中 國果菜 China Fruit tissue culture rapid propagation technology 處理 消毒試劑 消毒時間 min T1 1 NaClO 15 T2 1 NaClO 20 T3 3 NaClO 15 T4 3 NaClO 20 T5 0 1 HgCl 2 12 T6 0 1 HgCl 2 15 栽培生理 周閏 等 甜蜜藍寶石 葡萄組培技術(shù)研究 63 濾 紙吸去表面多余水分 然后切去兩端褐化的傷口 將 消毒過的材料切成長 1 0 cm 左右?guī)б粋€腋芽的莖段 正 插于啟動培養(yǎng)基上進行培養(yǎng) 啟動培養(yǎng)基為 1 2 MS 不 添加任何激素 每瓶接種 1 個莖段 每個處理接種 20 個 莖段 設 3 次重復 設置培養(yǎng)室條件如下 保持溫度 26 左右 相對濕度為 40 60 每日光照 12 h 15 d 后 統(tǒng) 計接種材料的污染率 褐變率和成活率 計算方法分別 見公式 1 2 3 用以確定最佳的消毒方法 污染率 污染莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 1 褐變率 褐變莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 2 成活率 成活莖段數(shù) 接種莖段 數(shù) 100 3 1 2 4 快繁體系的建立 1 初代培養(yǎng) 采用篩選出的最佳消毒方法進行消毒 把消毒后的 莖段接種于初代培養(yǎng)基上 設置四個配方 分別記作 PC1 PC2 PC3 PC4 培養(yǎng)基成分見表 2 每瓶接種 1 個 莖段 每個處理接種 30 個莖段 3 次重復 培養(yǎng)條件為保 持溫度 26 左右 相對濕度為 40 60 每日光照 12h 30 d 后 記錄生長情況并統(tǒng)計萌芽率 萌芽率按照公式 4 計算得出 萌芽率 A T 100 4 式中 A為萌芽的莖段總數(shù) T為接種的莖段總數(shù) 表 2 不同初代培養(yǎng)基配方 Table 2 Different formulations of primary mediums 2 增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩選出的 初代培養(yǎng)基配方 接種 50 d 后 當該培養(yǎng)基上腋芽生長 至株高 4 5 cm 時 將其剪下 去掉葉片 從中剪取健康 飽滿的處在中間節(jié)位的單芽莖段 長度約 0 5 1 cm 做 到莖段基本一致 然后接種于增殖培養(yǎng)基上 每瓶接種 3 個莖段 培養(yǎng)基設置 5 個配方 分別記作 PZ1 PZ2 PZ3 PZ4 PZ5 培養(yǎng)基成分見表 3 每個處理接種 15 個莖段 設 3 次重復 培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng) 45 d 后統(tǒng)計萌芽率 平均株高 增殖系數(shù)和生長情況 其中增殖系數(shù)按照公 式 5 計算 增殖系數(shù) B W 100 5 式中 B為可用于下次繼代的莖段總數(shù) W為接種的 莖段總數(shù) 表 3 不同增殖培養(yǎng)基配方 Table 3 Different formulations of breeding mediums 3 生根培養(yǎng) 增殖培養(yǎng) 45 d 后 將腋芽生長最好的培養(yǎng)基作為篩 選出的增殖培養(yǎng)基配方 將其中生長的腋芽剪下去掉 葉片 從中剪取健康飽滿的中間節(jié)位的單芽莖段 長度 0 5 1 cm 做到莖段基本一致 接種于生根培養(yǎng)基 培養(yǎng) 基設置 5 個配方 分別記作 PT1 PT2 PT3 PT4 PT5 培 養(yǎng)基成分見表 4 每瓶接種 5 個莖段 每個處理接種 20 個莖段 設 3 次重復 培養(yǎng)條件與增殖培養(yǎng)條件一致 50d 后觀察生長情況 統(tǒng)計萌芽率 生根率 主根密度及平均 根長 其中生根率按照公式 6 計算得出 生根率 C W 100 6 式中 C為生根的莖段總數(shù) W為接種的莖段總數(shù) 表 4 不同生根培養(yǎng)基配方 Table 4 Different formulations of rooting mediums 4 煉苗和移栽 生根培養(yǎng) 50 d 