園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 461 474 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2021 1215 http www ahs ac cn 461 收稿日期 2022 08 17 修回日期 2022 11 04 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 31772253 32172512 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目 CX 20 2023 江蘇省碳達(dá)峰碳中和前沿 基礎(chǔ)專項(xiàng)資金項(xiàng)目 BK20220005 江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目 通信作者 Author for correspondence E mail wlj 外源 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的 機(jī)理研究 饒智雄 1 安玉艷 1 曹榮祥 2 唐 泉 2 汪良駒 1 1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 南京 210095 2 江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 南京 210046 摘 要 以栽培草莓 紅顏 Fragaria ananassa Duch Benihoppe 為材料 探討 5 氨基乙酰 丙酸 ALA 與脫落酸 ABA 以及生長(zhǎng)素 IAA 之間的關(guān)系 以期為 ALA 在草莓生產(chǎn)上應(yīng)用提供理 論依據(jù) 結(jié)果顯示 外源 ABA 處理抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng) 而 ALA 緩解 ABA 的抑制效應(yīng) ABA 處理 降低草莓根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素含量 ALA 則促進(jìn)內(nèi)源 ABA 含量提高 ABA 和 或 ALA 處理對(duì)草莓根尖 ABA 生物合成關(guān)鍵基因 NCED1 NECD2 以及 ABA 氧化代謝基因 CYP707A 的表達(dá)沒(méi)有顯著影響 但 ABA 處理誘導(dǎo)其受體基因 PYL4 和 PYL8 以及 ABA 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白激酶基因 SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 和 SnRK2 6 表達(dá)上調(diào) 而 ALA 卻沒(méi)此效應(yīng) 說(shuō)明 ALA ABA 調(diào)控草莓根系 伸長(zhǎng)生長(zhǎng)效應(yīng)不涉及 ABA 信號(hào)途徑 另一方面 ABA 和 或 ALA 處理對(duì) IAA 合成基因 YUC1 表達(dá)沒(méi) 有影響 ABA 處理下調(diào) YUC2 和 YUC3 以及 IAA 內(nèi)向運(yùn)輸基因 AUX1 表達(dá) 但是這種效應(yīng)不能被 ALA 逆轉(zhuǎn) 值得關(guān)注的是 IAA 外向運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因 PIN1 在 ABA 處理后表達(dá)下調(diào) 而 ALA 可以逆轉(zhuǎn) ABA 效應(yīng) 暗示該基因可能參與 ALA ABA 調(diào)控草莓根系生長(zhǎng) 利用攜帶綠色熒光蛋白 GFP 基因的轉(zhuǎn)基因 擬南芥植株研究發(fā)現(xiàn) ABA 抑制 AtPIN1 GFP 表達(dá) 而 ALA 逆轉(zhuǎn) ABA 的抑制效應(yīng) 生物信息分析表明 栽培草莓 PIN1 氨基酸序列與其他薔薇科植物的同源性較高 蛋白質(zhì)兩端存在多個(gè)跨膜區(qū)域 將帶有 GFP 的 FaPIN1 轉(zhuǎn)入本氏煙草 其熒光信號(hào)分布于細(xì)胞質(zhì)膜 克隆 FaPIN1 全長(zhǎng) 構(gòu)建到雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)載體 上并轉(zhuǎn)入擬南芥 這種超表達(dá) FaPIN1 植株根系生長(zhǎng)對(duì) ABA 處理的敏感性下降 ALA 緩解效應(yīng)也下降 以上結(jié)果說(shuō)明 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)在于 IAA 極性運(yùn)輸?shù)鞍谆?PIN1 的表達(dá) 即 ALA 通過(guò)促進(jìn) IAA 極性運(yùn)輸來(lái)緩解 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng) 關(guān)鍵詞 草莓 根系 生長(zhǎng) 5 氨基乙酰丙酸 脫落酸 生長(zhǎng)素 中圖分類號(hào) S 668 4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2023 03 0461 14 