引文格式 張敏 羅寧 陳愛昌 等 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及病原優(yōu)勢種類分析 J 云南農(nóng)業(yè)大學學報 自然科學 2022 37 6 940 948 DOI 10 12101 j issn 1004 390X n 202203015 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及 病原優(yōu)勢種類分析 張 敏1 羅 寧1 陳愛昌2 李煥宇3 劉永剛4 李惠霞1 石明明1 韓 變1 1 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室 甘肅 蘭州 730070 2 定西市植保植檢站 甘肅 定西 743000 3 甘肅農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院 甘肅 蘭州 730070 4 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所 甘肅 蘭州 730070 摘要 目的 明確甘肅省定西市芹菜根腐病的發(fā)生情況和病原菌種類 為田間防治提供理論依據(jù) 方法 在 定西市8個鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行調(diào)查 采集根腐病樣 經(jīng)組織和單孢分離獲得純化菌株 采用形態(tài)學結(jié)合rDNA ITS與 TEF 1 基因序列鑒定病原 按照柯赫氏法則測定其致病性 結(jié)果 定西市芹菜根腐病病田率為63 54 病 株率為24 45 其田間癥狀包括莖基部縊縮腐爛以及主根下部腐爛或維管束變色2種類型 分離純化得到 78株鐮孢菌 Fusarium spp 包括尖孢鐮孢菌 F oxysporum 62株 銳頂鐮孢菌 F acuminatum 11株和茄病 鐮孢菌 F solani 5株 其分離頻率分別為79 49 14 10 和6 41 經(jīng)致病性測定 尖孢鐮孢菌 茄病鐮 孢菌與銳頂鐮孢菌的病情指數(shù)分別為78 33 24 44和11 11 結(jié)論 尖孢鐮孢菌是定西市芹菜根腐病的優(yōu)勢 病原菌 且致病性最強 茄病鐮孢菌與銳頂鐮孢菌的致病性較弱 其中 銳頂鐮孢菌引起芹菜根腐病為國內(nèi) 首次報道 關(guān)鍵詞 尖孢鐮孢菌 茄病鐮孢菌 銳頂鐮孢菌 致病性 定西市 中圖分類號 S436 36 文獻標志碼 A 文章編號 1004 390X 2022 06 0940 09 Occurrence and Pathogen Dominant Species of Celery Root Rot in Dingxi City Gansu Province ZHANG Min1 LUO Ning1 CHEN Aichang2 LI Huanyu3 LIU Yonggang4 LI Huixia1 SHI Mingming1 HAN Bian1 1 Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Disease and Pest of Gansu Province Lanzhou 730070 China 2 Dingxi Station of Plant Protection and Quarantine Dingxi 743000 China 3 College of Plant Protection Gansu Agricultural University Lanzhou 730070 China 4 Institute of Plant Protection Gansu Academy of Agricultural Sciences Lanzhou 730070 China Abstract Purpose To define the occurrence and identify the pathogens of celery root rot in Dingxi City Gansu Province providing theoretical basis for field control Methods A survey and collection of samples were conducted in eight villages in Dingxi City Pathogens of celery root rot were isolated by tissue separation and purified by single spore and identified by morphological char acteristic and molecular methods including sequence alignment of rDNA ITS and the translation 云南農(nóng)業(yè)大學學報 自然科學 2022 37 6 940 948 Journal