以上 當生根良好的組培苗株高達到 處理 配方 PC1 1 2 MS PC2 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 1 mg L PC3 1 2 MS 6 BA1 0 mg L IBA0 1 mg L PC4 MS 處理 配方 PZ1 1 2 MS 6 BA0 1 mg L IBA0 05 mg L PZ2 1 2 MS 6 BA0 3 mg L IBA0 05 mg L PZ3 1 2 MS 6 BA0 5 mg L IBA0 05 mg L PZ4 1 2 MS 6 BA0 3 mg L NAA0 05 mg L PZ5 1 2 MS 處理 配方 PT1 1 4 MS IBA0 1 mg L PT2 1 4 MS IBA0 5 mg L PT3 1 4 MS IBA1 0 mg L PT4 1 4 MS NAA0 5 mg L PT5 1 2 MS 栽培生理中國果菜64 5 7 cm 帶 5 7 個葉片時 將試管苗置于煉苗室 先擰 松瓶蓋煉苗 2 3 d 再完全打開瓶口煉苗 7 10 d 待莖 稈顏色加深 葉片發(fā)亮時即可出瓶移栽 將植株小心取 出 用自來水洗凈組培苗根部的培養(yǎng)基 準備配制好的 基質(zhì) 含椰糠 草炭土 珍珠巖和蛭石四種成分 比例為 2 1 1 1 用多菌靈溶液攪拌至基質(zhì)土坨不散 分裝 至營養(yǎng)缽 直徑約 6 5 cm 然后移栽組培苗 將苗子置于 育苗箱中 蓋上蓋子保濕 然后保持溫度在 25 左右 注 意通風 防止基質(zhì)發(fā)霉 當出現(xiàn)新生葉 1 2 片時 打開蓋 子通風 2 d 將苗再次轉(zhuǎn)入營養(yǎng)袋 觀察成活情況 1 3 統(tǒng)計分析方法 采用 Excel 2007 軟件和 SPSS 22 0 軟件進行數(shù)據(jù)處 理及分析 2 結(jié)果與分析 2 1 外植體最佳消毒方法 用次氯酸鈉消毒后 外植體易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象且影 響腋芽的萌發(fā) 而用升汞消毒則顏色較正常 由表 5 可 知 0 1 升汞消毒的表現(xiàn)優(yōu)于 1 3 次氯酸鈉 莖段外 植體的最佳消毒處理是 T6 即 0 1 升汞消毒 15 min 外 植體污染率 褐變率和成活率分別是 46 7 13 3 和 40 0 因此 外植體的消毒方法采用先用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 表 5 外植體最佳消毒方法的篩選 Table 5 Selection of the best method for disinfection of explants 注 同列不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平 P 0 05 下表同 2 2 不同初代培養(yǎng)基對莖段誘導的影響 莖段外植體接種到不同初代培養(yǎng)基上 30 d 后統(tǒng)計 莖段外植體萌芽率 見表 6 結(jié)果表明 外植體在四種培 養(yǎng)基配方上都有萌芽 但是在不添加任何激素的 1 2 MS 上的表現(xiàn)最好 萌芽率達到 57 8 新芽生長正常 以 1 2 MS 為基本培養(yǎng)基的另兩個配方 其中添加了 6 BA 和 IBA兩種激素 莖段基部產(chǎn)生較多愈傷組織 且新芽生長 不正常 后期出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象 在不添加任何激素的 MS 培養(yǎng)基上 莖段基部膨大明顯 影響腋芽的生長 導致出 芽慢且有玻璃化現(xiàn)象 所以確定最佳初代培養(yǎng)基配方為 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L瓊脂 表 6 不同初代培養(yǎng)基莖段誘導情況 Table 6 Stem segment induction in different primary mediums 2 3 不同增殖培養(yǎng)基對莖段培養(yǎng)的影響 增殖培養(yǎng)過程中 5 種培養(yǎng)基上的莖段生長表現(xiàn)各 不相同 第 45 天統(tǒng)計情況 結(jié)果見表 7 以不添加任何激 素的 1 2 MS增殖效果最好 增殖系數(shù)高達 5 2 顯著高于 