Studies on Mechanisms of ALA Alleviating ABA Inhibiting Root Growth of Strawberry RAO Zhixiong 1 AN Yuyan 1 CAO Rongxiang 2 TANG Quan 2 and WANG Liangju 1 1 College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China 2 Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Hilly Area Nanjing 210046 China Abstract The relationship among 5 aminolevulinic acid ALA abscisic acid ABA and auxin Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 462 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 IAA in strawberry roots growth were discussed It was found that exogenous ABA treatment significantly inhibited strawberry root growth while ALA alleviated the inhibitory effect by ABA ABA reduced the endogenous IAA content in the root tips of strawberry while ALA promoted endogenous ABA content The expressions of NCED1 NCED2 and CYP707A referring to ABA biosynthesis and catabolism respectively were not different among treatments whereas that of PYL4 and PYL8 both coding ABA receptors and SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 and SnRK2 6 which code the protein kinases in ABA signaling pathway were up regulated by ABA but not mediated by ALA These results suggested that the genes in ABA signaling route were not involved in ALA ABA regulating root growth of strawberry On the other hand ABA down regulated expressions of YUC2 YUC3 referring to IAA synthesis and AUX1 coding auxin influx carrier However the down regulation of gene expressions by ABA were not reversed by ALA This also means that these genes are not so important in ALA ABA regulated root growth of strawberry Nevertheless the expression of PIN1 which codes IAA exporter carrier was down regulated by ABA and ALA reversed the down regulation suggesting that PIN1 may be involved in ALA ABA regulating root growth of strawberry In a transgenic Arabidopsis carrying the green fluorescent protein gene GFP it was found that AtPIN1 GFP expression was inhibited by ABA and reversed by ALA Bioinformatic analysis showed that the amino acid sequence of FaPIN1 in the cultivated strawberry is high homology with many Rosaceous plants with several transmembrane regions located at both ends of the polypeptide When FaPIN1 GFP was transferred into tobacco Nicotiana benthamiana the fluorescence was distributed in the plasma membrane When the cloned FaPIN1 was constructed into an estradiol induced expression vector and transformed into Arabidopsis the root growth of the transgenic plants was less