of Yunnan Agricultural University Natural Science E mail ynauzkxb 收稿日期 2022 03 09 修回日期 2022 08 16 網(wǎng)絡首發(fā)日期 2022 11 17 基金項目 國家重點研發(fā)計劃子課題 2018YFC1706301 5 甘肅省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 GARS ZYC 4 作者簡介 張敏 1997 女 云南昭通人 在讀碩士研究生 主要從事植物病原菌真菌學研究 E mail 626130949 通信作者 Corresponding author 李惠霞 1972 女 甘肅秦安人 博士 教授 主要從事植物病原線蟲 學研究 E mail lihx 網(wǎng)絡首發(fā)地址 elongation factor 1 gene TEF 1 The pathogenicity of isolates was tested according to Koch s pos tulates Results The rate of diseased fields and occurrence of celery root rot in Dingxi were 63 54 and 24 45 respectively Two symptoms of celery root rot disease were observed including basal stem rot with constriction and lower taproot rot or vascular discoloration A total of 78 strains of genus Fusarium spp were obtained including 62 strains of F oxysporum 11 strains of F acumina tum and five strains of F solani and the isolation frequencies of them were 79 49 14 10 and 6 41 respectively As measured by pathogenicity the disease indexes of F oxysporum F solani and F acuminatum were 78 33 24 44 and 11 11 respectively Conclusion F oxysporum is the dominant pathogen with highest virulence of celery root rot in Dingxi City F solani and F acumin atum are weaker and this is the first report that F acuminatum can infect celery root rot in China Keywords Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium acuminatum pathogenicity Dingxi City 芹菜 Apium graveolens L 為傘形科 Umbel liferae 芹屬 Apium 植物 在中國種植歷史悠 久 種植范圍廣泛 是一種藥食同源的植物 由 于其富含蛋白質(zhì) B族維生素 胡蘿卜素和碳水 化合物等 1 在臨床應用和保健類食品開發(fā)方面 有廣闊的應用前景 2 芹菜是甘肅外銷的主要高 原夏菜種類之一 種植面積逐年擴大 2020年 定西市芹菜種植面積達1 5萬hm2 每667 m2產(chǎn) 量達7 9 t 經(jīng)濟效益顯著 3 根腐病在苗期可導致芹菜大面積死苗 在生 長期造成根部腐爛死亡 在內(nèi)蒙古 芹菜根腐病 一般種植田發(fā)病輕時造成20 30 的產(chǎn)量損 失 發(fā)病重時損失可達60 80 甚至絕收 4 芹菜根腐由多種病原菌引起 5 不同地區(qū)病原種 類和優(yōu)勢致病菌均有差異 其主要病原之一的鐮 孢菌 Fusarium spp 是一種世界性分布的真菌 可侵染瓜果 蔬菜 6 中藥 7 糧食作物 8 和牧 草 9 等多種植物 引起根腐 莖基腐和花穗腐 等多種病害 鐮孢菌有多種?；?