其他處理 基本不產(chǎn)生愈傷 生長正常 還能同時生根 在 PZ1 PZ2 和 PZ3 三種培養(yǎng)基上 莖段基部愈傷率都達到 100 隨著 6 BA濃度的提高 萌芽率逐漸升高 但是愈 傷組織越來越大 新芽葉片短小 節(jié)間短縮 且部分出現(xiàn) 叢生芽及玻璃化的現(xiàn)象 PZ4 中生長激素用 NAA 替換 IBA 但是其產(chǎn)生的愈傷組織更大葉片小且偏黃 新芽 生長不正常 說明該配方不合適 表 7 不同增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果 Table 7 Culture effect of different propagation medium 2 4 不同生根培養(yǎng)基對葡萄生根的影響 生根培養(yǎng) 50 d 后 隨機選取 10 株苗進行統(tǒng)計 結(jié)果 見表 8 見下頁 甜蜜藍寶石 葡萄品種容易生根 不添 加任何激素的 1 2 MS培養(yǎng)基生根率也很高 但是新梢莖 稈纖細 不利于移栽 添加不同濃度的生長素后均有生 根 其中 1 4 MS培養(yǎng)基中添加 IBA濃度為 0 1 mg L時 處理 污染率 褐變率 成活率 T1 75 0 18 0 a 6 7 2 9 b 18 3 10 4 b T2 66 7 7 6 ab 11 7 2 9 b 21 7 7 6 b T3 65 0 5 0 ab 10 0 5 0 b 25 0 10 0 ab T4 60 0 13 2 ab 21 7 5 8 a 18 3 7 6 b T5 55 0 13 2 ab 8 3 2 9 b 36 7 10 4 ab T6 46 7 2 9 b 13 3 2 9 b 40 0 10 0 a 處理 萌芽率 生長情況 PC1 57 8 8 4 a 基部產(chǎn)生少量愈傷 新芽生長正常 PC2 50 0 5 8 ab 基部產(chǎn)生較多愈傷 新芽出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象 PC3 41 1 10 7 b 基部產(chǎn)生大量愈傷 新芽出現(xiàn)較多玻璃化現(xiàn)象 PC4 45 6 5 1 ab 基部膨大明顯 新芽出芽慢且有少量玻璃化現(xiàn)象 栽培生理 周閏 等 甜蜜藍寶石 葡萄組培技術(shù)研究 培養(yǎng)基編號 萌芽率 平均株高 cm 增殖系數(shù) PZ1 57 8 7 7 c 3 2 0 4 b 1 8 0 2 c PZ2 86 7 23 1 ab 2 5 0 2 c 2 0 0 2 c PZ3 95 6 3 9 a 2 2 0 3 c 1 5 0 5 c PZ4 71 1 10 2 bc 3 5 0 6 b 2 6 0 4 b PZ5 88 9 3 8 ab 6 0 0 3 a 5 2 0 1 a 65 即 培養(yǎng)基 PT1 效果最好 萌芽率達到 91 7 生根率達到 88 3 生長正常 隨著 IBA 濃度逐漸提高 雖然新梢莖 稈更加粗壯 但基部產(chǎn)生的愈傷更多 導致萌芽率及生 根率逐漸降低 新梢生長過慢 而添加 0 5 mg L的 NAA 則出現(xiàn)部分只長根不萌芽的現(xiàn)象 萌芽率只有 30 生 根率只有 55 且根為氣生根 愈傷組織大而疏松 2 5 煉苗移栽情況 試管苗馴化時 保持溫度 20 28 濕度在 80 左 右 讓試管苗逐漸適應外界的環(huán)境 不能操之過急 本試 驗采用配制好的基質(zhì)土用于幼苗的馴化 再次移栽至營 養(yǎng)袋時 已經(jīng)產(chǎn)生較多新根 在營養(yǎng)袋生長兩周后 統(tǒng)計 成活率高達 90 3 討論 外植體消毒作為組織培養(yǎng)的第一步 具有關(guān)鍵作 用 外植體的生長發(fā)育情況及對其消毒時間的長短 對 發(fā)芽率尤為重要 因此尋求最佳的消毒藥劑及其濃度和 時間的組合 控制外植體污染和褐變率 是消毒環(huán)節(jié)的 重要問題 10 11 本試驗篩選出了較優(yōu)的消毒方法 但外植 體污染率太高 萌芽率過低 可能因為取材于野外的環(huán) 境 且取材季節(jié)過晚 雨季天氣來臨 病菌種類多變且繁 殖活躍 12 導致難以消毒 雖然通過延長消毒時間可以降 低部分污染率 但同時也增加了死亡率 最終萌芽率也 不高 所以進一步探索合適的取材時間很有必要 植物激素具有刺激形成層細胞的分裂 誘導愈傷組 織 不定芽和不定根的形成等生理作用 