sensitive to ABA treatment and the ALA mitigation was also less significant These results suggest that FaPIN1 is an important factor during ALA ABA regulating root growth and the alleviation of ALA on ABA inhibiting root growth may be dependent on the promotion of IAA polar transport in the root tip of strawberry Keywords Fragaria ananassa root growth 5 aminolevulinic acid ABA auxin 植物根系不僅能夠從土壤中吸收水分和養(yǎng)分并固定植株 Bellini et al 2014 Mai et al 2014 Slovak et al 2015 也是感知外界刺激如土壤鹽分 Duan et al 2013 水分 Zhang Davies 1987 光照和重力 Buer Muday 2004 等理化信號(hào)的重要器官 IAA 在植物根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng) 側(cè)根發(fā)生以及不定根誘導(dǎo)中起到重要作用 Wei Li 2016 相對(duì)而言 ABA 調(diào)控根系生長(zhǎng)的研 究較少 ABA 是一種逆境激素 在低溫 Chandler Robertson 1994 干旱 Zhang Davies 1987 鹽漬 Shi Zhu 2002 等逆境條件下 植物內(nèi)源 ABA 含量急劇上升 ABA 可以抑制種子萌發(fā) Leung Giraudat 1998 誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉 Pei et al 2000 增強(qiáng)植株抗逆性 Antoni et al 2011 Wang et al 2017 早期研究表明 在根系上 ABA 以濃度依賴方式抑制植物根系生長(zhǎng) Pilet Chanson 1981 鹽漬下 根系生長(zhǎng)受抑制可能與內(nèi)源 ABA 含量上升有關(guān) Duan et al 2013 甚至認(rèn)為逆 境脅迫誘導(dǎo)內(nèi)源 ABA 上升以抑制植株 包括根系 生長(zhǎng) Belda Palaz n et al 2020 Kamiyama et al 2021 從而增強(qiáng)植株生存能力 5 氨基乙酰丙酸 5 aminolevulinic acid ALA 是生物體內(nèi)卟啉化合物 如葉綠素 亞鐵血紅 饒智雄 安玉艷 曹榮祥 唐 泉 汪良駒 外源 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的機(jī)理研究 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 461 474 463 素 細(xì)胞色素等 生物合成的關(guān)鍵前體 同時(shí)具有多種生物調(diào)節(jié)活性 汪良駒 等 2003 Akram Ashraf 2013 Wu et al 2019b 外源 ALA 能顯著提高植物光合能力 促進(jìn)作物產(chǎn)量提高 Hotta et al 1997 Wang et al 2004 并改善果品品質(zhì) Zheng et al 2021 在鹽脅迫 Wang et al 2005 Zhao et al 2015 吳雯雯 等 2017 Wu et al 2019a 冷害 Wang et al 2004 Fu et al 2015 干旱 An et al 2016a Cai et al 2020 澇害 An et al 2016b 重金屬污染 Ali et al 2013 2014 除草劑毒害 Xu et al 2018 真菌侵染 Elansary et al 2019 和道路環(huán)境染污 Yang et al 2021 等生物和非生物逆境脅迫下 ALA 均可提高植株抗逆性 這表明 ALA 與 ABA 相似 都可以誘導(dǎo)植物多種抗逆性 然而 ALA 與 ABA 本身存在拮抗效應(yīng) 在葉片保衛(wèi)細(xì)胞中 ALA 增大氣孔開(kāi)度 汪良駒 等 2004 促進(jìn) CO 2 進(jìn)入葉肉細(xì)胞 從而提高植物光合性能 Wu et al 2019b 在 ABA 存在時(shí) ALA 能逆轉(zhuǎn) ABA 誘導(dǎo)的葉片氣孔關(guān)閉 陳令會(huì) 等 2014 劉龍博 等 2016 An et al 2020 從而 提高逆境下植物葉片光合能力 為研究在根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中 ALA 與 ABA 是否存在拮抗效應(yīng) 以栽培 草莓 紅顏 Fragaria ananassa Duch Benihoppe 為材料 研究 ABA 和 ALA 對(duì)根系生長(zhǎng)的 效應(yīng) 并借助不同基因型擬南芥發(fā)現(xiàn) IAA 在其中起著重要作用 然后 克隆草莓 IAA 輸出蛋白編 碼基因 FaPIN1 構(gòu)建雌二醇誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化擬南芥后比較外源 ABA 和 