第 37 卷第 8 期 2017 年 8 月 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報 Acta Scientiae Circumstantiae Vol 37 No 8 Aug 2017 基金項目 國家自然科學(xué)基金 No 21377074 Supported by the National Natural Science Foundation of China No 21377074 作者簡介 王秋雙 1991 女 E mail wangqiushuang0627 163 com 通訊作者 責(zé)任作者 E mail chengliang li11 163 com Biography WANG Qiushuang 1991 female E mail wangqiushuang0627 163 com Corresponding author E mail chengliang li11 163 com DOI 10 13671 j hjkxxb 2017 0013 王秋雙 戚興超 申天琳 等 2017 納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的影響 J 環(huán)境科學(xué)學(xué)報 37 8 3149 3157 Wang Q S Qi X C Shen T L et al 2017 Effect of silver nanoparticles and graphene on soil microorganisms and enzyme activities J Acta Scientiae Circumstantiae 37 8 3149 3157 納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的影響 王秋雙 戚興超 申天琳 李成亮 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 土肥資源高效利用國家工程實驗室 泰安 271018 收稿日期 2016 12 02 修回日期 2017 01 04 錄用日期 2017 01 09 摘要 采用室內(nèi)暗培養(yǎng)試驗分別探究了納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的不同影響 將不同劑量的納米銀 0 10 100 150 mg kg 1 與 高純石墨烯 0 10 100 1000 mg kg 1 分別與等量棕壤充分混勻 然后進(jìn)行暗培養(yǎng) 在第 3 7 15 30 和 60 d 時取樣 測定土壤脲酶 土壤堿性磷 酸酶 土壤脫氫酶和土壤過氧化氫酶的活性及土壤細(xì)菌 真菌和放線菌的數(shù)量 并在培養(yǎng)期間測定土壤呼吸速率及 CO 2 累積量 結(jié)果表明 所有 納米銀處理均抑制土壤的呼吸作用 并且劑量越高 抑制作用越明顯 而石墨烯處理未對土壤呼吸產(chǎn)生顯著影響 10 mg kg 1 納米銀處理下 土 壤真菌數(shù)量在整個培養(yǎng)期內(nèi)均顯著低于對照 土壤細(xì)菌在第 60 d 時也被顯著抑制 但土壤放線菌數(shù)量無變化 與對照相比 100 和 150 mg kg 1 的納米銀處理顯著降低了土壤細(xì)菌 真菌 放線菌的數(shù)量 10 和 100 mg kg 1 的石墨烯處理下 土壤細(xì)菌 真菌 放線菌數(shù)量則均無顯著變化 1000 mg kg 1 的石墨烯顯著增加了土壤中細(xì)菌與真菌的數(shù)量 卻對土壤放線菌數(shù)量無影響 納米銀處理顯著抑制土壤脲酶 脫氫酶活性 卻對土 壤過氧化氫酶與磷酸酶活性基本無影響 10 和 100 mg kg 1 石墨烯處理對土壤脲酶有一定的促進(jìn)作用 1000 mg kg 1 石墨烯處理對土壤過氧化 氫酶和脫氫酶有一定的促進(jìn)作用 而不同劑量的石墨烯在培養(yǎng)后期均對堿性磷酸酶產(chǎn)生抑制作用 總體來說 納米銀在一定程度上對土壤酶及 土壤微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了負(fù)面影響 而石墨烯對土壤酶及土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響不明顯 關(guān)鍵詞 納米銀 石墨烯 土壤呼吸 微生物數(shù)量 土壤酶 文章編號 0253 2468 2017 08 3149 09 中圖分類號 X53 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Effect of silver nanoparticles and graphene on soil microorganisms and enzyme activities WANG