不同專化型 引起的癥狀也不盡相同 在培養(yǎng)過程中存在多型 性和易變性 是真菌界最難準確鑒定的病原菌 之一 10 甘肅省定西市作為中國高原夏菜主產(chǎn)地之 一 芹菜根腐病一般田塊發(fā)病率為10 30 嚴重地塊高達90 以上 可造成不同程度的產(chǎn)量 損失 重度田塊甚至絕收 11 近年來 隨著市場 需求量增加 芹菜種植面積不斷擴大 連作現(xiàn)象 普遍發(fā)生 導致芹菜根腐病愈加嚴重 目前 關(guān) 于甘肅省芹菜根腐病研究較少 引起芹菜根腐病 發(fā)生的病原菌種類尚不清楚 為明確該地區(qū)芹菜 根腐病病原種類 本研究對定西市芹菜根腐病進 行調(diào)查 鑒定病原菌種類 以明確防治靶標 為 該地區(qū)芹菜根腐病的有效防控提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 供試材料 2020 2021年 在甘肅省定西市 安定區(qū)和隴西縣采集芹菜根腐病樣 致病性測定 的供試芹菜品種為凱爾文 由甘肅省定西市植保 植檢站提供 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 PDA 水瓊脂培養(yǎng)基 WA 和康乃馨葉片水瓊 脂培養(yǎng)基 CLA PDA由馬鈴薯200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂15 g和蒸餾水1 L制備而成 WA由 瓊脂15 g和蒸餾水1 L制備而成 CLA的制備 先加入10 15片滅菌的康乃馨葉片 3 4 mm2 再加入瓊脂15 g和蒸餾水1 L 供試試劑 植物基因組DNA提取試劑盒 瓊脂糖 Marker ddH2O PCR mastermix 無水 乙醇 葡萄糖 核酸染料和瓊脂粉均購自北京擎 科生物技術(shù)有限公司 1 2 試驗方法 1 2 1 芹菜根腐病發(fā)生情況調(diào)查 2021年4 8月 于定西市安定區(qū)鳳翔鎮(zhèn) 內(nèi)官鎮(zhèn) 符川鎮(zhèn) 團結(jié)鎮(zhèn) 巉口鎮(zhèn) 魯家溝鎮(zhèn)和 西鞏驛鎮(zhèn)以及隴西縣馬河鎮(zhèn)共8個鎮(zhèn)的芹菜種植 地進行隨機取樣 統(tǒng)計病田率和病株率 采集病 樣 帶回實驗室進行分離鑒定 第 6 期張 敏 等 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及病原優(yōu)勢種類分析941 1 2 2 芹菜根腐病病原菌的分離純化 采用組織分離法 12 分離芹菜根腐病病原物 從根部和莖基部病健交界處剪取長約0 5 cm的 根 用75 乙醇浸泡30 s 無菌水沖洗3次后在 滅菌濾紙上吸干 置于PDA平板上 于 25 1 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 4 d后 將病樣組織上長出的 菌絲轉(zhuǎn)接到另一個PDA平板上 采用改良的單 孢分離法 13 純化病原菌 將孢子懸浮液稀釋后 用無菌針頭轉(zhuǎn)移至WA培養(yǎng)基上 置于 25 1 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h后 用無菌針頭將萌發(fā)孢子 挑出 進一步純化培養(yǎng) 7 d后 將病原菌轉(zhuǎn)至 1 8 mL凍存管 存放于4 冰箱 備用 1 2 3 芹菜根腐病病原菌的形態(tài)學鑒定 將純化后的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上 置于 25 1 下暗培養(yǎng) 培4 d時測量菌落直 徑 7 d后觀察其在PDA培養(yǎng)基上的菌絲形狀和 色素產(chǎn)生情況等特征 并拍照記錄 將純化的菌 株接種至CLA培養(yǎng)基上 誘導產(chǎn)生分生孢子 15 d后于顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài) 參考LES LIE等 14 和王拱辰等 15 的方法進行形態(tài)學鑒定 1 2 4 芹菜根腐病病原菌的分子生物學鑒定 1 病原菌DNA提取 采用植物真菌基因組DNA試劑盒提取病原 菌DNA 試驗步驟參照試劑盒說明書 根據(jù)形 態(tài)學鑒定結(jié)果 每種菌選取3株代表菌株活化培 養(yǎng) 7 d后提取菌株DNA 提取的DNA模板于 20 保存 備用 2 PCR引物的選擇 利用rDNA ITS序列引物ITS1和ITS4以及 翻譯延長因子TEF 1 序列引物EF 1H和EF 2T 表1 進行PCR擴增 引物委托擎科生物技術(shù)有 限公司 西安 合成 3 目的基因的擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析 擴增體系25 L 包括 PCR Taq Mix 13 L ddH2O 6 L 上 下游引物各2 L DNA 2 L 擴增條件 94 預變性3 min 94 變性30 s 52 退火30 s 72 延伸30 s 共35個循環(huán) 72 延伸10 min 4 保存 以ddH2O為陰性對 照 擴增產(chǎn)物在1 0 瓊脂糖凝膠上電泳30 min 于凝膠成像系統(tǒng)中確認目的片段后 將PCR產(chǎn)物 送至擎科生物技術(shù)有限公司 西安 進行基因測 序 測序結(jié)果在NCBI GenBank https blast ncbi nlm nih gov 數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索 下載與 目標序列相似度99 以上的序列 使用BioEdit 7 0 