ALA 對(duì)根系生 長(zhǎng)的影響 從藥物學(xué)和遺傳學(xué)兩方面探討 ABA 和 ALA 對(duì)植物根系生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其可能的機(jī)理 以便為 ALA 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料與處理 試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)進(jìn)行 以栽培草莓 紅顏 組培苗為試材研究 ABA 和 ALA 處理對(duì) 根系生長(zhǎng)的影響 同時(shí)利用擬南芥 Arabidopsis thaliana 野生型 Col 0 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 等不同基因型探討 IAA 在 ABA 和 ALA 調(diào)控植物根系生長(zhǎng)中的作 用 借助本氏煙草 Nicotiana benthamiana 進(jìn)行草莓 FaPIN1 蛋白亞細(xì)胞定位 將長(zhǎng)勢(shì)一致的草莓組培苗 無(wú)不定根 轉(zhuǎn)移至 1 2MS 基本培養(yǎng)基 含 30 g L 1 蔗糖和 7 g L 1 瓊脂 pH 5 8 上 于光照強(qiáng)度為 240 mol m 2 s 1 培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng) 光 16 h 暗 8 h 25 20 1 周后出現(xiàn)不定根 當(dāng)不定根長(zhǎng)至 0 5 cm 左右時(shí)轉(zhuǎn)移至添加不同濃度 ABA 和 或 ALA 的基本培 養(yǎng)基中 繼續(xù)培養(yǎng) 30 d 測(cè)定根系長(zhǎng)度 并以不添加對(duì)照組平均值為 100 用相對(duì)值表示 ABA 和 或 ALA 對(duì)草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響 然后 剪取 0 5 cm 左右根尖 經(jīng)液氮處理 保存于 80 冰箱中 用于 RT qPCR 和激素含量測(cè)定 將不同基因型擬南芥種子置于 4 冰箱中放置 48 h 用 75 酒精消毒 45 s 蒸餾水沖洗 3 5 次 1 次氯酸鈉消毒 5 min 再用蒸餾水沖洗干凈 播種在 1 2MS 基本培養(yǎng)基上 于上述培養(yǎng)室 中培養(yǎng) 5 d 后將幼苗分別轉(zhuǎn)移至單獨(dú)或同時(shí)含有 ABA 5 mol L 1 和 ALA 20 mg L 1 的 1 2MS 基本培養(yǎng)基上 豎直培養(yǎng) 3 d 觀察根系生長(zhǎng)差異 然后用激光共聚焦顯微鏡觀察根尖 GFP 熒光特 性 1 2 RNA 提取和 RT qPCR 采用 CTAB 改良法提取草莓根尖的 RNA Jaakola et al 2001 通過(guò) NanoDrop 2000 和 1 5 Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 464 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 的瓊脂糖電泳檢測(cè)后 將質(zhì)量合格的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 參考 TransScript One Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix 說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行 IAA 和 ABA 信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的 RT qRCR 分 析 引物序列見(jiàn)表 1 根據(jù) 2 CT 法 Livak Schmittgen 2001 以草莓 ACTIN 作為內(nèi)參基因 計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量 表 1 草莓根系 RT qPCR 分析用引物 Table 1 The primers for RT qPCR analysis of strawberry roots 引物名稱 正向序列 5 3 反向序列 5 3 Primer name Forward primer Reverse primer ACTIN F TGGGTTTGCTGGAGATGAT R GAGTTAGGAGAACTGGGTGC YUCCA1 F GAAAGGTGAGCGTGGGTTA R TATGGCGACGACGATAGAG YUCCA2 F CTCCGTCTTCATCTCCCTAA R CAAACGTACTCAATCTCCTCC YUCCA3 F CTTGTCGTCGGTTGTGGAA R GCCTGTTGAGCCCGTATTT AUX1 F CTGGTTAGCTTCACGGTCTA R GAACTCTTAGCGATGTGGG PIN1 F GGGAAAGTGGAGGGTAGAAGA R TGCCACCTGTAGGATACGAGA CYP707A F AGACGTGGAGTTTGAGGGTT R TAGTTGTGAGGTGGTGGAGG NCED1 F AGTCCGACGAGGTTGTTGTG R CCGAGTCTTTCTACCGAGCAG NCED2 