Qiushuang QI Xingchao SHEN Tianlin LI Chengliang National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer esources College of esources and Environment Shandong Agricultural University Tai an 271018 eceived 2 December 2016 received in revised form 4 January 2017 accepted 9 January 2017 Abstract The influence of silver nanoparticles AgNPs and graphene on soil microbes has drawn more and more attention now In this work an incubation experiment was conducted to investigate the effect of AgNPs 0 10 100 150 mg kg 1 soil and graphene 0 10 100 1000 mg kg 1 soil on soil microorganisms and enzyme activities Soil respiration and accumulation amount of CO 2 were measured throughout the incubation period Meanwhile the microbial numbers bacteria fungi and actinomycetes and the enzyme activities urease alkaline phosphatase catalase and dehydrogenase in soil were evaluated at 3 rd 7 th 15 th 30 th and 60 th day The results showed that the soil respiration was significantly inhibited only by AgNPs and the different degree of inhibition depends on the concentration of AgNPs In comparison to control treatment the amounts of soil fungi and bacteria were inhibited by 10 mg kg 1 AgNPs in different degree When the AgNPs concentration was over 100 mg kg 1 in soil all the soil microbial numbers were significantly decreased However the graphene had no significant impact on the number of soil microorganisms at low concentration 100 mg kg 1 soil but could stimulate the soil bacteria and fungi at high concentration 1000 mg kg 1 soil Further investigation showed that the AgNPs pronouncedly inhibited the soil urease and dehydrogenase activities but had no effect on soil catalase and alkaline phosphatase activities However the graphene had different effects on these soil enzymes compared to that of AgNPs It promoted the soil urease catalase and dehydrogenase activities 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報 37 卷 Instead the soil alkaline phosphatase activity was inhibited by graphene at the later incubation stage Findings from this work indicated that the AgNPs had a negative influence on the soil enzymes and microbial