yǎng) 基 成 分 為 馬 鈴 薯200g 葡 萄 糖15g 瓊 脂15 g 蒸 餾 水1 L 玉 米 粉 瓊 脂 cornmal agar CMA 培 養(yǎng) 基 成 分 為 玉 米 粉40g 瓊 脂20g 蒸 餾 水 1L 馬 鈴 薯 胡 蘿 卜 瓊 脂 potato carrot agar PCA 培 養(yǎng) 基 成 分 為 馬 鈴 薯200g 胡 蘿 卜20g 瓊 脂20g 蒸 餾 水1 L 胡 蘿 卜 瓊 脂 carrot agar CA 培 養(yǎng) 基 成 分 為 胡 蘿 卜200 g 瓊 脂20 g 蒸 餾 水1 L 查 彼 Cza pek 培 養(yǎng) 基 成 分 為 蔗 糖30g L 谷 氨 酸2 2g KCl1g K 2 HPO 4 0 5g MgSO 4 7H 2 O0 5g FeSO 4 7H 2 O0 01g ZnSO 4 7H 2 O0 01g CuSO 4 7H 2 O0 01g 蒸 餾 水1L 調(diào)pH 至7 0 試 劑 及 儀 器 2 Taq PCR StarMix Loading Dye 北 京 康 潤(rùn) 誠(chéng) 業(yè) 生 物 科 技 有 限 公 司 通 用 型DNA 純 化 回 收 試 劑 盒 上 海 惠 凌 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 Tris HCl CTAB EDTA 和NaCl 上 海 索 萊 寶 生 物 科 技 有 限 公 司 1 瓊 脂 糖 北 京 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 其 他 試 劑 均 為 國(guó) 產(chǎn) 分 析 純 Mastercycler nexus GSX1 PCR 儀 德 國(guó) 艾 本 德 股 份 公 司 BG Power600 電 泳 儀 北 京 百 晶 生 物 科 技 有 限 公 司 SYIGLHR 1401 凝 膠 成 像 分 析 儀 杭 州 聯(lián) 科 美 訊 生 物 醫(yī) 藥 技 術(shù) 有 限 公 司 SPX 100B Z 生 化 培 養(yǎng) 箱 上 海 博 訊 實(shí) 業(yè) 有 限 公 司 24 孔 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 板 賽 默 飛 世 爾 上 海 儀 器 有 限 公 司 SMZ14C N2LED 高 倍 體 視 鏡 麥 克 奧 迪 廈 門(mén) 電 氣 股 份 有 限 公 司 ECLIPSE80i 顯 微 鏡 日本Nikon 公司 1 2 方法 1 2 1 草莓棒孢葉斑病病原菌分離與形態(tài)學(xué)鑒定 將采集的具有典型棒孢葉斑癥狀的病葉置于自 來(lái)水下沖洗 去除病葉上附著的泥土和碎屑 采用組 織分離法分離和培養(yǎng)病原菌 田守波等 2020 培養(yǎng) 3 d 后 在 高 倍 體 視 鏡 下 用 滅 菌 接 種 針 從 菌 落 邊 緣 挑 取單孢或單根菌絲進(jìn)行病原菌純化 將純化好的目 標(biāo) 菌 株 接 種 到PDA 培 養(yǎng) 基 上 置 于 生 化 培 養(yǎng) 箱 中 于 28 光 周 期12 L 12 D 條 件 下 培 養(yǎng)7 d 每 隔24 h 觀 察 菌 落 形 態(tài) 和 顏 色 并 記 錄 孢 子 形 成 后 用 滅 菌 鉤 針 挑 取 少 許 霉 層 置 于 顯 微 鏡 下 觀 察 分 生 孢 子 形 態(tài) 從5 個(gè) 視 野 中 隨 機(jī) 挑 選50 個(gè) 分 生 孢 子 測(cè) 量 其 大 小 1 2 2 草莓棒孢葉斑病病原菌分子生物學(xué)鑒定 將 分 離 純 化 的 菌 株 置 于PDA 培 養(yǎng) 基 上 于28 黑 暗 培 養(yǎng)5d 后 刮 取 菌 絲 凍 干 通 過(guò) 改 良 的CTAB 法 提 取 菌 株 的 基 因 組DNA Manamgoda et al 2012 利 用 引 物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 BT2a 5 GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3 BT2b 5 GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3 以 及 EF 728F 5 CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 