5進行比對分析 使用MEGA 6 06構(gòu)建系統(tǒng) 發(fā)育樹 1 2 5 病原菌致病性的測定 于2021年7月 在智能人工氣候箱內(nèi)進行 致病性測定 試驗采用根部刺傷接種法接種 于 PDA培養(yǎng)7 d后 加無菌水洗脫孢子 制成孢子 密度為1 106 mL 1的懸浮液 16 待芹菜長至4 5葉時 用無菌針頭刺傷芹菜主根 每株芹菜注 入孢子懸浮液10 mL 以等量無菌水作為對照 2周后觀察發(fā)病情況 分離發(fā)病植株病原物 提 取病原菌DNA 擴增后測序進行鑒定 1 3 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007與SPSS 19 0軟件 進行統(tǒng)計分析 應用Duncan氏新復極差法進行 差異顯著性檢驗 2 結(jié)果與分析 2 1 芹菜根腐病田間癥狀及發(fā)病情況 2 1 1 田間癥狀 根腐病致使芹菜長勢不良 圖1a 達不到商 用標準 或?qū)е赂扛癄€ 植株大面積死亡 引起 田間缺苗斷壟 圖1b 調(diào)查發(fā)現(xiàn)芹菜根腐病有 2種癥狀 1 植株莖基部出現(xiàn)褐色水漬狀病斑 莖基部縊縮 病斑由外向內(nèi)侵入維管束 圖1c 2 發(fā)病始于根尖 病斑自下而上延伸 整個主 根腐爛壞死 病原菌繼續(xù)向上侵染新葉與莖稈 表 1 芹菜根腐病鑒定所用引物序列 Tab 1 Primer sequence for identification of celery root rot 基因 gene 引物 primer 序列 5 3 sequence 目的片段長度 bp target fragment length rDNA ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 750 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC TEF 1 EF 1H ATGGGTAAGGAGGACAAGAC 700 EF 2T GGAAGTACCAGTGATCATGTT 942云南農(nóng)業(yè)大學學報第 37 卷 直至死亡 或芹菜主根部分腐爛 未腐爛處增生 大量須根 但長勢較矮小或下部葉片偏黃 部分 芹菜出現(xiàn)維管束變色 空心 圖1d f 2 1 2 發(fā)病情況 共調(diào)查139個芹菜種植地 除隴西縣馬河鎮(zhèn) 隴海線旁1個田塊未發(fā)病外 其余調(diào)查地塊均有 根腐病發(fā)生 平均病田率為63 54 但各地發(fā)病 率存在差異 由表2可知 田塊病株率在0 67 50 之間 平均每個地塊病株率為24 45 馬河鎮(zhèn)化家川的病株率最高 為67 50 發(fā)病最 普遍 西鞏驛南河僅次于馬河鎮(zhèn)化家川 病株率 為48 75 內(nèi)官鎮(zhèn)萬崖村與團結(jié)鎮(zhèn)馬家寺村的病 株率最低 表 2 定西市芹菜產(chǎn)區(qū)根腐病發(fā)生情況調(diào)查 Tab 2 Investigation of root rot disease in celery of Dingxi City 采樣地 sampling site 病田率 diseased field rate 病株率 diseased plant rate 團結(jié)鎮(zhèn) Tuanjie Town 馬家寺村 Majiasi Village 25 00 25 00 bc 8 25 8 25 bc 唐家堡 Tangjiabu 45 83 20 84 bc 23 45 8 84 bc 東坡村 Dongpo Village 25 00 25 00 bc 17 50 17 50 bc 馬河鎮(zhèn) Mahe Town 隴海線 Longhaixian 0 00 0 00 c 0 00 0 00 c 化家川 Huajiachuan 100 00 0 00 a 67 50 11 09 a 巉口鎮(zhèn) Chankou Town 東川村 Dongchuan Village 100 00 0 00 a 27 29 4 69 abc 趙家卜村 Zhaojiabo Village 100 00 0 00 a 35 00 8 66 abc 西鞏驛鎮(zhèn) Xigongyi Town 營房村 Yingfang Village 100 00 0 00 a 21 25 9 66 bc 南河 Nanhe 100 00 0 00 a 48 75 21 83 ab 魯家溝鎮(zhèn) Lujiagou Town小岔口村 Xiaochakou Village 100 00 0 00 a 30 00 15 68 abc 鳳翔鎮(zhèn) Fengxiang Town 紅土坡 Hongtupo 75 00 25 00 ab 22 5 10 30 bc 蘇家灣村 Sujiawan Village 53 80 15 11 ab 12 00 3 67 bc 內(nèi)官鎮(zhèn) Neiguan Town萬崖村 Wanya Village 25 