structure to some extent but the graphene had little effect on them Keywords AgNPs graphene soil respiration microbial number soil enzyme 1 引言 Introduction 由于納米材料表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)異特性 已經(jīng)被 成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 藥學(xué) 化學(xué)及生物檢測 制造業(yè)以 及國防科技等諸多領(lǐng)域 文玉華等 2001 納米材 料的生產(chǎn)及使用量也隨之迅速增加 納米材料種類 豐富 其中 納米銀與石墨烯的應(yīng)用尤為廣泛 納米 銀是最常見的納米工程顆粒之一 因具有廣譜抗菌 特征使其在抗菌劑方面具有非常重要的應(yīng)用 Morones et al 2005 石墨烯具有優(yōu)良的導(dǎo)電 導(dǎo) 熱性能及獨(dú)特的光學(xué)性能 這些性質(zhì)使得石墨烯在 能源 材料 電力等領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力 Novoselov et al 2012 在納米銀及石墨烯的生產(chǎn) 使用過程中 必然會通過各種途徑進(jìn)入到土壤中 從而對土壤生態(tài)環(huán)境造成影響 Dinesh et al 2012 據(jù)報道 納米銀可以通過擾亂細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu) 使膜的通透性發(fā)生改變 大量新陳代謝所必需的物 質(zhì)泄漏 從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡 Morones et al 2005 納米銀也可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與 DNA 結(jié)合干擾 其復(fù)制功能從而殺死格蘭氏陰性菌 謝小保等 2008 另外 納米銀能夠使細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧 OS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng) Hussain et al 2005 損害細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體 抑制細(xì)胞內(nèi)的代謝 Shrivastava et al 2007 從而殺死菌體 也有研究 表明 石墨烯對大腸桿菌的生理代謝具有一定的毒 性作用 能夠抑制大腸桿菌生長 Ahmed et al 2013 因此 納米銀與石墨烯進(jìn)入土壤環(huán)境后 勢必 會在一定程度上改變土壤微生物數(shù)量及結(jié)構(gòu) 甚至 會殺死微生物 影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定 土壤生態(tài)系統(tǒng)可通過分子生態(tài)學(xué)方法 生物標(biāo) 志物測定法 平板培養(yǎng)法 酶活測定法 代謝測定法 等多種方法評價 其中 土壤呼吸測定 平板培養(yǎng)法 與酶活測定法具有快速 簡潔 重復(fù)性高等特點(diǎn) 可 以直觀地反映出土壤微生物活性的高低 土壤微生 物功能的變化 萬忠梅等 2009 及土壤生態(tài)系統(tǒng)的 元素循環(huán) 是評價土壤生態(tài)環(huán)境的重要生物指標(biāo) 土 壤呼吸的強(qiáng)弱與土壤中微生物的活性有著密切的 聯(lián)系 可直接揭示土壤中納米材料與土壤環(huán)境之間 的關(guān)系 平板培養(yǎng)法可以有效地指示土壤中可培養(yǎng) 細(xì)菌 真菌與放線菌數(shù)量的變化 土壤酶活測定主要 包括 土壤堿性磷酸酶 它能夠催化有機(jī)磷酸成 無機(jī)磷酸鹽 在有機(jī)磷的礦化及其生物有效性上具 有重要作用 劉善江等 2011 脲酶 具有水解尿 素的作用 與氮的吸收和代謝循環(huán)有關(guān) Sukul 2006 脫氫酶 其活性是評價土壤微生物氧化能 力的指標(biāo) Fern ndez et al 2005 auch Williams et al 2006 土壤過氧化氫酶 可以促進(jìn)過氧化 氫的分解 防止過氧化氫對微生物體的毒害作用 曾憲軍等 2005 如上所述 之前的研究大多基于純菌試驗來研 究納米顆粒的毒性 而對于納米顆粒進(jìn)入土壤后對 微生物影響的研究相對較少 因此 綜合探討納米 