3 EF98 6R 5 TACTTGAAGGAACCCTTACC 3 分 別 擴(kuò) 增 rDNA ITS TUB 和EF1 的 序 列 所 用 引 物 均 委 托 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 20 LPCR 反 應(yīng) 體 系 2 Taq PCR StarMix Loading Dye 9 5 L 正 反 向 引 物 各1 L 模 板DNA1 L ddH 2 O 7 5 L 擴(kuò) 增 條 件 94 預(yù) 變 性3min 94 變 性40s 56 退 火40 s 72 延 伸1 min 共35 個(gè) 循 環(huán) 72 再 延 伸 10min 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 經(jīng)1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 后 利 用純化試劑盒回收并送生工生物工程 上海 股份有 限 公 司 測(cè) 序 將 所 得 目 標(biāo) 序 列 提 交 至GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 選 取 代 表 菌 株 進(jìn) 行 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 利 用 ClustalW 算 法 對(duì) 代 表 菌 株 和 其 近 緣 物 種 序 列 進(jìn) 行 多 重 比 對(duì) 然 后 利 用MEGA7 軟 件 采 用 極 大 似 然 法 構(gòu) 建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 進(jìn)行1000 次重復(fù)檢驗(yàn) 1 2 3 致病性驗(yàn)證與寄主范圍測(cè)定 將 已 純 化 好 的 目 標(biāo) 菌 株 置 于PDA 培 養(yǎng) 基 上 于 25 光 周 期12 L 12 D 條 件 下 培 養(yǎng)8 d 用 無(wú) 菌 接 種 環(huán) 將 菌 絲 刮 下 加 入10mL 無(wú) 菌 蒸 餾 水 沖 洗 平 板 制 備 濃 度 分 別 為1 10 4 個(gè) mL 和1 10 5 個(gè) mL 的 目 標(biāo) 菌 株 孢 子 懸 浮 液 采 用 噴 霧 法 將 濃 度 為1 10 5 個(gè) mL 的 目 標(biāo) 菌 株 孢 子 懸 浮 液 接 種 到 活 體 甜 查 理 草 莓 植 株 上 每 株 噴 施1 mL 且 以 噴 涂 無(wú) 菌 蒸 餾 水 的 植 株 為 對(duì) 照 噴 施 后 置 于 溫 度28 光 周 期12 L 12 D 相 對(duì) 濕 度80 條 件 下 培 養(yǎng) 接 種 后 套 袋 保 濕 培 養(yǎng)24h 后揭膜 每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù) 每個(gè)重復(fù)10 株草莓 植 株 分 別 于 培 養(yǎng)3d 和7d 后 觀 察 草 莓 植 株 的 發(fā) 病 情況 從發(fā)病部位再分離獲得病原菌 觀察分離菌株 與原接種菌株性狀是否一致 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 活 化3d 的 目 標(biāo) 菌 株 菌 落 邊 緣 用 直 徑 為5 mm 的 打 孔 器 打 取 菌 餅 分 別 接 種 到 健 康 黃 瓜 空 心 菜 西 瓜 苦 瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 蘿 卜 番 茄 和 一 串 紅 葉 片 上 以 接 種 相 同 大 小 的PDA 培 養(yǎng) 基 為 對(duì) 照 置 于 溫 度28 光 周 期12 L 12 D 相 對(duì) 濕 度80 條 件 下 培 養(yǎng) 每 個(gè) 處 理 設(shè) 置3 個(gè) 重 復(fù) 每 種 作 物 每 個(gè) 重 復(fù)10 片 葉 片 培 養(yǎng)7 d 后 觀 察 不 同 作物葉片的發(fā)病情況 并進(jìn)行病情分級(jí) 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 弱毒性 有許多點(diǎn)狀病斑 中等毒性 許多病斑擴(kuò)張 