00 25 00 bc 8 33 8 33 bc 符川鎮(zhèn) Fuchuan Town高陽村 Gaoyang Village 39 98 20 19 bc 34 50 22 59 abc 注 表中數(shù)據(jù)為 平均值 標準誤 不同小寫字母表示在0 05水平差異顯著 Note Data used by mean SE different lowercase letters indicate significant difference at 0 05 level a 1 2 3 4 c d e f b 注 a 發(fā)病芹菜 1 2 3 與健康 4 芹菜 b 田間癥狀 c 莖基部縊縮腐爛 d 下部主根腐爛 e 和f 莖基部維管束變色 Note a diseased 1 2 3 and healthy 4 celery b field symptoms c stem base rot with constriction d lower taproot rot e and f vascular bundle of stem discolor 圖 1 定西市芹菜根腐病田間癥狀 Fig 1 Field symptoms of celery root rot in Dingxi City 第 6 期張 敏 等 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及病原優(yōu)勢種類分析943 2 2 芹菜根腐病真菌的分離和形態(tài)觀察 經(jīng)組織分離和純化 從定西市芹菜主要種植 區(qū)采集的病樣中獲得78株鐮孢菌 Fusarium spp 菌株 根據(jù)菌落形態(tài) 菌絲生長狀態(tài) 色素顏色 和孢子形態(tài) 將78株鐮孢菌初步分為19組 每 組類型選取1株代表菌株 用于形態(tài)學與分子生 物學鑒定 2 2 1 芹菜根腐病原菌形態(tài)學鑒定 代表菌株C33的形態(tài)特征見圖2 菌株在 PDA上培養(yǎng)時易發(fā)生突變 部分菌株不產(chǎn)生氣生 菌絲 產(chǎn)生 濕 狀菌絲體 中心呈淺紫色 邊緣 白色 培養(yǎng)4 d后 菌落直徑為45 00 48 00 mm 背面中間為淺紫色 邊緣為白色 基物不變色 氣生菌絲呈棉絮狀 顏色為淡紫色到白色 大分 生孢子數(shù)量少 月牙形稍彎 多數(shù)3隔 向兩端 逐漸均勻變尖 大小為11 18 27 60 m 3 83 3 96 m 小分生孢子數(shù)量多 圓形或卵圓形 假 頭狀著生在分生孢子梗上 大小為6 14 10 42 m 2 35 3 58 m 厚垣孢子易產(chǎn)生 單生對生或串 生 球形 一般位于氣生菌絲末端或中間 依據(jù) 上述形態(tài)特征 將編號為C33 B4 B16 C8 C16 C29 B1和D4的菌株歸為一種 初步鑒 定為尖孢鐮孢菌 F oxysporum 代表菌株A11的形態(tài)特征見圖3 在PDA 平板上培養(yǎng)4 d后 菌落直徑為43 50 56 50 mm 分布均勻 菌絲茂密且致密 氣生菌絲白色棉絮 狀 菌落背面白色 基物不變色 菌絲光滑有隔膜 分枝 大分生孢子為無色鐮刀型 較寬 粗壯 直 10 m e f b c d a 10 m 10 m 10 m 10 m 注 a 培養(yǎng)菌株正面 左 和背面 右 的形態(tài) 下同 b 大分生孢子 c 小分生孢子 d 和e 厚垣孢子 f 大分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) Note a frontage left and backside right morphology of cultured strain the same as below b macroconidium c microconidium d and e chlamy dospores f conidiogenous cell of macroconidium 圖 2 尖孢鐮孢菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征 Fig 2 Culture and morphological characteristics of Fusarium oxysporum 5 m 10 m 10 m 20 m 10 m 10 m b a e f g c d 注 b 小分生孢子 c 大分生孢子 d 分生孢子座 e 厚垣孢子 f 和g 小 大分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) Note b microconidium c macroconidium d sporodochidium e chlamydospores f and g conidiogenous cell of micro conidium macroconidium 圖 3 茄病鐮孢菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征 Fig 3 Culture and