材料在復(fù)雜的土壤環(huán)境中對微生物造成的影響是 很有必要的 本試驗通過室內(nèi)培養(yǎng) 研究納米銀及石 墨烯對土壤微生物數(shù)量 土壤呼吸和土壤酶活性的 影響 以期為評估納米銀和石墨烯的環(huán)境風(fēng)險提供 一定的依據(jù) 2 材料與方法 Materials and methods 2 1 供試材料 納米銀溶液 AGS WM5000 購自上海滬正納米 科技有限公司 黃褐色 平均粒徑約 15 nm 銀純度 為 99 99 高純石墨烯購自中國科學(xué)院成都有機(jī)化 學(xué)有限公司 黑色粉末 純度 98 厚度為 1 3 nm 尺寸為 2 10 m 層數(shù) 3 層 比表面積為 345 27 m 2 g 1 土壤樣品采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國家緩控釋肥工 程技術(shù)研究中心試驗基地 土壤類型為棕壤 采樣 深度為 0 20 cm 新鮮的土壤樣品帶回實驗室 風(fēng) 干 用鑷子剔除植物殘體 較大的土壤動物殘骸及 石頭等 充分混合后過 2 mm 篩 備用 供試土壤的基 本理化性質(zhì)見表 1 0513 8 期 王秋雙等 納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的影響 表 1 供試土壤的基本理化性質(zhì) Table 1 Basic physical and chemical properties of experimental soil pH 電導(dǎo)率 S cm 1 有機(jī)質(zhì) g kg 1 有效磷 mg kg 1 速效鉀 mg kg 1 氨態(tài)氮 mg kg 1 硝態(tài)氮 mg kg 1 7 9 191 23 11 83 25 53 69 43 45 65 28 66 2 2 試驗設(shè)計 本試驗以之前的研究結(jié)果為依據(jù) Boxall et al 2007 Blaser et al 2008 McGillicuddy et al 2017 土壤樣品中納米銀和石墨烯粉末施用的劑 量分別為 10 100 150 mg kg 1 和 10 100 1000 mg kg 1 以不使用任何納米材料的土壤樣品為對照 處理 共計 7 個處理 每個處理重復(fù) 3 次 首先將土壤樣品置于 25 恒溫恒濕培養(yǎng)箱溫 育 1 周 以穩(wěn)定土壤中的微生物活性 培養(yǎng)期間用稱 重法調(diào)節(jié)土壤含水量 使其保持一致 溫育結(jié)束后 稱取 550 g 土壤樣品裝于已滅菌的 1000 mL 塑料瓶 中 將不同劑量的納米銀液體均勻混合于土壤中 使其最終含量達(dá)到 0 10 100 150 mg kg 1 具體添 加方法 將土壤均勻地鋪在塑料布上 用小塑料噴 壺 容積為 50 mL 將納米銀液體均勻地噴灑在土壤 表面至土壤濕潤 抖動塑料布邊角使土壤混勻 再 將土壤均勻地鋪在塑料布上后均勻噴灑納米銀溶 液 如此重復(fù)多次 直到將納米銀溶液全部混合于 土壤中 同樣 稱取 550 g 土壤樣品 將不同質(zhì)量的高 純石墨烯粉末均勻混合于土壤中 使其最終含量達(dá) 到 0 10 100 1000 mg kg 1 具體添加方法 把土壤 裝在密封良好的塑料袋中 將一部分石墨烯固體粉 末加入土壤中 不斷顛倒塑料袋混勻 繼續(xù)按此方 法重復(fù)多次 直至將石墨烯粉末全部均勻混合于土 壤中為止 調(diào)節(jié)含水量至土壤最大持水量的 60 置 于 25 恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng) 為了保持瓶 內(nèi)的濕度 在瓶內(nèi)懸掛裝有 5 mL 無菌水的 10 mL 小 瓶 分別在第 3 7 15 30 和 60 d 時取土樣 2 3 土壤呼吸測定 土壤呼吸的測定采用 CO 2 吸收法 李振高等 2008 Li et al 2012 在上述 1000 mL 塑料瓶中懸 掛裝有 5 mL 0 8 mol L 1 NaOH 溶液的吸收瓶 不能 與土壤樣品接觸 分別在第 1 3 5 7 15 22 30 37 和 60 d 取出吸收瓶 將吸收瓶中的 NaOH 溶液迅速 轉(zhuǎn)移至滴定三角瓶內(nèi) 加 2 mL 過量 氯化鋇溶液和 2 滴酚酞指示劑 用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至紅色消失 并根據(jù)消耗鹽酸的體積計算出土壤的呼吸強(qiáng)度與 CO 2 累積量 2 4 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測定 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定采用稀釋平板 