F TTATCTCGCCATTGCTGAAC R GAAGGAAGAAAGAAAGGCTCAC PYL4 F CAACCCACAAGCCTACAAGCA R TCGTGACGGAGCGGTAGTTC PYL8 F CATACTACTGCCTGTCTGTC R GGATGAAACCTGCTACTT SnRK2 1 F ATTCACAACCCAAATCAACT R ACATCTGCTATCTTCCCATC SnRK2 2 F ATCCTTACTGTACGCTACGC R ACTTCCTCCTTCCTTCATTT SnRK2 3 F ACCACAATAATTTCACCACCAT R ACCTACCAAGATTCCGAGCT SnRK2 4 F TCTTGAATCGGGTTTCTTGT R CCTTCATTGGCTCATACCTC SnRK2 5 F CTACCGACTCAACTCACC R GTTCTCCGCTACACTTCT SnRK2 6 F CTTCCGCAAGACAATACA R AGATCAGATGACGGCACT SnRK2 8 F CCACAGATCACTCCGCCACC R TCGTCTTCGCTGAACCTCCC SnRK2 9 F TGCTCTTCCCGTCCAGTCAC R CCGGCCTTGCATATTCTCGT 1 3 植物激素含量測(cè)定 根據(jù)林紹艷等 2016 的方法提取草莓根尖植物激素 采用 Acquity H Class UPLC 超高效液相 色譜系統(tǒng) 美國(guó) Waters 公司 測(cè)定草莓根尖 IAA 和 ABA 含量 Raheem et al 2018 Reddy et al 2018 色譜條件 T3 柱子 100 mm 2 1 mm 1 8 m 柱溫 30 檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm 進(jìn)樣量 2 L 獲得的數(shù)據(jù)由 Waters Empower TM 色譜軟件進(jìn)行分析 1 4 激光共聚焦顯微觀察 攜帶 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 等 3 種帶綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南 芥幼苗經(jīng) 5 mol L 1 ABA 和 或 20 mg L 1 ALA 處理 3 d 后 用 Zeiss LSM 710 激光掃描共聚焦 顯微鏡觀察根尖熒光分布 激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm 發(fā)射波長(zhǎng) 510 520 nm 利用自帶 ZEN 軟件量化圖 像中熒光強(qiáng)度 每處理檢測(cè) 20 個(gè)以上樣本 1 5 草莓 IAA 運(yùn)輸?shù)鞍?FaPIN1 生物信息分析和亞細(xì)胞定位 在草莓基因組 https www rosaceae org 尋找 FaPIN1 基因 ORF 區(qū) 使用 SMART http smart embl heidelberg de 在線分析草莓 FaPIN1 蛋白結(jié)構(gòu) 利用 MEGA 6 0 軟件構(gòu)建 PIN1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化 樹(shù) 使用 Primer 5 設(shè)計(jì)包含 Xba 和 BamH 酶切位點(diǎn)的草莓 FaPIN1 基因 ORF 區(qū)引物 表 2 以 根尖 cDNA 為模板擴(kuò)增并回收膠帶 通過(guò)諾唯贊 Exnase 試劑盒將得到的 FaPIN1 基因產(chǎn)物與 pCMBIA1300 GFP 載體酶切后重組 反應(yīng)體系為 線性載體 50 ng 目的片段 100 ng 5 Cell buffer 饒智雄 安玉艷 曹榮祥 唐 泉 汪良駒 外源 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的機(jī)理研究 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 461 474 465 2 L Exnase 酶 1 L 加 ddH 2 O 補(bǔ)齊至 10 L 37 反應(yīng) 30 min 后 轉(zhuǎn)化至 DH5 大腸桿菌 挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序 選擇測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒 并轉(zhuǎn)化 GV3101 農(nóng)桿菌 選取 PCR 檢 測(cè)為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌單克隆制備侵染液 注射 5 周齡本氏煙草葉片 2 d 后摘取葉片 于激光共聚焦 顯微鏡下觀察下表皮綠色熒光分布 對(duì)照組為 35S GFP 樣品組為 35S GFP FaPIN1 1 6 草莓 FaPIN1 的克隆與擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá) 根據(jù)草莓基因組 FaPIN1 基因 ORF 區(qū)設(shè)計(jì)兩端引物 表 2 克隆基因全長(zhǎng) 并于 5 端和 3 端分 別加上 Xho 和 Spe 限制性酶切位點(diǎn) 連接到雌二醇誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子 