morphological characteristics of F solani 944云南農(nóng)業(yè)大學學報第 37 卷 或彎曲 0 4隔膜 多數(shù)3個隔膜 頂端細胞鈍圓 形 有的基胞有足跟 有的幾乎圓柱形 大分生孢 子通過分生孢子座產(chǎn)生 大小為24 93 35 56 m 3 72 4 63 m 單瓶梗產(chǎn)孢 小分生孢子卵圓形 橢圓形或腎形 有隔或無隔 大小為6 45 9 34 m 2 42 3 56 m 厚垣孢子單生或串生 多在菌絲中 間或短的側(cè)枝上形成 無色 壁厚 依據(jù)上述形 態(tài)特征 將編號為A11 D16 D17和A7的菌株 歸為一種 初步鑒定為茄病鐮孢菌 F solani 代表菌株D8的形態(tài)特征見圖4 在PDA上 培養(yǎng)4 d后 菌落直徑為29 50 30 00 mm 初期 菌落邊緣白色 氣生菌絲棉絮狀桃紅色 生長后 期菌落從中間開始變黃 菌落中間有明顯的黃色 同心輪紋 從菌落邊緣到中間桃紅色逐漸加深 PDA上未觀察到大分生孢子 CLA上大分生孢 子彎曲呈紡錘狀 頂胞漸細 基胞足跟明顯 1 4 個隔膜 大小為12 43 19 85 m 2 62 4 33 m 單瓶梗產(chǎn)孢 小分生孢子橢圓形或卵圓形 0 1 個隔膜 大小為8 09 14 03 m 2 23 3 11 m 厚垣孢子球形單生 對生或串生 依據(jù)上述形態(tài) 特征 將標號為A1 A2 A5 A6 A9 A12和 D8的菌株歸為一種 初步鑒定為銳頂鐮孢菌 F acuminatum 2 2 2 芹菜根腐病原菌代表菌株的分子生物學鑒定 1 rDNA ITS序列分析 采用通用引物ITS1 ITS4擴增后 獲得大小 約為700 bp的片段 經(jīng)NCBI比對和MEGA系 統(tǒng)發(fā)育樹 圖5 分析可知 19個株菌聚為3類 第 I類包括菌株B1 B4 B16 C8 C16 C29 C33 和D4 與尖孢鐮孢菌的遺傳距離為0 置信度 為99 與形態(tài)鑒定結(jié)果一致 將其鑒定為尖孢 鐮孢菌 第II類包括菌株A7 A11 D17和D16 該類與茄病鐮孢菌遺傳距離為0 置信度為99 與形態(tài)鑒定結(jié)果一致 將其鑒定為茄病鐮孢菌 第III類包括菌株A1 A2 A5 A6 A9 A12 和D8 該類與銳頂鐮孢菌遺傳距離為0 置信度 為99 與形態(tài)鑒定結(jié)果一致 將其鑒定銳頂鐮 孢菌 2 EF 1 序列分析 基于EF 1 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 圖6 與rDNA ITS序列分析結(jié)果相似 將病原菌聚為3類 第 1類包括菌株C8 C16 C29和C33等 這些代 表菌株與尖孢鐮孢菌聚為1個分支 與形態(tài)鑒定 結(jié)果一致 將其鑒定為尖孢鐮孢菌 第2類包括 菌株D8 A2 A6和A9等 與銳頂鐮孢菌聚在 一起 與初步形態(tài)鑒定結(jié)果相符 將其鑒定為銳 頂鐮孢菌 第3類包括菌株D16 D17和A11 等 該類與茄病鐮孢菌聚為1個分支 與形態(tài)鑒 定結(jié)果一致 將其鑒定為茄病鐮孢菌 結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定 分離純化得 到的78株鐮孢菌中 有尖孢鐮孢菌62株 銳頂 10 m b c a d e 10 m 10 m 20 m 注 b 和d 厚垣孢子 c 大分生孢子 e 小分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) Note b and d chlamydospores c macroconidium e conidiogenous cell of conidium 圖 4 銳頂鐮孢菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征 Fig 4 Culture and morphological characteristics of F acuminatum 第 6 期張 敏 等 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及病原優(yōu)勢種類分析945 鐮孢菌11株和茄病鐮孢菌5株 分離頻率分別 為79 49 14 10 和6 41 2 3 芹菜根腐病分離物的致病性測定 分別將尖孢鐮孢菌 銳頂鐮孢菌和茄病鐮孢 菌3種病原菌代表菌株接種至健康芹菜植株上 7 d 后尖孢鐮孢菌最先從莖基部發(fā)病 其他菌株14 d 后才出現(xiàn)病癥 從發(fā)病植株部位分離到病原菌 純化培養(yǎng)后 經(jīng)形態(tài)鑒定與分子鑒定確定該病原 菌與接種病原菌一致 表明這3種菌均為定西市 田間芹菜根腐病致病菌 尖孢鐮孢菌致病性最強 發(fā)病情況最嚴重 發(fā)病率為91 66 病情指數(shù)為78 33 茄病鐮孢 菌發(fā)病率為77 78 病情指數(shù)為24 44 癥狀表 現(xiàn)為莖基部腐爛或主根下部腐爛 