培養(yǎng)計數(shù)法 李振高等 2008 細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏 蛋白胨培養(yǎng)基 真菌培養(yǎng)采用馬丁孟加拉紅 鏈霉素 培養(yǎng)基 放線菌培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基 微生物數(shù) 量用每克土樣中的菌落數(shù)表示 2 5 土壤酶活性測定 土壤脲酶的測定采用苯酚鈉 次氯酸鈉比色法 李振高等 2008 其活性以每克土壤 24 h 酶解尿 素產(chǎn)生銨態(tài)氮 NH 4 N 的量 mg 來表示 土壤堿性 磷酸酶的測定采用磷酸苯二鈉比色法 李振高等 2008 其活性以每克土壤 24 h 釋放的酚量 mg 來 表示 土壤脫氫酶的測定采用 TTC 還原法 戴濡伊 等 2013 其活性以每克土 24 h 生成的 TPF 表示 土壤過氧化氫酶的測定采用高錳酸鉀滴定法 李振 高等 2008 其活性以每克土 20 min 分解 H 2 O 2 的 量 mg 表示 2 6 數(shù)據(jù)處理與分析 利用 Excel 2007 處理試驗數(shù)據(jù) 利用 SAS 8 0 進(jìn)行差異顯著性檢驗 p 0 05 采用 Origin 8 5 繪圖 3 結(jié)果與分析 esults and analysis 3 1 納米銀和石墨烯對土壤呼吸的影響 在整個培育周期內(nèi) 不同劑量納米銀處理組的 土壤呼吸強(qiáng)度 以 CO 2 計 均小于對照組 且隨著納 米銀添加量的增大而減小 圖 1 對照組的土壤呼 吸強(qiáng)度隨著培養(yǎng)時間的延長不斷降低 可能是由于 營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗造成的 10 mg kg 1 納米銀處理 在前 5 d 內(nèi)土壤呼吸強(qiáng)度逐漸增加 之后逐漸變?nèi)?100 mg kg 1 納米銀處理的土壤呼吸強(qiáng)度變化趨勢 與 10 mg kg 1 處理類似 但其強(qiáng)度較 10 mg kg 1 處 理更低 與 10 和 100 mg kg 1 處理不同 經(jīng) 150 mg kg 1 納米銀處理后 土壤的呼吸強(qiáng)度在整個培養(yǎng) 期內(nèi)基本上一直處于被抑制的狀態(tài) 只是在 3 5 d 內(nèi)出現(xiàn)了小幅度的恢復(fù) 經(jīng)不同劑量的石墨烯處理 后 土壤呼吸強(qiáng)度與對照處理之間及各個處理組之 1513 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報 37 卷 間均未出現(xiàn)明顯差異 圖 1 圖 1 不同納米銀 a 及石墨烯 b 處理條件下土壤呼吸強(qiáng)度的變化 Fig 1 Soil respiration rate changes under different AgNPs a and graphene b concentrations 無論是添加納米銀還是石墨烯 在整個培養(yǎng)過 程中 CO 2 累積量的變化都與土壤呼吸強(qiáng)度的變化一 致 圖 2 納米銀處理的 CO 2 累積量均顯著小于對 照處理 p 0 05 且納米銀的添加量越大 CO 2 累積 量越少 添加不同劑量的高純石墨烯后 處理組與對 照組之間及各處理組之間的 CO 2 累積量沒有出現(xiàn) 差異 圖 2 不同納米銀 a 及石墨烯 b 處理條件下 CO 2 累積量的變化 Fig 2 Cumulative amounts of CO 2 changes under different AgNPs a and graphene b concentrations 3 2 納米銀與石墨烯對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的 影響 納米銀與石墨烯對都會對土壤可培養(yǎng)微生物 數(shù)量產(chǎn)生不同程度的影響 圖 3 在納米銀處理后 第 3 d 10 mg kg 1 處理的土壤細(xì)菌菌落數(shù)較對照處 理顯著增加 p 0 05 在第 60 d 時納米銀處理的細(xì) 菌菌落數(shù)顯著低于對照處理 但在第 7 15 30 d 二 者間差異不顯著 當(dāng)納米銀添加劑量為 100 和 150 mg kg 1 時 土壤細(xì)菌數(shù)量在整個培養(yǎng)期內(nèi)均顯著低 于對照處理 p 0 05 且 150 mg kg 1 處理顯著低于 100 mg kg 1 處理 相對于土壤細(xì)菌 土壤真菌對于納 米銀更敏感 當(dāng)土壤中納米銀劑量達(dá)到 10 mg kg 1 時 除培養(yǎng)時間為 15 d 之外 處理組的土壤真菌菌 