Zuo et al 2001 楊桂香 等 2005 下游 形成 pER8 PIN1 表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 將測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 侵 染盛花期擬南芥 每周 1 次 共 3 次 在莢果成熟開(kāi)裂前收取 T 0 代種子 將 T 0 代擬南芥種子播種于含有 20 mg L 1 潮霉素的 1 2MS 篩選培養(yǎng)基上 2 周后將抗性植株移 栽至營(yíng)養(yǎng)土中 用 CTAB 法提取葉片 DNA Cheng et al 2003 利用 ORF 全長(zhǎng)引物序列和 PCR 法檢測(cè)草莓 PIN1 是否整合至擬南芥基因組 收集 T 1 代轉(zhuǎn)基因種子 播種于 1 2MS 基本培養(yǎng)上 單 系收種 獲得 T 2 代種子 將 3 日齡轉(zhuǎn) pER8 PIN1 擬南芥純合體與野生型 Col 幼苗轉(zhuǎn)移到含 5 mol L 1 ABA 和 或 20 mg L 1 ALA 培養(yǎng)基上 同時(shí)添加 10 mol L 1 雌二醇作為化學(xué)誘導(dǎo)劑 豎直培養(yǎng) 5 d 比較不同處理對(duì)不同基因型擬南芥植株根系生長(zhǎng)的影響 剪取根尖 根據(jù)表 1中 FaPIN1 引物序列 用 RT qPCR 法檢測(cè) FaPIN1 在擬南芥中的表達(dá)水平 表 2 草莓 FaPIN1 亞細(xì)胞定位和 FaPIN1 超表達(dá)試驗(yàn)用引物 Table 2 The primers for subcellular localization and overexpression analysis of FaPIN1 引物名稱 正向序列 5 3 反向序列 5 3 Primer name Forward primer Reverse primer PIN1 ORF ATGATCACATTATCAGACTTTTAC TCATAGCCCCAGCAAAATG PIN1 for GFP GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGATCACATTATCAG ACTTTTAC CGCCCTTGCTCACCATGGATCCTAGCCCCAGCAAA ATGTAG PIN1 for pER8 CTAGTCGACTCTAGCCTCGAGATGATCACATTATCAGA CTTTTAC GGGAGGCCTGGATCGACTAGTTCATAGCCCCAGCA AAATG 1 7 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均為 3 次以上生物學(xué)重復(fù)的平均值 采用 Excel 2007 處理數(shù)據(jù)和繪制圖表 SPSS 19 0 進(jìn)行方差分析和差異性測(cè)驗(yàn) 用 Adobe Illustrator CS5 進(jìn)行圖像處理 2 結(jié)果與分析 2 1 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng)的濃度效應(yīng)以及 ALA 的緩解效應(yīng) 圖 1 A 顯示 經(jīng) 0 05 5 mol L 1 ABA 處理的草莓植株不定根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到不同程度抑制 當(dāng) ABA 濃度為 0 5 2 5 和 5 mol L 1 時(shí) 根系相對(duì)長(zhǎng)度分別為對(duì)照的 58 93 41 61 和 20 71 綜合考慮 選擇 2 5 mol L 1 作為 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng)研究的處理濃度 圖 1 B 顯示 在含有 2 5 mol L 1 ABA 的 1 2MS 培養(yǎng)基中添加 0 5 20 mg L 1 ALA 均有緩 解 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng)的效果 以 10 mg L 1 ALA 效果最好 根系長(zhǎng)度恢復(fù)到對(duì)照的 77 比 單獨(dú) ABA 處理高 87 92 表明 ALA 與 ABA 在調(diào)控草莓根系生長(zhǎng)上存在著拮抗效應(yīng) 當(dāng) ABA 濃 Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 466 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 度為 2 5 mol L 1 時(shí) ALA 適宜試驗(yàn)濃度為 10 mg L 1 圖 1 ABA 抑制草莓根系生長(zhǎng)的濃度效應(yīng) A 和 ALA 對(duì) ABA 2 5 mol L 1 抑制草莓根系生長(zhǎng)的緩解效應(yīng) B 圖中數(shù)據(jù)為 30 條以上根系的平均值 相同小寫字母代表差異不顯著 下同 Fig 1 The concentration effects of ABA inhibiting strawberry root growth A and the alleviation of exogenous ALA on the root growth of