缺乏或者過多 都會對植物生長產(chǎn)生不利影響 7 植物組織培養(yǎng)增殖過 程中 可以通過腋芽產(chǎn)生不定芽 叢生芽 和腋芽萌發(fā)成 新梢兩種方式擴繁 生長素類物質(zhì)在兩種方式中均是必 需的 而細胞分裂素類物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必 需的 但在腋芽萌發(fā)成新梢的過程中不是必需的 13 15 但 本試驗增殖培養(yǎng)過程 在添加了激素的培養(yǎng)基中 因為基 部產(chǎn)生較多愈傷 抑制了發(fā)根和抽莖 芽的生長受到抑 制 生長緩慢 或者部分產(chǎn)生了叢生芽 但是難以繼續(xù)生 長 并出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象 所以選擇不添加任何激素的 1 2 MS基本培養(yǎng)基作為增殖培養(yǎng)基 以腋芽萌發(fā)成新梢的 方式進行擴繁 不產(chǎn)生叢生芽 繼代增殖系數(shù)相對較低 但組培苗生長健壯 多次繼代培養(yǎng)后無玻璃化 褐化現(xiàn) 象 16 17 生根培養(yǎng)過程中 隨著添加 IBA 濃度的逐步升 高 基部產(chǎn)生的愈傷也不斷增多 導致萌芽率及生根率 逐漸降低 新梢生長減緩 但是在不添加生長激素的培養(yǎng) 基中 新梢莖稈纖細 不利于移栽 所以選擇添加 0 1 mg L 的 IBA進行生根培養(yǎng)最合適 這說明一定濃度的外源生 長素如 IBA IAA可促進葡萄根的發(fā)育和試管苗生長 但 濃度過高誘導產(chǎn)生大量愈傷組織 則會抑制試管苗的生 長 18 21 與大部分研究一致 營養(yǎng)物質(zhì)對組培苗的生長狀況影響很大 20 雖然本 試驗中莖段可以一次成苗 一次成苗即將繼代培養(yǎng)和生 根培養(yǎng)同時進行 既能加快試管苗的培育速度 又能減少 勞動力的消耗 具有很大優(yōu)勢 但因為采用增殖培養(yǎng)基配 方同步生根的苗子莖稈過于纖細 不利于煉苗移栽 而采 用生根培養(yǎng)基配方一次成苗 則增殖太慢 因為生根培養(yǎng) 后的瓶苗莖稈過于老化 難以再增殖 而用兩次成苗法 即用增殖培養(yǎng)基先增殖 然后再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進 行生根培養(yǎng) 則起到了壯苗的作用 能有效提高移栽的成 活率 且培養(yǎng)基大量元素的用量減半 在生產(chǎn)上更有成本 優(yōu)勢 所以本試驗增殖和生根分兩步完成 這與大部分 研究一次成苗的結(jié)論不一致 21 分析原因可能是培養(yǎng)基 的配方需要調(diào)整 也可以嘗試縮短生根培養(yǎng)的時間 及時 轉(zhuǎn)接繼代 用以提高增殖率 今后仍需進一步探索 培養(yǎng)基編號 萌芽率 生根率 主根密度 條 株 平均根長 cm 生長情況 PT1 91 7 7 6 a 88 3 2 9 ab 3 6 0 3 cd 3 0 0 3 b 植株莖稈較粗壯 基部產(chǎn)生的愈傷組織很少 PT2 83 3 12 6 ab 83 3 10 4 ab 4 2 0 2 bc 2 8 0 2 b 植株莖稈較粗壯 基部產(chǎn)生較多愈傷組織 植株生長較慢 PT3 71 7 10 4 b 73 3 7 6 b 5 5 0 6 a 2 5 0 4 b 植株莖稈粗壯 基部產(chǎn)生較多愈傷組織 植株生長過慢 PT4 30 0 10 0 c 55 0 8 7 c 4 5 0 4 b 1 0 0 4 c 植株玻璃化現(xiàn)象較重 基部愈傷組織大而疏松 PT5 88 3 2 9 ab 90 0 10 0 a 3 3 0 4 d 5 0 0 9 a 新梢莖稈纖細 表 8 不同生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果 Table 8 Culture effect of different rooting medium 栽培生理 中國果菜 66 4 結(jié)論 甜蜜藍寶石 葡萄的組織培養(yǎng)包括莖段外植體消 毒 啟動培養(yǎng) 增殖培養(yǎng) 生根培養(yǎng)以及煉苗移栽環(huán)節(jié) 本研究發(fā)現(xiàn) 甜蜜藍寶石 外植體的最佳消毒方法是先 采用 75 酒精消毒 40 s 再用 0 1 升汞消毒 15 min 