植株萎蔫 銳 頂鐮孢菌發(fā)病率為22 22 病情指數(shù)為11 11 多表現(xiàn)為莖基部維管束中間出現(xiàn)病斑 植株矮 小 須根增多 尖孢鐮孢菌在田間能引起芹菜根 與莖基部腐爛 盆栽中芹菜也出現(xiàn)該癥狀 植株 枯死 盆栽試驗與大田癥狀相符 銳頂鐮孢菌在 田間引起芹菜根部腐爛 盆栽試驗與田間癥狀相 比發(fā)病較輕 茄病鐮孢菌在田間能引起根與芹菜 莖基部發(fā)病 盆栽試驗發(fā)病與田間癥狀相符 圖7 試驗結(jié)果表明 尖孢鐮孢菌致病性最強 是甘肅 省定西市芹菜種植地優(yōu)勢病原菌 3 討論 鐮孢菌類根腐病是一類重要的真菌性病害 可危害馬鈴薯 17 苜蓿 9 青稞 18 缸豆 19 棉 花 20 和芹菜 5 等作物 由鐮孢菌引起的根腐病在 芹菜苗期與生長期均可發(fā)生 是全周期型病害 本研究利用形態(tài)學方法與分子生物學方法 將引 起甘肅省定西市芹菜根腐病的病原菌鑒定為尖孢 鐮孢菌 茄病鐮孢菌和銳頂鐮孢菌 明確了甘肅 省芹菜根腐病病原種類 并首次發(fā)現(xiàn)銳頂鐮孢菌 能引起芹菜根腐病 尖孢鐮孢菌從莖基部 根和 莖基部維管束分離得到 茄病鐮孢菌主要分離自 莖基部和根 銳頂鐮孢菌在根 莖基部與莖稈處 均可分離到 尖孢鐮孢菌分離頻率最高 盆栽試 驗發(fā)病也最嚴重 表明尖孢鐮孢菌是定西市芹菜 根腐病的優(yōu)勢病原 不同地區(qū)芹菜根腐病原菌有差異 王玲娜 21 報道內(nèi)蒙古芹菜根腐致病菌包括接骨木鐮孢菌 F sambucinum 鏈格孢 Alternaria alternata 尖孢鐮刀萎蔫?；?F oxysporum f sp Vasin fectum 芬芳鐮孢菌 F redolen 黃瓜萎蔫病菌 Plectosphaerella cucumerina 和尖孢鐮孢菌 F oxysporum 扈順等 4 在內(nèi)蒙古商都的西芹根腐病 A2 A5Fusarium acuminatum MT525360 Fusarium acuminatum MT974003 A12 Fusarium acuminatum KF887088 A1 D8Fusarium acuminatum MF523230 A9A6 Fusarium acuminatum LC543657 B4Fusarium oxysporum MN856370 B16Fusarium oxysporum MT529295 D4B1 C16C29 C33C8 D16 Fusarium solani MK367751 A11 Fusarium solani MN013857 D17 Fusarium solani JF311928 A7 Plectosphaerella cucumerina EU594566 99 99 67 99 0 050 圖 5 基于rDNA ITS序列構(gòu)建3種病原菌與 相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 5 Phylogenetic tree of three pathogens and other re lated strains based on the rDNA ITS sequence C8 Fusarium oxysporum JQ965439 C33 C29 Fusarium oxysporum MN417192 C16 D4 B1 B4 B16 Fusarium oxysporum MW362041 Fusarium oxysporum JF740855 Fusarium oxysporum MK968952 A1 Fusarium acuminatum MH025841 A2 Fusarium acuminatum MG826892 A5 A6 A9 Fusarium acuminatum JX397865 Fusarium acuminatum MG826875 A12 D8 Fusarium acuminatum KY365617 Fusarium acuminatum KY081594 A11 D16 D17 A7Fusarium solani KX094911 Fusicolla aquaeductuum KM231406 73 99 96 95 57 91 0 2 Fusarium solani MN977917 圖 6 基于EF 1 序列構(gòu)建3種病原菌與 相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 6 Phylogenetic tree of three pathogens and other re lated strains based on the EF 1 sequence 946云南農(nóng)業(yè)大學學報第 37 卷 樣分離出茄病鐮孢菌 F solani 郝永娟等 22 發(fā)現(xiàn) 天津芹菜的主要致病菌為茄病鐮孢菌 石延霞等 23 和晉知文 24 調(diào)查發(fā)現(xiàn) 北京地區(qū)芹菜根腐病主要 病原是茄病鐮孢菌 側(cè)雄腐霉菌 Pythium paroe