strawberry inhibited by ABA B The data in each figure are the means of more than 30 roots The same small letters represent no significant difference The same below 2 2 ALA 與 ABA 處理對(duì)草莓根尖內(nèi)源 IAA 和 ABA 含量的影響 IAA 往往被認(rèn)為參與調(diào)控根系生長(zhǎng) 因而推測(cè) ALA 和 ABA 調(diào)控草莓根系生長(zhǎng)過(guò)程可能也涉及 IAA 為此 檢測(cè) ALA 和 或 ABA 處理 30 d 后草莓苗根尖 IAA 和 ABA 含量 草莓根尖中 IAA 含量 ABA 單獨(dú)處理降低了 79 ALA 單獨(dú)處理沒(méi)有明顯變化 但 ALA ABA 處理比 ABA 單獨(dú) 處理提高了 1 9 倍 圖 2 這說(shuō)明 ALA 顯著緩解 ABA 誘導(dǎo)的草莓根尖 IAA 含量的下降 草莓根 尖 ABA含量 在外源 ABA單獨(dú)處理中比對(duì)照高 37 5 ALA單獨(dú)處理比對(duì)照增加 14 6 ALA ABA 處理最高 增加了 58 9 圖 2 外源 ABA 和 ALA 處理對(duì)草莓根尖內(nèi)源生長(zhǎng)素和脫落酸量的影響 Fig 2 Effects of exogenous ABA and ALA on the endogenous IAA and ABA in the root tips of strawberry 2 3 ALA 和 ABA 處理對(duì)草莓根尖 ABA 和 IAA 信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的影響 檢測(cè)結(jié)果 圖 3 圖 4 顯示 絕大多數(shù) ABA 和 IAA 信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)并沒(méi)有表現(xiàn)出 ALA 與 ABA 的相互拮抗效應(yīng) 饒智雄 安玉艷 曹榮祥 唐 泉 汪良駒 外源 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的機(jī)理研究 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 461 474 467 如圖 3 所示 ABA 生物合成關(guān)鍵基因 NCED1 NCED2 和 ABA 氧化代謝關(guān)鍵基因 CYP707A 相 對(duì)表達(dá)量對(duì) ALA 或 ABA 處理沒(méi)有明顯響應(yīng) ABA 受體蛋白基因 PYL4 PYL8 以及 ABA 信號(hào)傳遞 相關(guān)基因 SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 和 SnRK2 6 經(jīng) ABA 處理后表達(dá)上調(diào) 但 ALA 處理并沒(méi)有引起表達(dá)受抑 SnRK2 8 和 SnRK2 9 對(duì) ALA 或 ABA 處理沒(méi)有明顯響應(yīng) 這些 結(jié)果暗示 ALA 緩解 ABA 引起的草莓根系生長(zhǎng)抑制效應(yīng)與 ABA 合成 代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)沒(méi)有直接 關(guān)系 圖 3 外源 ABA 和 ALA 處理對(duì)草莓根尖脫落酸信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 Fig 3 Effects of ABA and ALA treatments on the gene expressions related to ABA signal in the root tips of strawberry 如圖 4 所示 IAA 合成關(guān)鍵基因 YUC1 的表達(dá)對(duì) ABA 和 或 ALA 處理沒(méi)有明顯反應(yīng) ABA 處理導(dǎo)致 YUC2 和 YUC3 表達(dá)下調(diào) 但 ALA 處理沒(méi)有緩解 ABA 誘導(dǎo)的基因表達(dá)下調(diào)效應(yīng) 說(shuō)明 IAA 合成關(guān)鍵酶基因可能不參與 ALA 和 ABA 調(diào)控的草莓根系生長(zhǎng)過(guò)程 類似地 IAA 向內(nèi)運(yùn)輸關(guān)鍵基 因 AUX1 表達(dá)水平因 ABA 處理而顯著下調(diào) ALA 處理對(duì)此不具緩解效應(yīng) 說(shuō)明 IAA 輸入蛋白基因 可能也不涉及 ALA 與 ABA 調(diào)控的草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng) 相反 PIN1 表達(dá)水平對(duì) ALA 和 ABA 有不 同響應(yīng) ABA 處理后草莓根尖 PIN1 表達(dá)量只有對(duì)照的 32 5 而 ABA ALA 處理比 ABA 單獨(dú)處 理高 113 說(shuō)明 ALA 能夠緩解 ABA 誘導(dǎo)的草莓根尖 PIN1 下調(diào) 因此推測(cè) ALA 緩解 ABA 抑制 草莓根系生長(zhǎng)的效應(yīng)可能與其促進(jìn)根尖細(xì)胞 