落數(shù)顯著低于對照處理 當(dāng)納米銀劑量高于 100 mg kg 1 時 土壤真菌數(shù)量顯著低于對照處理與 10 mg kg 1 處理組 但兩者之間差異不顯著 高劑量 100 150 mg kg 1 納米銀顯著抑制土壤放線菌活 性 但低劑量 10 mg kg 1 納米銀對土壤放線菌菌 落數(shù)影響不大 在第 3 d 時 石墨烯處理的土壤細(xì)菌都被抑制 2513 8 期 王秋雙等 納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的影響 其中 10 100 mg kg 1 處理組與對照處理差異顯著 p 0 05 1000 mg kg 1 處理組與對照處理差異不 顯著 隨著時間的延長土壤細(xì)菌數(shù)量恢復(fù)且高于對 照組 以 100 mg kg 1 處理組最為明顯 整個培養(yǎng)期 間 與對照處理相比 10 與 100 mg kg 1 處理土壤真 菌的菌落數(shù)均無顯著差異 但當(dāng)石墨烯劑量為 1000 mg kg 1 時 除培養(yǎng)時間為 7 d 外 土壤真菌數(shù) 量均顯著高于對照處理 p 0 05 石墨烯對土壤放 線菌的數(shù)量未產(chǎn)生任何影響 圖 3 圖 3 不同納米銀及石墨烯處理條件下土壤微生物數(shù)量變化 柱上不同的小寫字母表示差異顯著 p 0 05 Fig 3 Soil microbial quantity changes under different AgNPs and graphene concentrations 3 3 納米銀和石墨烯對土壤酶活性的影響 添加不同劑量納米銀對土壤酶活性產(chǎn)生不同 程度的影響 圖 4 在整個培育期內(nèi) 納米銀處理土 壤脲酶活性均顯著低于對照處理 p 0 05 圖 4a 其中 100 和 150 mg kg 1 納米銀處理土壤脲酶活性 接近 且 除 培 養(yǎng) 時 間 為 30 d 外 均 顯 著 低 于 10 mg kg 1 處理 p 0 05 納米銀處理土壤脫氫酶 活性的變化趨勢 圖 4b 與脲酶類似 與對照組相 比 納米銀處理對土壤脫氫酶的活性均呈現(xiàn)顯著抑 制作用 而對于土壤堿性磷酸酶而言 雖然隨著納米 3513 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報 37 卷 銀劑量的增加 堿性磷酸酶活性均在一定程度上被 抑制 但除了 15 d 外 納米銀處理與對照處理之間 酶活性的差異均不顯著 圖 4c 不同劑量納米銀處 理的土壤過氧化氫酶活性基本上呈現(xiàn)先激活后抑 制的趨勢 圖 4d 在培養(yǎng)第 3 d 時 與對照組相比 納米銀處理土壤過氧化氫酶活性均被激活 尤其是 添加劑量為 150 mg kg 1 處理組的激活作用最為顯 著 到了第 7 d 10 mg kg 1 納米銀處理的土壤過氧 化氫酶活性仍處于被激活狀態(tài) 但 100 與 150 mg kg 1 納米銀處理的土壤過氧化氫酶活性與對照 處理無顯著差異 試驗后期各處理組與對照組的土 壤過氧化氫酶活性無差異 不同劑量的石墨烯處理下 土壤酶活性發(fā)生的 變化不同 圖 5 石墨烯污染土壤后 隨著培養(yǎng)時間 的延長土壤脲酶活性先降低后升高 圖 5a 石墨烯 添加量為 10和 100mg kg 1 時 土壤脲酶活性在 圖 4 不同納米銀處理條件下土壤酶活性變化 a 脲酶 b 脫氫酶 c 堿性磷酸酶 d 過氧化氫酶 Fig 4 Soil enzyme activitiesunder AgNPs different concentrations a urease b dehydrogenase c alkalinephosphatase d catalase 4513 8 期 王秋雙等 納米銀與石墨烯對土壤微生物及土壤酶的影響 圖 5 不同石墨烯處理條件下土壤酶活性變化 a 脲酶 b 堿性磷酸酶 c 過氧化氫酶 d 脫氫酶 Fig 5 Soil enzyme activities with graphene different concentrations a urease b alkalinephosphatase c catalase d dehydrogenase 第 3 15 d 顯著高于對照處理 而石墨烯添加劑量為 1000 mg kg 1 時 脲酶活性在整個培育周期內(nèi)均與 對照處理的差異不顯著 在培養(yǎng)的前 15 d 內(nèi) 石墨 烯處理土壤堿性磷酸酶活性較對照處理均出現(xiàn)明 顯變化 在 30 d 之后則顯著下降 但總體上 10 100 1000 mg kg 1 處理組三者之間差異不顯著 圖 5b 在培養(yǎng)的第 3 d 1000 mg kg 1 石墨烯處理使土壤過 氧化氫酶活性明顯增加 但培養(yǎng)時間增長之后 土 壤過氧化氫酶活性的變化與石墨烯劑量無關(guān) 圖 