且 部 分 融 合 高 毒 性 病 斑 大 且 葉 片 枯 萎 從 發(fā) 病 部 位 再 分 離 獲 得 病 原 菌 觀 察 分 離 菌 株 與 原 接 種 菌 株性狀是否一致 404 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 50 卷1 2 4 草莓棒孢葉斑病病原菌侵染前期觀察 選 取 健 康 大 小 一 致 的 甜 查 理 草 莓 苗 期 離 體 葉 片 75 酒 精 表 面 消 毒 和 無(wú) 菌 蒸 餾 水 沖 洗 后 每 個(gè) 葉 片 涂 抹 濃 度 為1 10 4 個(gè) mL 的 目 標(biāo) 菌 株 孢 子 懸 浮 液 50 L 置 于 溫 度28 相 對(duì) 濕 度100 的 生 化 培 養(yǎng) 箱 中 全 黑 暗 培 養(yǎng) 分 別 于 接 種3 6 9 12 和24h 后 取 出 葉 片 置 于 無(wú) 水 乙 醇 中 脫 色4 6h 移 至 臺(tái) 盼 藍(lán) 中 染 色2 3h 置 于 顯 微 鏡 下 觀 察 分 生 孢 子 的 萌 發(fā) 及 后 續(xù) 侵染情況 每個(gè)處理重復(fù)3 次 每次重復(fù)5 片葉片 選取健康 大小一致的甜查理草莓苗期植株 用 75 酒 精 對(duì) 草 莓 葉 片 的 表 面 進(jìn) 行 消 毒 待 其 自 然 晾 干 后 每 片 葉 片 涂 抹 濃 度 為1 10 4 個(gè) mL 的 目 標(biāo) 菌 株 孢 子 懸 浮 液50 L 置 于 溫 度28 相 對(duì) 濕 度100 的 生 化 培 養(yǎng) 箱 中 全 黑 暗 培 養(yǎng) 分 別 于 接 種3 6 9 12 和24h 后 用 剪 刀 剪 取 接 種 葉 片 置 于 無(wú) 水 乙 醇 和 臺(tái) 盼藍(lán)中進(jìn)行脫色和染色 最后進(jìn)行顯微觀察 具體的 脫 色 染 色 以 及 顯 微 觀 察 的 方 法 和 離 體 的 草 莓 葉 片 相同 將 白 洋 蔥 內(nèi) 表 皮 切 割 成1 cm 1 cm 的 小 方 塊 置 于 盛 有 適 量 無(wú) 菌 水 的24 孔 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 板 中 每 孔 1 片 并 確 保 每 片 洋 蔥 內(nèi) 表 皮 均 能 漂 浮 在 無(wú) 菌 水 面 用 移 液 槍 吸 取 濃 度 為1 10 4 個(gè) mL 的 目 標(biāo) 菌 株 孢 子 懸 浮 液20 L 滴 在 洋 蔥 內(nèi) 表 皮 上 于28 下 全 黑 暗 培養(yǎng) 分別于接種2 6 8 12 24h 后從細(xì)胞培養(yǎng)板孔 格 中 取 出 洋 蔥 內(nèi) 表 皮 在 顯 微 鏡 下 觀 察 分 生 孢 子 的 萌發(fā)及后續(xù)侵染情況 每個(gè)處理重復(fù)3 次 1 2 5 草莓棒孢葉斑病病原菌的生物學(xué)特性 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 從活化培養(yǎng)3d 的 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌 菌 落 邊 緣 用 直 徑 為5mm 的 打 孔 器 打 取 菌 餅 置 于 直 徑 為90mm 的PDA 平 板 中 央 分 別 置 于5 10 15 20 25 28 30 35 和40 下 全 黑 暗 培 養(yǎng) 6d 后 用 十 字 交 叉 法 測(cè) 量 菌 落 直 徑 每 個(gè)處理重復(fù)3 次 不 同 培 養(yǎng) 基 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 方 法 參 照 不 同 溫 度 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 試 驗(yàn) 共 設(shè) 置PDA CMA PCA 和CA 四 種 不 同 培 養(yǎng) 基 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)3 次 不 同pH 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 方 法 參 照 不 同 溫 度 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 使 