最 佳初代培養(yǎng)基為 1 2 MS 30 g L蔗糖 6 5 g L瓊脂 萌芽 率達到 57 8 1 2 MS增殖培養(yǎng)效果最好 增殖培養(yǎng) 45 d 增殖系數(shù)高達 5 2 生根培養(yǎng)基以 1 4 MS IBA0 1 mg L 效果最好 生根培養(yǎng) 50 d 生根率達到 88 3 新芽莖稈 較為粗壯 生長正常 煉苗時 保持溫度 20 28 濕度 在 80 左右 成活率高達 90 該組培繁殖體系可用于 甜蜜藍寶石 葡萄新品種的繁育 有一定的潛在應用前 景 為其商業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考 參考文獻 1 劉鳳之 中國葡萄栽培現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢 J 落葉果樹 2017 49 1 1 4 2 吳昊 甜蜜藍寶石葡萄的高產(chǎn)栽培技術(shù) J 河北農(nóng)業(yè) 2019 10 44 47 3 沈傳進 王利民 張平 等 鮮食葡萄組織培養(yǎng)快速繁育系 統(tǒng)的建立 J 河北農(nóng)業(yè)科學 2011 15 7 16 21 4 沈傳進 對烏海市葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的再認識 J 華北農(nóng)學報 2006 S3 133 136 5 蔡文博 段虹 王軍 等 4 個鮮食葡萄品種組培快繁體系的 建立 J 核農(nóng)學報 2019 33 2 248 254 6 曹孜義 劉國民 實用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程 M 蘭州 甘 肅科學技術(shù)出版社 1998 17 20 7 李國樹 邱璐 徐成東 等 葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖體系研 究 J 北方園藝 2011 9 134 136 8 曾建國 吳雪梅 巨峰葡萄組培快繁過程中初代培養(yǎng)基的 篩選 J 現(xiàn)代園藝 2010 7 4 7 9 劉娜 許軻 張文 等 四個釀酒葡萄品種組培快繁體系的 初建 J 植物生理學報 2013 49 10 1071 1076 10 莫銀屏 徐豐 石雪暉 等 湘釀 1 號刺葡萄離體快繁技術(shù) 試驗 J 中外葡萄與葡萄酒 2015 2 26 28 11 溫鵬飛 王蓓 張建成 等 次氯酸鈉對葡萄葉片組培褐變 率的影響 J 山西農(nóng)業(yè)科學 2012 40 6 571 574 12 蘇玲 宮磊 尹向田 等 貴妃玫瑰葡萄組培技術(shù)探究 J 安 徽農(nóng)業(yè)科學 2020 48 8 51 53 65 13 王冬梅 黃學林 黃上志 細胞分裂素類物質(zhì)在植物組織培 養(yǎng)中的作用機制 J 植物生理學通訊 1996 5 373 377 14 洪森榮 尹明華 香果樹帶芽莖段不定芽高頻增殖的優(yōu)化 J 核農(nóng)學報 2010 24 3 532 536 15 蔡文博 段虹 王軍 等 4 個鮮食葡萄品種組培快繁體系的 建立 J 核農(nóng)學報 2019 33 2 248 254 16 馮發(fā)文 田群芳 巨峰葡萄組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究 J 落葉 果樹 2011 43 2 6 8 17 曹孜義 楊德龍 梁慶豐 等 內(nèi) 39 號葡萄株系的離體快繁 技術(shù)研究 J 果樹學報 2002 6 427 429 18 鄭平生 李向東 李國梁 幾種葡萄砧木組培快繁生根研究 J 北方園藝 2014 3 101 103 19 常寧 侯艷霞 盧愛英 草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基優(yōu)化 J 中國果菜 2022 42 8 73 76 20 陶阿麗 曹殿潔 華芳 等 植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展 J 長江大學學報 自科版 2018 15 18 31 35 21 潘學軍 張文娥 唐冬梅 等 無核葡萄離體快繁技術(shù)研究 J 中國南方果樹 2007 2 44 46 栽培生理 周閏 等 甜蜜藍寶石 葡萄組培技術(shù)研究 67