IAA 向外運(yùn)輸?shù)鞍谆?PIN1 表達(dá)上調(diào)有關(guān) 圖 4 外源 ABA 和 ALA 處理對(duì)草莓根尖生長(zhǎng)素合成運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 Fig 4 Effects of ABA and ALA treatments on the gene expressions related to IAA biosynthesis and transport in the root tips of strawberry Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 468 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 2 4 ALA 緩解 ABA 抑制擬南芥根尖 IAA 極性運(yùn)輸效應(yīng) 由于 ALA 和 ABA 調(diào)控草莓根系生長(zhǎng)可能是通過(guò)影響 IAA 極性運(yùn)輸來(lái)實(shí)現(xiàn) 借助攜帶綠色熒光 蛋白基因 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系觀測(cè) ALA 和 或 ABA 對(duì) IAA 信號(hào)的影響 外源 ABA 處理后 IAA 輸出蛋白 PIN1 熒光強(qiáng)度下降至對(duì)照的 42 若 添加 ALA 則熒光強(qiáng)度恢復(fù)至對(duì)照的 86 圖 5 A D 說(shuō)明 ALA 具有拮抗 ABA 誘導(dǎo)擬南芥 PIN1 表達(dá)下調(diào)的能力 相反 IAA 輸出蛋白 PIN2 的熒光強(qiáng)度沒(méi)有受到 ABA 和 ALA 處理影響 圖 5 B D IAA 響應(yīng)蛋白 DR5 的熒光豐度經(jīng) ABA 處理下降至對(duì)照的 54 若加入 ALA 則恢復(fù) 到對(duì)照的 83 圖 5 C D 這些結(jié)果說(shuō)明 ABA 抑制擬南芥根系生長(zhǎng)以及 ALA 緩解 ABA 抑制 效應(yīng)可能與 PIN1 蛋白介導(dǎo)的 IAA 極性運(yùn)輸有關(guān) 上述結(jié)果表明 ALA 拮抗 ABA 抑制植物根系生長(zhǎng)效應(yīng)可能經(jīng)由 IAA 輸出蛋白 PIN1 介導(dǎo) 圖 5 ALA 和 或 ABA 處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖 IAA 熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響 A C 攜帶綠色熒光蛋白的 PIN1 PIN2 和 DR5 轉(zhuǎn)基因植株根尖熒光照片 上 和與明場(chǎng)合并后的照片 下 D 相對(duì)熒光強(qiáng)度 Fig 5 Effects of ALA and or ABA on auxin fluorescence signal intensity in the root tips of Arabidopsis A C are PIN1 PIN2 and DR5 transgenic plants carried with green fluorescence protein gene GFP The upper half is the fluorescence image while the down half is the merged image with bright field D is the relative fluorescence intensity of GFP related with IAA in three transgenic plants after treatments 2 5 FaPIN1 的生物信息和亞細(xì)胞定位及系統(tǒng)進(jìn)化分析 根據(jù)草莓基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè) FaPIN1 蛋白結(jié)構(gòu) 發(fā)現(xiàn)其 N 端有 5 個(gè)跨膜區(qū) C 端有 4 個(gè)跨膜區(qū) 圖 6 A 推測(cè)其為一種跨膜蛋白 利用本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)證明 FaPIN1 主要分布于細(xì)胞膜 35S 驅(qū) 動(dòng) GFP 在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)沒(méi)有特異性 而 35S 驅(qū)動(dòng) PIN GFP 融合蛋白表達(dá)僅出現(xiàn)在細(xì)胞膜區(qū) 域 圖 6 B 說(shuō)明草莓 FaPIN1 為膜蛋白 饒智雄 安玉艷 曹榮祥 唐 泉 汪良駒 外源 ALA 緩解 ABA 抑制草莓根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的機(jī)理研究 園藝學(xué)報(bào) 2023 50 3 461 474 469 圖 6 草莓 FaPIN1 跨膜區(qū)預(yù)測(cè) A 和亞細(xì)胞定位 B A 中藍(lán)色的長(zhǎng)方形表示位于 FaPIN1 蛋白兩端的跨膜結(jié)構(gòu)域 Fig 6 Prediction of the transmembrane r