用1mol L 的NaOH 和HCl 調(diào) 節(jié)PDA 培 養(yǎng) 基 的pH pH 設(shè) 置 分 別 為4 5 6 7 8 9 和10 每個(gè)處理重復(fù)3 次 不 同 光 照 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 方 法 參 照 不 同 溫 度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 共設(shè)置連續(xù)光照 完全黑暗和 12h 12h 光 暗 交 替3 種 光 照 條 件 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)3 次 不 同 碳 源 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 方 法 參 照 不 同 溫 度 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 以Czapek 培 養(yǎng) 基 為 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 將其中的碳源等量替換為葡萄糖 乳糖 蔗糖 麥 芽糖 果糖以及可溶性淀粉 每個(gè)處理重復(fù)3 次 不 同 氮 源 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 方 法 參 照 不 同 溫 度 對(duì) 菌 絲 生 長(zhǎng) 的 影 響 以Czapek 培 養(yǎng) 基 為 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 將 其 中 的 氮 源 等 量 替 換 為 硝 酸 鉀 硝 酸 鈉 蛋 白 胨 硫酸銨及尿素 每個(gè)處理重復(fù)3 次 1 3 數(shù)據(jù)分析 采 用Excel 2010 軟 件 對(duì) 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 分 析 應(yīng) 用Duncan 氏 新 復(fù) 極 差 法 進(jìn) 行 差 異 顯 著 性 檢 驗(yàn) 2 結(jié)果與分析 2 1 草莓棒孢葉斑病田間癥狀及病原菌分離 在 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 發(fā) 生 早 期 草 莓 葉 片 出 現(xiàn) 淺 褐 色 小 點(diǎn) 直 徑2 3mm 發(fā) 生 中 期 病 斑 逐 漸 擴(kuò) 大 至 10 20 mm 呈 圓 形 多 角 形 或 不 規(guī) 則 形 深 褐 色 周 圍 有 黃 色 暈 圈 發(fā) 生 后 期 整 片 病 葉 枯 黃 脫 落 圖1 A 從 不 同 草 莓 品 種 的 病 葉 上 共 分 離 得 到 疑 似 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 致 病 菌 株 5 株 分 別 編 號(hào) 為 ZM160181 ZM170452 ZM170455 A 田 間 癥 狀 B C 接 種3 d 和7 d 后 的 發(fā) 病 癥 狀 A Disease symptoms on strawberry plants in the field B C diseasesymptomsonindoorplants3dand7dafterinocu lation 圖1 河南省草莓棒孢葉斑病田間癥狀及接種草莓棒孢葉斑 病病原菌后的發(fā)病癥狀 Fig 1 FieldsymptomsofCorynesporaleafspotofstrawberry inHenanProvinceanditssymptomsafterindoorinoculation 2 2 草莓棒孢葉斑病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 5 株 菌 株 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 的 菌 落 形 態(tài) 及 培 養(yǎng) 特 性 一 致 均 呈 近 圓 形 氣 生 菌 絲 絨 毛 狀 且 致 密 菌 落 中 央 略 隆 起 呈 淺 灰 褐 色 邊 緣 呈 白 色 菌 落 背 面 中 央 區(qū) 域 呈 橄 欖 綠 至 褐 色 邊 緣 色 淺 圖2 A B 持 續(xù) 保 濕 條 件 下 草 莓 病 