candrum 核盤菌 Sclerotinia sclerotiorum 胡 蘿卜軟腐果膠桿菌 Pectobacterium carotovorum 王國榮等 25 報道引起浙江省芹菜莖基腐病的病原 菌為尖孢鐮刀菌 各地病原菌的差異可能與作物 品種和種植環(huán)境有關(guān) 鐮孢菌的形態(tài)復雜 在生長過程中形態(tài)變異 較大 形態(tài)鑒定很難準確地將其鑒定到種 26 研 究發(fā)現(xiàn) ITS mtSSU 微管蛋白和TEF 1 能 準確鑒定鐮孢菌 19 ITS被廣泛運用于真菌鑒 定 但對于鐮孢菌親緣關(guān)系較近的種或復合種 ITS單一基因片段區(qū)分度不高 很難準確鑒定 因此 需挖掘更多的基因片段或多基因聯(lián)合才能 準確地鑒定 26 TEF 1 基因因其位點核苷酸的替 換率高 對親緣關(guān)系較近的鐮孢菌有較高分辨 力 常作為鐮孢菌屬真菌鑒定的有效方法 27 如 張祥麗等 28 通過ITS與TEF 1 基因鑒定出 鐵皮石斛鐮刀菌根腐病病原菌為變紅 木賊鐮刀 菌復合種群 F incarnatum equiseti species com plex 李雪萍等 10 利用TEF 1 基因鑒定青稞根 腐病病菌為尖孢鐮孢菌 木賊鐮孢菌 F equiseti 與銳頂鐮孢菌 本研究在形態(tài)學觀察的基礎(chǔ)上 通過分子生物學手段選擇特異基因片段ITS與 TEF 1 序列對芹菜根腐病病原菌進行鑒定 結(jié)果 更加準確 可靠 從莖基部發(fā)病的芹菜植株在短時間內(nèi)死亡 從主根發(fā)病的芹菜 植株須根化嚴重 芹菜勉強 生長 須根少的植株遇高溫后出現(xiàn)萎蔫 發(fā)病后 期新長出的須根也會腐爛 最終導致芹菜心葉和 莖稈發(fā)病 須根化嚴重的芹菜沒有主根或主根腐 爛 推測是芹菜須根充當主根為芹菜提供營養(yǎng)物 質(zhì) 這可能是一種補償作用 29 同一病株可分離 出多種病原菌 說明田間存在多種病原復合侵染 的現(xiàn)象 王家和等 30 發(fā)現(xiàn) 3種鐮刀菌混合接種 可加重蠶豆枯萎病 姚天明等 31 證實尖孢鐮刀菌 及歐文氏桿菌復合侵染可引起半夏腐爛 張德珍 等 32 研究表明 鐮孢菌與多種病原菌復合侵染共 同導致小麥根腐病 由此推測 芹菜根腐病田間 可能存在復合侵染 從而加重發(fā)病 對于復合侵 染病菌的種類和侵染程度還需進一步開展研究 4 結(jié)論 定西市芹菜根腐病病田率為63 54 病株率 為24 45 田間發(fā)病有2種癥狀 分別是芹菜主 根腐爛和莖基部縊縮腐爛 分離純化得到78株 鐮孢菌 其中尖孢鐮孢菌 F oxysporum 銳頂 鐮孢菌 F acuminatum 和茄病鐮孢菌 F solani 的分離頻率分別為79 49 14 10 和6 41 尖 孢鐮孢菌的致病性最強 是定西市芹菜根腐病的 優(yōu)勢病原菌 銳頂鐮孢菌引起芹菜根腐病為國內(nèi) 首次報道 參考文獻 劉雄 馬騰 高建德 等 芹菜藥用價值研究進展 J 甘 1 CK 尖孢鐮孢菌 F oxysporum 茄病鐮孢菌 F solani 銳頂鐮孢菌 F acuminatum 圖 7 3種鐮孢菌對芹菜幼苗的致病性測定 Fig 7 Pathogenicity test of three kinds of Fusarium spp on celery seedling 第 6 期張 敏 等 甘肅省定西市芹菜根腐病發(fā)生及病原優(yōu)勢種類分析947 肅中醫(yī)學院學報 2015 32 2 74 CHEEPTHAM N TOWERS G H N Light mediated activities of some Thai medicinal plant teas J Fitoter apia 2002 73 7 8 651 DOI 10 1016 S0367 326X 02 00224 1 2 楊海興 張晶 李強 等 蘭州高原夏菜芹菜標準化栽培 技術(shù) J 中國蔬菜 2019 1 92 3 扈順 高婧 王勇 等 西芹根腐病病原菌的分離與鑒 定 J 北方農(nóng)業(yè)學報 2019 47 5 65 DOI 10 3969 j issn 2096 1197 2019 05 12 4 張悅麗 張博 馬立國 等 芹菜根莖腐病病原鑒定 J 植物保護學報 2017 44 2 347 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2017 2016144 5 耿麗華 宮國義 宋順華 等 西瓜種傳枯萎病病原菌鑒 定及其防控方法 J 植物保護學報 2019 46 2 330 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2019 2017215 6 曹雪梅 李生兵 張惠玲 等 甘草根腐病病原菌鑒 定 J 植物病理學報 2014 44 2 213 DOI 10 3969 j issn 1672 6820 2017 02 002 7 BIENAPFL J C MALVICK D K PERCICH J A J P D Fir