5c 土壤脫氫酶活性的變化趨勢 圖 5d 與脲酶的 相似 僅在第 15 d 時 1000 mg kg 1 石墨烯激活效應(yīng) 顯著 土壤脫氫酶活性顯著 p 0 05 高于對照處理 和 10 mg kg 1 處理 其余時間點(diǎn) 石墨烯處理較對照 處理均無顯著性差異 4 討論 Discussion 4 1 納米銀及石墨烯對土壤呼吸的影響 通過測定土壤呼吸速率與 CO 2 累積量來監(jiān)測人 工化學(xué)材料對土壤有氧活動的影響 Jones et al 2001 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于土壤污染物的研究中 Kaufmann et al 2006 本試驗利用土壤基礎(chǔ)呼吸 測量研究不同劑量的納米材料對土壤微生物活動 的整體影響 發(fā)現(xiàn)納米銀處理均對土壤呼吸速率與 CO 2 累積量產(chǎn)生抑制 且隨添加量的增加抑制越明 顯 10 mg kg 1 納米銀處理組在培養(yǎng)初期 呼吸強(qiáng)度 逐漸增加 這可能是因為在納米銀脅迫下 土壤微 生物需要不斷增強(qiáng)其活性以抵消納米銀的毒性 從 而導(dǎo)致了呼吸強(qiáng)度的增加 100 mg kg 1 納米銀處理 后 土壤的呼吸強(qiáng)度變化趨勢與 10 mg kg 1 處理組 接近 卻明顯低于對照組及 100 mg kg 1 納米銀處理 組 說明 100 mg kg 1 納米銀對土壤呼吸的抑制作用 比 10 mg kg 1 處理組要大 土壤微生物活性明顯降 低 土壤中添加 150 mg kg 1 納米銀后 土壤呼吸強(qiáng) 度受抑制最為明顯 說明納米銀的添加量越高 對 土壤呼吸的抑制作用越強(qiáng) ahmatpour 等 2017 研 究了納米銀對石灰質(zhì)土壤呼吸的影響 發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤 中納米銀含量較高 20 mg kg 1 時 土壤呼吸被明 顯抑 制 且劑量越高抑制作用越大 Schlich 等 2013 研究發(fā)現(xiàn) 納米銀會顯著抑制污泥中的微生 物的基礎(chǔ)呼吸作用 這都與本研究結(jié)果一致 相反 石墨烯在任何劑量下都沒有對土壤基礎(chǔ)呼吸產(chǎn)生 實質(zhì)性影響 這與賀涔霖等 2012 的研究結(jié)果相 似 Johansen 等 2008 也報道了多壁碳納米管對土 壤呼吸沒有影響 值得注意的是 雖然土壤呼吸并沒 有差異 但并不排除生態(tài)系統(tǒng)過程微生物群落可能 已經(jīng)發(fā)生改變的可能性 只不過改變的微生物群落 可能能夠與原始的類群進(jìn)行功能補(bǔ)償 4 2 納米銀及石墨烯對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的 影響 土壤微生物數(shù)量的變化是指示納米銀與石墨 烯對土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性影響的傳感器 Doran et al 2000 不同劑量的納米銀及石墨烯施入土壤 后 土壤微生物數(shù)量的變化情況可以根據(jù)單位質(zhì)量 土樣中細(xì)菌 真菌 放線菌的菌落數(shù)來判斷 本試驗 結(jié)果表明 不同微生物種類對納米銀的敏感度不 同 10 100 150 mg kg 1 納米銀處理都可以顯著降 低土壤真菌的菌落數(shù) 但低劑量 10 mg kg 1 的納 米銀對土壤細(xì)菌 放線菌的抑制作用不明顯 甚至 還會對土壤細(xì)菌產(chǎn)生促進(jìn)作用 可能是因為低劑量 的納米銀脅迫會刺激一部分土壤細(xì)菌加快生長繁 殖 導(dǎo)致土壤細(xì)菌數(shù)量增加 高 劑 量 100 150 mg kg 1 的納米銀才會顯著抑制土壤細(xì)菌及放線菌 5513 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 報 37 卷 的數(shù)量 Colman 等 2013 發(fā)現(xiàn) 當(dāng)納米銀含量僅為 0 14 mg kg 1 污泥時 污泥中微生物生物量與細(xì)菌群 落組成就會顯著減少 這雖然與研究結(jié)果不盡相 同 但都證明了納米銀可以引起土壤微生物的變 化 可能會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在風(fēng)險 相反 石 墨烯對土壤細(xì)菌 真菌 放線菌抑制作用都不明顯 100 1000 mg kg 1 的石墨烯反而會對土壤細(xì)菌產(chǎn)生 一定的促進(jìn)作用 1000 mg kg 1 的石墨烯也會增加 土壤真菌的數(shù)量 這可能是由于土壤微生物可以以 某種方式抵消石墨烯的毒性 也可能是由于土壤環(huán) 境的復(fù)雜性影響了石墨烯的毒性 但這些都需要進(jìn) 一步的試驗才能深入了解 4 3 納米銀及石墨烯對土壤酶活性的影響 土壤酶的刺激或抑制在某種程度上可以反映 土壤中物質(zhì)和能量循環(huán)的狀態(tài) 此次研究結(jié)果顯示 低劑量 10 mg kg 1 納米銀就可以對土壤脲酶產(chǎn)生 明顯的抑制作用 且納米銀對脲酶活性的抑制作用 存在劑量效應(yīng) 而石墨烯在高劑量 1000 mg kg 1 時才能使脲酶活性在一定程度上降低 但與對照差 異不顯著 所有納米銀處理在第 15 d 時均顯著抑制 土壤堿性磷酸酶活性 1000 mg kg 1 的石墨烯在第 30 和 60 d 時也顯著抑制了土壤堿性磷酸酶活性 這 說明當(dāng)納米銀和石墨烯在土壤中達(dá)到一定含量后 都可能會對土壤中 N P 元素的循環(huán)造成影響 已有 研究發(fā)現(xiàn) 0 14 mg kg 1 的納米銀即可使土壤堿性磷 酸酶活性降低 27 Colman et al 2013 土壤酶活 性對石墨烯響應(yīng)的研究相對較少 大多數(shù)研究者關(guān) 注碳納米管和富勒烯等碳納米材料 其性質(zhì)與石墨 烯類似 據(jù)報道 多壁碳納米管對土壤酸性磷酸酶存 在抑制 Jin 2013 但對土壤脲酶沒有顯著影響 Tong et al 2007 這與本文的研究結(jié)果基本一 致 土壤脫氫酶被證實是對金屬污染最敏感的酶類 之一 Oliveira et al 2006 此外 微生物呼吸作用 和生物量都與脫氫酶活性有關(guān) 所以它可間接反映 微生物的活動和生存能力 Neto et al 2007 本研 究中 與對照相比 10 mg kg 1 納米銀即可在整個培 育期內(nèi)顯著抑制脫氫酶活性 當(dāng)納米銀劑量達(dá)到 100 和 150 mg kg 1 時 抑制效果更明顯 Samarajeewa 等 2016 也曾發(fā)現(xiàn) 脫氫酶 葡糖苷酶對納米銀 敏感性較強(qiáng) 與納米銀相比 石墨烯對土壤脫氫酶的 影響相對較小 只有第 15 d 時 1000 mg kg 1 石墨烯 處理組土壤脫氫酶活性顯著高于對照組 其余均與 對照差異顯著 土壤過氧化氫酶與微生物的數(shù)量和 活性有關(guān) 在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程 的強(qiáng)度 通過試驗發(fā)現(xiàn) 納米銀與石墨烯都只有在培 養(yǎng)前期才會使土壤過氧化氫酶活性顯著增加 可能 是由于土壤微生物受脅迫后產(chǎn)生 OS 導(dǎo)致土壤過 氧化氫酶活性被激活的緣故 5 結(jié)論 Conclusions 1 納米銀可以抑制土壤的呼吸作用 且納米銀 劑量越高 抑制效果越明顯 而石墨烯對土壤呼吸 基本無影響 2 納米銀對不同土壤微生物的毒性存在差異 納米銀對真菌的毒性最大 對細(xì)菌與放線菌的毒性 次之 同一土壤微生物 納米銀的毒性具有劑量效 應(yīng) 劑量越大 抑制越明顯 同一種微生物 納米銀的 毒性還具有時間效應(yīng) 作用時間越長 毒性越大 石 墨烯對不同土壤微生物的影響也有差異 低劑量 10 100 mg kg 1 的石墨烯對土壤微生物無影響 高劑量 1000 mg kg 1 的石墨烯可以顯著增加土壤 中細(xì)菌與真菌的數(shù)量 但對土壤放線菌數(shù)量無影響 3 納米銀與石墨烯污染土壤后 4 種土壤酶活 性均有不同程度的變化 納米銀對土壤脲酶與土壤 脫氫酶活性以抑制作用為主 納米銀僅在第 3 d 7 d 促進(jìn)了土壤過氧化氫酶活性 在第 15 d 時抑制了土 壤堿性磷酸酶活性 石墨烯在不同程度上促進(jìn)土壤 脲酶 土壤過氧化氫酶和土壤脫氫酶活性 并在一 定程度上抑制土壤堿性磷酸酶活性 責(zé)任作者簡介 李成亮 1976 男 教授 主要從事納米材 料的環(huán)境效益研究 E mail chengliang li11 163 com 參考文獻(xiàn) eferences Ahmed F odrigues D F 2013 Investigation of acute effects of graphene oxide on wastewater microbial community A case study J Journal of Hazardous Materials 256 257 1 33 39 Blaser S A Scheringer M Macleod M et al 2008 Estimation of cumulative aquatic exposure and risk due to silver Contribution of 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