葉 表 面 出 現(xiàn) 著 生 分 生 孢 子 的 分生孢子梗 分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)直立 褐色且不分支 單 獨(dú) 或 成 簇 生 長(zhǎng) 具 有1 12 個(gè) 層 出 梗 大 小 為200 2 期 薛彩英等 河南省草莓棒孢葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性 405400 m 4 8 m 圖2 C 分 生 孢 子 單 生 或 串 生 呈 棕 色 倒 棍 棒 形 或 圓 柱 形 直 立 或 略 微 彎 曲 基 臍 加 厚 假 隔 膜6 17 個(gè) 大 小 為74 252 m 5 10 m 圖 2 D PDA 培 養(yǎng) 基 上 的 分 生 孢 子 顏 色 相 對(duì) 較 淺 尺 寸 也 略 小 大 小 為30 0 123 5 m 5 10 m 圖2 E F 根 據(jù) 形 態(tài) 學(xué) 特 征 初 步 將 其 鑒 定 為 多 主 棒 孢 霉 C cassiicola A B PDA 平 板 上 培 養(yǎng)7d 的 菌 落 正 面 和 背 面 形 態(tài) C 病 原 菌 在 田 間 的 無(wú) 性 產(chǎn) 孢 結(jié) 構(gòu) 分 生 孢 子 梗 D 病 原 菌 在 田 間 的 分 生 孢 子 E F 室 內(nèi) 培 養(yǎng) 條 件 下 的 分 生 孢 子 A B Morphology of the front and back of the colony on PDAplate after 7 d cultivation C asexual conidiogenous structure conidiophore of the pathogen in the field D conidium of the pathogeninthefield E F conidiaformedonPDAmedia 圖2 草莓棒孢葉斑病病原菌的形態(tài)學(xué)特征 Fig 2 MorphologicalcharacteristicsofthepathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberry 2 3 草莓棒孢葉斑病病原菌分子生物學(xué)鑒定 選 取 菌 株ZM170455 為 代 表 菌 株 進(jìn) 行 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 菌 株ZM170455 基 因 組DNA 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 及 測(cè) 序 后 分 別 獲 得 長(zhǎng) 度 為500bp 的ITS GenBank 登 錄 號(hào) 為MG132186 1 長(zhǎng) 度 為253 bp 的 EF 1 GenBank 登 錄 號(hào) 為MG132190 1 和 長(zhǎng) 度 為404 bp 的TUB GenBank 登 錄 號(hào) 為MG132194 1 基 因 片 段 與 其 余4 株 菌 的 序 列 完 全 一 致 經(jīng)BLAST 比 對(duì) 菌 株ZM170455 的ITS EF 1 和TUB 序 列 與 不 同 寄 主 來(lái) 源 的 多 主 棒 孢 霉 菌 株LM 2 GenBank 登 錄 號(hào) 分 別 為 KP211426 1 KP735616 1 KP735615 1 BS1 GenBank 登 錄 號(hào) 分 別 為KJ954117 1 KJ954135 1 KJ954126 1 和 JS 1 GenBank 登 錄 號(hào) 分 別 為 MT334575 1 MT886390 1 MT886387 1 序 列 均 存 在 極 高 的 相 似 性 ITS 序 列 的 相 似 性 分 別 為100 0 99 6 和 100 0 EF 1 序 列 的 相 似 性 分 別 為 99 6 98 0 和100 0 TUB 序 列 的 相 似 性 分 別 為 98 5 98 5 和99 5 菌 株ZM170455 的ITS EF 1a 和TUB 序 列 與 棒 孢 屬C pseudocassiicola 菌 株 CPC31708 的ITS GenBank 登 錄 號(hào) 為MH327794 1 EF 1 GenBank 登 錄 號(hào) 為 MH327877 1 和 TUB GenBank 登 錄 號(hào) 為MH327888 1 序 列 的 相 似 性 分 別 為93 1 86 0 和88 1 在 所 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 中 菌 株ZM170455 與 多 主 棒 孢 霉LM 2 BS1 和JS 1 聚 為 同 一 分 支 而 與 棒 孢 屬 及 其 近 緣 屬 內(nèi) 其 他 種 的 關(guān) 系 較 遠(yuǎn) 圖3 結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 特 征 最 終 將 菌 株 ZM170455 鑒定為多主棒孢霉C cassiicola 2 4 致病性驗(yàn)證與寄主范圍測(cè)定 接 種5 株 多 主 棒 孢 霉 菌 株 孢 子 懸 浮 液3d 和7d 后 草 莓 葉 片 出 現(xiàn) 的 癥 狀 與 田 間 癥 狀 相 似 圖1 406 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 50 卷B C 根 據(jù) 柯 赫 氏 法 則 對(duì) 病 葉 重 新 進(jìn) 行 分 離 培 養(yǎng) 獲 得 的 分 離 物 與 原 接 種 菌 株 性 狀 一 致 該 病 原 菌均可侵染一串紅 黃瓜 空心菜 西瓜 荷花 苦瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 蘿 卜 和 番 茄10 種 經(jīng) 濟(jì) 作 物 只 是 在 不 同 寄 主 上 引 起 的 病 斑 大 小 有 所 差 異 其 中 黃 瓜 空 心 菜 和 一 串 紅 受 害 最 嚴(yán) 重 西 瓜 荷 花 和 苦 瓜 次之 南瓜 辣椒 白蘿卜和番茄受害最輕 表1 圖3 基于ITS EF 1 和TUB 序列采用極大似然法構(gòu)建菌株ZM170455 及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig 3 PhylogenetictreeofstrainZM170455andrelatedstrainsusingmaximum likelihoodmethod basedonITS EF 1 andTUBsequences 表1 草莓棒孢霉葉斑病病原菌在不同寄主上的病情等級(jí) Table1 DiseasegradeofpathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberryondifferenthosts 菌株 Isolate ZM160181 ZM170452 ZM170453 ZM170454 ZM170455 一串紅 Sagebrush 黃瓜 Cucumber 空心菜 Ipomoeaaquatica 西瓜 Watermelon 荷花 Lotus 苦瓜 Balsampear 南瓜 Pumpkin 辣椒 Pepper 白蘿卜 Ternip 番茄 Tomato 弱毒性 中等毒性 高毒性 Weaklyvirulent moderatelyvirulent highlyvirulent 2 5 草莓棒孢葉斑病病原菌侵染前期觀察 2 5 1 在離體草莓葉片上的侵染過(guò)程 離 體 草 莓 葉 片 接 種 草 莓 棒 孢 葉 斑 病 病 原 菌3 h 后 70 的 分 生 孢 子 開(kāi) 始 萌 發(fā) 芽 管 并 于 其 末 端 形 成 類(lèi) 似 附 著 胞 的 結(jié) 構(gòu) 圖4 A 接 種6 h 后 分 生 孢 子 的 萌 發(fā) 率 達(dá) 到99 圖4 B 接 種9 24h 內(nèi) 幾 乎 所 有 的 分 生 孢 子 產(chǎn) 生 芽 管 且 大 多 分 支 末 端 形 成 附 著 胞類(lèi)似結(jié)構(gòu) 圖4 C E A E 接 種3 6 9 12 和24 h 后 分 生 孢 子 的 萌 發(fā) 狀 態(tài) 紅 色 箭 頭 附 著 胞 類(lèi) 似 結(jié) 構(gòu) A E Germina tionstatusoftheconidiaat3 6 9 12and24hafterinoculation Redarrows Appressoriumsimilarstructure 圖4 草莓棒孢葉斑病病原菌在離體草莓葉片上的侵染過(guò)程 Fig 4 InfectionprocessofthepathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberr