南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 收 稿 日 期 基 金 項 目 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目 作 者 簡 介 湯 淑 亞 碩 士 研 究 生 通 信 作 者 蔣 春 號 副 教 授 研 究 方 向 為 植 物 病 害 生 物 防 治 有 益 微 生 物 與 植 物 互 作 分 子 機 制 研 究 與 生 物 農(nóng) 藥 創(chuàng) 制 及 綠 色 植 保 湯 淑 亞 李 子 桀 侯 啟 華 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 湯 淑 亞 李 子 桀 侯 啟 華 郭 堅 華 蔣 春 號 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 生 物 農(nóng) 藥 與 綠 色 植 保 實 驗 室 江 蘇 南 京 摘 要 目 的 本 文 旨 在 探 索 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 的 機 制 為 青 枯 病 的 生 物 防 治 提 供 理 論 依 據(jù) 方 法 通 過 檢 測 預 處 理 后 番 茄 植 株 中 防 御 相 關 基 因 相 對 表 達 量 的 變 化 驗 證 可 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 通 過 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 分 析 探 究 預 處 理 后 番 茄 抗 病 相 關 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平 變 化 篩 選 獲 得 參 與 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 的 相 關 基 因 利 用 證 實 基 因 在 誘 抗 過 程 中 的 差 異 表 達 利 用 技 術 構 建 沉 默 番 茄 植 株 并 開 展 誘 導 番 茄 對 青 枯 菌 抗 性 表 型 驗 證 觀 察 并 統(tǒng) 計 發(fā) 病 率 病 情 指 數(shù) 計 算 防 效 利 用 亞 細 胞 定 位 轉(zhuǎn) 錄 活 性 檢 測 技 術 初 步 分 析 轉(zhuǎn) 錄 因 子 生 化 功 能 結 果 預 處 理 顯 著 促 進 番 茄 植 株 生 長 與 清 水 對 照 相 比 處 理 番 茄 的 株 高 莖 粗 地 上 部 鮮 重 分 別 增 加 了 和 預 處 理 番 茄 可 調(diào) 節(jié) 防 御 基 因 表 達 觸 發(fā) 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 分 析 結 果 顯 示 處 理 引 起 大 量 番 茄 植 株 基 因 表 達 水 平 變 化 篩 選 驗 證 發(fā) 現(xiàn) 其 中 一 個 乙 烯 響 應 因 子 編 碼 基 因 的 表 達 量 被 顯 著 上 調(diào) 深 入 研 究 發(fā) 現(xiàn) 相 對 于 野 生 型 植 株 在 沉 默 番 茄 中 植 株 對 青 枯 病 的 敏 感 性 顯 著 增 強 同 時 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 的 抗 性 表 型 顯 著 下 降 進 一 步 研 究 確 定 是 作 為 一 種 轉(zhuǎn) 錄 因 子 參 與 調(diào) 控 植 物 對 青 枯 菌 抗 病 性 結 論 轉(zhuǎn) 錄 因 子 參 與 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 關 鍵 詞 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 番 茄 青 枯 病 番 茄 轉(zhuǎn) 錄 因 子 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 基 因 功 能 分 析 中 圖 分 類 號 文 獻 標 志 碼 文 章 編 號 第 期 湯 淑 亞 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 番 茄 青 枯 病 是 由 茄 科 勞 爾 氏 菌 引 起 的 一 種 細 菌 性 土 傳 病 害 該 病 害 發(fā) 生 后 難 以 控 制 造 成 番 茄 大 面 積 枯 萎 死 亡 嚴 重 制 約 番 茄 生 產(chǎn) 的 果 實 產(chǎn) 量 和 品 質(zhì) 目 前 傳 統(tǒng) 防 治 措 施 效 果 不 穩(wěn) 定 易 污 染 環(huán) 境 防 效 不 理 想 等 問 題 突 出 生 物 防 治 因 其 環(huán) 保 經(jīng) 濟 安 全 等 優(yōu) 點 受 到 生 產(chǎn) 者 和 研 發(fā) 者 的 青 睞 在 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 中 得 到 了 廣 泛 使 用 據(jù) 報 道 青 枯 病 的 生 物 防 治 措 施 主 要 包 括 植 物 源 活 性 物 質(zhì) 和 微 生 物 菌 劑 的 利 用 其 中 已 報 道 的 微 生 物 菌 劑 主 要 有 無 致 病 力 青 枯 菌 假 單 胞 菌 屬 和 芽 胞 桿 菌 屬 細 菌 其 中 芽 胞 桿 菌 因 其 對 環(huán) 境 友 好 定 殖 能 力 強 貯 藏 期 長 等 特 質(zhì) 成 為 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 中 應 用 最 多 的 生 防 細 菌 之 一 因 此 深 入 解 析 芽 胞 桿 菌 防 治 青 枯 病 的 作 用 機 制 對 青 枯 病 生 物 防 治 技 術 的 廣 泛 應 用 具 有 深 遠 意 義 研 究 表 明 芽 胞 桿 菌 可 通 過 產(chǎn) 生 抗 菌 蛋 白 抗 生 素 等 拮 抗 物 質(zhì) 與 青 枯 菌 競 爭 碳 水 化 合 物 無 機 鹽 等 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 或 通 過 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 性 來 防 治 青 枯 病 植 物 系 統(tǒng) 獲 得 性 抗 性 與 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 是 植 物 體 內(nèi) 種 不 同 的 誘 導 抗 性 前 者 由 植 物 病 原 菌 誘 導 獲 得 后 者 由 非 致 病 根 際 促 生 菌 誘 導 產(chǎn) 生 植 物 系 統(tǒng) 抗 性 的 產(chǎn) 生 是 由 于 的 刺 激 激 活 了 植 物 防 衛(wèi) 反 應 并 通 過 某 種 途 徑 將 這 一 反 應 擴 散 到 植 物 體 其 他 部 位 從 而 抵 御 病 原 菌 侵 染 研 究 發(fā) 現(xiàn) 如 果 植 物 預 先 與 枯 草 芽 胞 桿 菌 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 等 根 際 促 生 菌 接 觸 則 可 誘 導 植 物 的 產(chǎn) 生 從 而 抵 御 青 枯 病 根 結 線 蟲 病 晚 疫 病 等 病 害 的 侵 染 乙 烯 是 誘 導 系 統(tǒng) 中 的 重 要 信 號 分 子 等 發(fā) 現(xiàn) 乙 烯 信 號 突 變 型 植 株 失 去 了 被 熒 光 假 單 胞 桿 菌 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 的 能 力 證 明 機 制 的 建 立 與 乙 烯 信 號 通 路 密 切 相 關 乙 烯 響 應 因 子 是 超 家 族 蛋 白 研 究 表 明 轉(zhuǎn) 錄 因 子 可 調(diào) 控 乙 烯 反 應 基 因 表 達 從 而 調(diào) 節(jié) 乙 烯 的 生 物 合 成 和 信 號 傳 導 但 轉(zhuǎn) 錄 因 子 是 否 參 與 芽 胞 桿 菌 誘 導 的 尚 不 清 楚 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 是 本 課 題 組 前 期 從 森 林 樹 木 根 圍 土 壤 中 分 離 的 一 株 植 物 根 際 促 生 細 菌 菌 株 通 過 誘 發(fā) 植 物 自 身 的 抗 病 潛 能 增 強 植 物 的 抗 病 性 從 而 高 效 防 治 多 種 病 害 前 期 通 過 對 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 防 治 植 物 病 害 的 機 制 進 行 系 統(tǒng) 性 研 究 發(fā) 現(xiàn) 關 鍵 作 用 機 制 是 誘 導 植 物 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 病 性 賀 蟬 等 研 究 表 明 菌 株 激 活 通 路 誘 導 擬 南 芥 對 丁 香 假 單 胞 菌 番 茄 致 病 變 種 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 性 等 研 究 表 明 菌 株 通 過 抑 制 和 激 活 介 導 的 擬 南 芥 基 礎 免 疫 從 而 觸 發(fā) 對 的 系 統(tǒng) 抗 性 本 課 題 組 前 期 研 究 發(fā) 現(xiàn) 菌 株 可 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 抵 御 番 茄 青 枯 病 根 結 線 蟲 病 等 病 害 的 侵 染 但 其 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 對 青 枯 病 的 抗 性 機 制 仍 有 待 研 究 本 研 究 通 過 轉(zhuǎn) 錄 組 學 分 析 技 術 對 調(diào) 控 誘 導 番 茄 對 青 枯 菌 系 統(tǒng) 抗 性 的 關 鍵 基 因 進 行 挖 掘 并 對 鑒 定 出 的 關 鍵 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 生 物 學 功 能 及 生 化 功 能 進 行 研 究 為 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 防 治 青 枯 病 的 生 防 機 制 研 究 奠 定 基 礎 材 料 與 方 法 植 物 及 微 生 物 材 料 番 茄 種 子 經(jīng) 表 面 消 毒 催 芽 后 播 種 于 穴 盤 中 待 番 茄 苗 生 長 至 四 真 葉 期 進 行 移 栽 每 個 盆 缽 種 植 株 移 栽 后 左 右 進 行 試 驗 處 理 培 養(yǎng) 條 件 光 周 期 為 長 日 照 光 照 黑 暗 培 養(yǎng) 時 間 試 驗 菌 株 及 質(zhì) 粒 見 表 生 防 菌 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 在 液 體 培 養(yǎng) 基 配 方 酵 母 浸 粉 胰 蛋 白 胨 中 培 養(yǎng) 所 得 菌 液 于 離 心 用 水 調(diào) 至 備 用 青 枯 菌 在 液 體 培 養(yǎng) 基 配 方 酵 母 浸 粉 蛋 白 胨 葡 萄 糖 中 培 養(yǎng) 所 得 菌 液 于 離 心 用 水 調(diào) 至 備 用 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 表 試 驗 菌 株 及 質(zhì) 粒 菌 株 或 質(zhì) 粒 用 途 來 源 菌 株 生 防 菌 文 獻 基 因 克 隆 的 大 腸 桿 菌 農(nóng) 桿 菌 廣 泛 用 于 植 物 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 實 驗 和 瞬 時 表 達 文 獻 番 茄 青 枯 病 病 原 菌 酵 母 菌 株 構 建 本 實 驗 室 保 藏 質(zhì) 粒 構 建 農(nóng) 桿 菌 載 體 構 建 農(nóng) 桿 菌 載 體 本 實 驗 室 保 藏 構 建 沉 默 的 農(nóng) 桿 菌 載 體 構 建 沉 默 的 農(nóng) 桿 菌 載 體 本 研 究 構 建 轉(zhuǎn) 錄 活 性 測 定 的 酵 母 菌 株 載 體 本 實 驗 室 保 藏 構 建 檢 測 轉(zhuǎn) 錄 活 性 的 酵 母 菌 株 載 體 構 建 檢 測 轉(zhuǎn) 錄 活 性 的 酵 母 菌 株 載 體 構 建 檢 測 轉(zhuǎn) 錄 活 性 的 酵 母 菌 株 載 體 本 研 究 構 建 用 于 檢 測 亞 細 胞 定 位 的 農(nóng) 桿 菌 載 體 本 實 驗 室 保 藏 構 建 檢 測 亞 細 胞 定 位 的 農(nóng) 桿 菌 載 體 本 研 究 番 茄 植 株 生 物 量 的 測 定 選 取 移 栽 后 長 勢 一 致 的 植 株 分 別 向 每 盆 番 茄 根 部 灌 入 菌 液 對 照 組 以 等 體 積 的 清 水 代 替 每 個 處 理 株 次 生 物 學 重 復 處 理 后 用 卷 尺 游 標 卡 尺 以 及 天 平 測 量 番 茄 株 高 莖 粗 地 上 部 鮮 重 沉 默 接 種 及 沉 默 效 率 檢 測 利 用 網(wǎng) 站 進 行 基 因 沉 默 片 段 的 篩 選 與 引 物 設 計 引 物 見 表 以 番 茄 為 模 板 利 用 引 物 進 行 擴 增 擴 增 后 的 片 段 經(jīng) 過 雙 酶 切 后 連 接 到 載 體 上 構 建 重 組 質(zhì) 粒 利 用 電 轉(zhuǎn) 化 的 方 法 將 陰 性 對 照 陽 性 對 照 以 及 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 入 根 癌 農(nóng) 桿 菌 中 利 用 篩 選 培 養(yǎng) 基 及 菌 落 技 術 篩 選 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 使 用 甘 油 保 存 法 將 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 保 存 于 根 癌 農(nóng) 桿 菌 菌 株 在 液 體 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng) 離 心 收 集 菌 體 用 懸 浮 液 調(diào) 整 濃 度 為 然 后 將 重 懸 液 分 別 與 的 重 懸 液 按 體 積 比 混 合 均 勻 混 合 后 的 菌 液 在 常 溫 靜 置 或 振 蕩 用 針 頭 在 番 茄 子 葉 背 面 扎 幾 個 小 孔 用 注 射 器 將 混 合 后 的 菌 液 沿 著 小 孔 注 射 入 番 茄 葉 片 在 陽 性 對 照 沉 默 植 株 出 現(xiàn) 白 化 表 型 后 注 射 后 左 右 每 個 處 理 取 個 重 復 分 別 提 取 并 進 行 反 轉(zhuǎn) 錄 得 到 的 片 段 以 作 為 內(nèi) 參 基 因 采 用 半 定 量 鑒 定 沉 默 植 株 中 基 因 的 表 達 第 期 湯 淑 亞 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 表 引 物 序 列 引 物 引 物 序 列 用 途 引 物 用 于 驗 證 在 處 理 后 及 接 種 青 枯 菌 后 的 表 達 量 變 化 引 物 用 于 驗 證 在 處 理 后 的 表 達 量 變 化 引 物 用 于 驗 證 在 處 理 后 的 表 達 量 變 化 引 物 用 于 檢 測 內(nèi) 參 基 因 表 達 量 構 建 沉 默 載 體 用 于 構 建 沉 默 植 株 檢 測 沉 默 效 率 構 建 載 體 用 于 檢 測 是 否 具 有 轉(zhuǎn) 錄 活 性 構 建 載 體 用 于 檢 測 是 否 具 有 轉(zhuǎn) 錄 活 性 構 建 載 體 用 于 檢 測 是 否 具 有 轉(zhuǎn) 錄 活 性 構 建 載 體 用 于 檢 測 亞 細 胞 定 位 番 茄 青 枯 病 溫 室 防 效 試 驗 設 置 處 理 組 和 清 水 對 照 組 選 擇 移 栽 后 的 番 茄 植 株 每 株 灌 入 菌 液 以 等 體 積 的 清 水 作 為 對 照 每 個 處 理 株 次 生 物 學 重 復 預 處 理 后 向 處 理 組 和 對 照 組 番 茄 根 部 灌 入 青 枯 菌 液 觀 察 并 統(tǒng) 計 各 處 理 番 茄 的 發(fā) 病 情 況 根 據(jù) 植 株 葉 片 萎 蔫 程 度 將 番 茄 青 枯 病 病 害 級 別 分 為 級 級 植 株 正 常 級 植 株 葉 片 萎 蔫 程 度 不 超 過 級 植 株 葉 片 萎 蔫 程 度 超 過 且 不 超 過 級 植 株 葉 片 萎 蔫 程 度 超 過 且 不 超 過 級 植 株 葉 片 萎 蔫 程 度 超 過 發(fā) 病 率 發(fā) 病 株 數(shù) 調(diào) 查 總 株 數(shù) 病 情 指 數(shù) 病 級 數(shù) 該 病 級 植 株 數(shù) 最 大 病 級 數(shù) 植 株 總 株 數(shù) 防 治 效 果 對 照 組 病 情 指 數(shù) 處 理 組 病 情 指 數(shù) 對 照 組 病 情 指 數(shù) 提 取 及 分 析 按 照 及 清 水 預 處 理 時 間 點 或 青 枯 菌 接 種 時 間 點 收 集 番 茄 葉 片 置 于 液 氮 速 凍 每 個 處 理 使 用 株 植 物 的 葉 片 次 生 物 學 重 復 利 用 法 提 取 葉 片 總 使 用 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 和 分 光 光 度 計 檢 測 質(zhì) 量 將 合 格 的 樣 品 送 往 華 大 基 因 公 司 進 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 通 過 生 物 信 息 學 分 析 差 異 表 達 的 基 因 將 預 處 理 的 番 茄 葉 片 總 使 用 試 劑 盒 反 轉(zhuǎn) 錄 為 后 以 作 為 內(nèi) 參 基 因 使 用 引 物 對 表 和 試 劑 盒 進 行 分 析 反 應 體 系 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 前 后 引 物 各 補 齊 至 反 應 程 序 共 個 循 環(huán) 采 用 方 法 計 算 基 因 相 對 表 達 量 亞 細 胞 定 位 分 析 利 用 與 試 劑 盒 構 建 重 組 質(zhì) 粒 將 測 序 正 確 的 重 組 質(zhì) 粒 和 空 載 體 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 入 農(nóng) 桿 菌 利 用 農(nóng) 桿 菌 介 導 的 瞬 時 表 達 系 統(tǒng) 使 用 注 射 器 將 農(nóng) 桿 菌 菌 液 注 入 煙 草 葉 片 中 處 理 后 的 煙 草 黑 暗 培 養(yǎng) 取 樣 制 作 玻 片 使 用 蔡 司 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 觀 察 亞 細 胞 定 位 情 況 具 體 參 照 張 悅 婧 等 的 方 法 進 行 煙 草 葉 片 瞬 時 表 達 轉(zhuǎn) 錄 激 活 活 性 檢 測 為 了 研 究 的 轉(zhuǎn) 錄 激 活 活 性 并 確 定 激 活 域 將 基 因 分 為 部 分 利 用 同 源 重 組 酶 將 全 長 個 片 段 連 接 到 酵 母 表 達 載 體 上 構 建 重 組 質(zhì) 粒 將 測 序 正 確 的 重 組 質(zhì) 粒 和 空 載 體 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 入 酵 母 菌 株 中 使 用 缺 陷 培 養(yǎng) 基 在 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 培 養(yǎng) 挑 取 酵 母 單 菌 落 用 無 菌 水 重 懸 按 照 濃 度 梯 度 進 行 稀 釋 取 菌 液 點 在 與 含 有 的 培 養(yǎng) 基 上 倒 置 培 養(yǎng) 拍 照 記 錄 數(shù) 據(jù) 分 析 使 用 進 行 單 因 素 方 差 分 析 評 估 種 以 上 處 理 的 顯 著 性 采 用 軟 件 進 行 統(tǒng) 計 學 分 析 計 算 標 準 差 和 標 準 誤 并 對 所 有 數(shù) 據(jù) 進 行 檢 驗 圖 對 番 茄 的 促 生 作 用 或 清 水 預 處 理 后 番 茄 生 長 表 型 對 比 處 理 使 用 菌 液 灌 根 番 茄 處 理 使 用 清 水 灌 根 番 茄 或 清 水 預 處 理 后 番 茄 各 項 生 長 指 標 對 比 圖 中 不 同 小 寫 字 母 表 示 在 水 平 差 異 顯 著 下 同 結 果 與 分 析 菌 株 對 番 茄 的 促 生 抗 病 作 用 由 圖 可 見 與 清 水 對 照 組 相 比 處 理 組 中 番 茄 植 株 的 株 高 莖 粗 地 上 部 鮮 重 等 生 長 指 標 均 有 不 同 程 度 的 增 加 預 處 理 對 地 上 部 鮮 重 的 促 進 作 用 最 為 顯 著 與 清 水 預 處 理 相 比 地 上 部 鮮 重 增 加 株 高 和 莖 粗 分 別 增 加 和 表 明 對 番 茄 具 有 促 生 作 用 使 用 清 水 預 處 理 的 番 茄 接 種 后 枝 葉 萎 蔫 明 顯 而 用 預 處 理 再 接 種 的 植 株 大 部 分 枝 葉 仍 處 于 挺 立 狀 態(tài) 圖 發(fā) 病 率 和 病 情 指 數(shù) 與 對 照 相 比 都 顯 著 降 低 防 效 約 為 圖 表 前 期 研 究 表 明 可 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 抵 御 侵 染 第 期 湯 淑 亞 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 為 驗 證 可 通 過 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 防 治 青 枯 病 在 預 處 理 后 提 取 番 茄 葉 片 利 用 檢 測 番 茄 葉 片 中 防 御 基 因 和 的 表 達 量 發(fā) 現(xiàn) 在 預 處 理 后 表 達 量 均 呈 上 升 趨 勢 基 因 表 達 量 先 上 升 后 略 下 降 基 因 表 達 量 先 下 降 后 上 升 圖 和 說 明 可 調(diào) 控 防 御 基 因 的 表 達 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 從 而 降 低 青 枯 病 發(fā) 病 率 圖 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 的 系 統(tǒng) 抗 性 或 清 水 預 處 理 后 番 茄 對 青 枯 病 抗 病 性 表 型 或 清 水 預 處 理 后 青 枯 病 在 番 茄 上 的 病 情 指 數(shù) 或 清 水 預 處 理 后 番 茄 葉 片 中 和 基 因 表 達 量 變 化 列 上 方 的 雙 星 號 表 示 在 水 平 顯 著 差 異 不 同 小 寫 字 母 表 示 在 水 平 差 異 顯 著 表 示 無 顯 著 差 異 下 同 菌 株 影 響 番 茄 基 因 表 達 表 在 野 生 型 番 茄 中 對 番 茄 青 枯 病 的 防 治 效 果 處 理 發(fā) 病 率 防 效 為 探 索 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 的 系 統(tǒng) 抗 性 機 制 取 清 水 和 預 處 理 后 的 番 茄 葉 片 進 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 分 析 篩 選 獲 得 參 與 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 相 關 基 因 結 果 顯 示 處 理 引 起 大 量 番 茄 植 株 基 因 表 達 水 平 變 化 圖 在 預 處 理 后 與 對 照 相 比 引 起 個 基 因 差 異 表 達 其 中 有 個 為 上 調(diào) 基 因 個 為 下 調(diào) 基 因 處 理 后 有 個 基 因 差 異 表 達 其 中 上 調(diào) 基 因 個 下 調(diào) 基 因 個 圖 韋 恩 圖 圖 顯 示 有 個 基 因 在 次 處 理 中 均 差 異 表 達 其 中 乙 烯 響 應 因 子 在 處 理 后 表 達 量 顯 著 上 調(diào) 為 驗 證 基 因 在 誘 抗 過 程 中 的 表 達 量 變 化 提 取 清 水 或 預 處 理 后 的 番 茄 葉 片 反 轉(zhuǎn) 錄 為 使 用 適 量 進 行 結 果 圖 顯 示 基 因 表 達 量 在 預 處 理 后 顯 著 升 高 說 明 在 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 期 間 上 調(diào) 表 達 有 可 能 參 與 誘 導 的 此 外 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在 預 處 理 后 在 接 種 或 未 接 種 青 枯 菌 的 番 茄 植 株 中 相 較 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 于 清 水 對 照 基 因 表 達 量 均 顯 著 上 升 圖 且 接 種 后 相 較 于 未 接 種 植 株 基 因 表 達 量 上 調(diào) 顯 著 因 此 猜 想 可 能 在 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 中 發(fā) 揮 重 要 作 用 圖 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 處 理 番 茄 后 誘 導 相 關 基 因 差 異 性 表 達 或清水預處 理 后 番茄差 異基因表達分 析熱圖 燦圖 和韋恩 圖 紅色表 示上調(diào) 藍色表示 下調(diào) 圖 對 基 因 表 達 量 的 影 響 檢 測 預 處 理 后 的 番 茄 植 株 內(nèi) 基 因 相 對 表 達 量 預 處 理 后 的 番 茄 植 株 接 種 后 檢 測 基 因 相 對 表 達 量 參 與 調(diào) 控 誘 導 的 本 研 究 成 功 構 建 了 沉 默 植 株 圖 通 過 提 取 注 射 菌 株 的 番 茄 植 株 反 轉(zhuǎn) 錄 后 進 行 半 定 量 發(fā) 現(xiàn) 與 注 射 菌 株 的 植 株 相 比 該 處 理 組 植 株 的 表 達 量 明 顯 下 降 圖 說 明 已 成 功 沉 默 表 明 沉 默 植 株 可 用 于 后 續(xù) 試 驗 利 用 基 因 沉 默 技 術 將 基 因 沉 默 后 沉 默 植 株 對 青 枯 病 的 敏 感 性 顯 著 增 強 圖 表 說 明 正 向 調(diào) 控 番 茄 抗 病 性 為 進 一 步 驗 證 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 中 的 作 用 統(tǒng) 計 并 分 析 沉 默 前 后 青 枯 病 發(fā) 病 率 病 情 指 數(shù) 以 及 對 番 茄 青 枯 病 的 防 效 在 基 因 沉 默 后 處 理 組 與 對 照 組 相 比 發(fā) 病 率 沒 有 顯 著 差 異 且 防 效 下 降 說 明 在 沉 默 植 株 中 抗 病 性 下 降 表 明 正 向 調(diào) 控 觸 發(fā) 的 系 統(tǒng) 抗 性 同 時 在 沉 默 后 仍 保 留 部 分 防 效 說 明 生 防 菌 誘 抗 機 制 是 多 樣 的 的 表 達 上 調(diào) 只 是 誘 抗 機 制 中 的 一 種 而 非 全 部 綜 上 轉(zhuǎn) 錄 因 子 可 參 與 調(diào) 控 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 第 期 湯 淑 亞 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 圖 基 因 沉 默 番 茄 植 株 構 建 與 抗 病 性 鑒 定 基 因 沉 默 植 株 表 型 基 因 沉 默 植 株 驗 證 或 清 水 預 處 理 后 青 枯 病 在 野 生 型 番 茄 基 因 沉 默 番 茄 上 的 病 情 指 數(shù) 表 在 野 生 型 番 茄 基 因 沉 默 番 茄 中 對 番 茄 青 枯 病 的 防 治 效 果 處 理 發(fā) 病 率 病 情 指 數(shù) 防 效 圖 蛋 白 的 亞 細 胞 定 位 及 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 活 性 分 析 定 位 于 細 胞 核 且 具 有 轉(zhuǎn) 錄 激 活 活 性 利 用 農(nóng) 桿 菌 介 導 的 瞬 時 表 達 系 統(tǒng) 在 煙 草 中 表 達 通 過 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡 觀 察 的 亞 細 胞 定 位 發(fā) 現(xiàn) 對 照 組 熒 光 分 布 于 整 個 葉 片 細 胞 而 處 理 組 熒 光 僅 定 位 于 細 胞 核 中 圖 說 明 是 一 個 核 蛋 白 此 外 轉(zhuǎn) 入 質(zhì) 粒 的 酵 母 能 夠 在 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 培 養(yǎng) 基 上 正 常 生 長 且 在 含 有 的 平 板 上 變 藍 圖 說 明 轉(zhuǎn) 錄 因 子 具 有 轉(zhuǎn) 錄 激 活 活 性 為 進 一 步 確 定 轉(zhuǎn) 錄 激 活 域 構 建 了 重 組 質(zhì) 粒 并 轉(zhuǎn) 入 酵 母 菌 株 中 圖 所 有 的 酵 母 細 胞 在 培 養(yǎng) 基 上 均 可 正 常 生 長 但 只 有 和 酵 母 菌 可 以 在 培 養(yǎng) 基 上 正 常 生 長 且 在 含 有 的 平 板 上 變 藍 圖 表 明 的 轉(zhuǎn) 錄 激 活 域 位 于 末 端 圖 蛋 白 轉(zhuǎn) 錄 激 活 結 構 域 分 析 用 于 轉(zhuǎn) 錄 激 活 域 分 析 的 結 構 示 意 圖 條 形 上 方 的 數(shù) 字 表 示 氨 基 酸 殘 基 的 位 置 轉(zhuǎn) 錄 激 活 結 構 域 檢 測 討 論 與 結 論 近 年 來 青 枯 病 的 生 物 防 治 在 生 防 菌 的 開 發(fā) 無 致 病 力 青 枯 病 菌 的 篩 選 及 轉(zhuǎn) 基 因 植 物 的 構 建 等 方 面 的 研 究 取 得 較 大 進 展 其 中 生 防 菌 的 合 理 利 用 是 青 枯 病 生 物 防 治 的 重 要 內(nèi) 容 不 僅 達 到 防 治 病 害 的 目 的 而 且 增 強 植 物 對 環(huán) 境 的 適 應 性 促 進 植 物 生 長 用 于 防 治 青 枯 病 的 生 防 菌 包 括 芽 胞 桿 菌 屬 假 單 胞 菌 屬 鏈 霉 菌 屬 等 有 益 微 生 物 其 生 防 機 制 主 要 有 利 用 寄 生 競 爭 抗 生 交 叉 保 護 等 拮 抗 機 制 抑 制 青 枯 病 菌 生 長 或 者 誘 導 植 物 對 青 枯 病 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 性 從 而 降 低 青 枯 病 發(fā) 病 率 目 前 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 的 機 制 各 不 相 同 很 多 菌 株 防 病 的 具 體 作 用 機 制 尚 不 明 確 導 致 菌 劑 在 進 入 實 際 生 產(chǎn) 后 由 于 缺 乏 系 統(tǒng) 的 理 論 依 據(jù) 難 以 在 田 間 發(fā) 揮 穩(wěn) 定 效 果 因 此 為 進 一 步 探 索 青 枯 病 生 防 機 制 本 研 究 采 用 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 為 供 試 生 防 菌 驗 證 得 出 能 促 進 番 茄 生 長 并 誘 導 番 茄 對 青 枯 菌 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 性 從 而 抵 御 青 枯 病 侵 染 根 際 促 生 菌 是 一 類 生 存 于 植 物 根 系 對 植 物 兼 具 促 生 及 抗 病 效 果 的 生 防 菌 研 究 表 明 可 通 過 調(diào) 節(jié) 植 物 防 衛(wèi) 機 制 來 降 低 植 物 病 害 的 發(fā) 生 這 種 抗 病 性 被 稱 為 誘 導 系 統(tǒng) 抗 病 性 近 期 研 究 表 明 解 淀 粉 芽 胞 桿 菌 枯 草 芽 胞 桿 菌 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 等 均 可 誘 導 番 茄 的 產(chǎn) 生 抵 御 青 枯 病 侵 染 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 是 一 種 根 際 促 生 細 菌 可 以 在 擬 南 芥 和 番 茄 上 誘 導 對 的 系 統(tǒng) 性 抗 性 根 際 促 生 菌 誘 導 的 植 物 抗 病 機 制 非 常 復 雜 不 同 的 寄 主 植 物 病 原 菌 組 合 誘 導 植 物 系 統(tǒng) 抗 性 機 制 及 其 所 依 賴 的 信 號 轉(zhuǎn) 導 途 徑 也 不 同 在 以 往 研 究 中 大 多 數(shù) 以 模 式 植 物 擬 南 芥 為 植 物 材 料 研 究 誘 導 抗 病 機 制 對 于 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 機 制 尚 不 明 確 因 此 為 明 晰 誘 導 番 茄 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 抗 性 機 制 本 研 究 利 用 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 對 預 處 理 后 番 茄 相 關 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平 變 化 進 行 分 析 發(fā) 現(xiàn) 個 家 族 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 表 達 量 顯 著 上 調(diào) 而 在 接 種 青 枯 菌 后 其 表 達 量 上 調(diào) 更 顯 著 表 明 在 誘 導 系 統(tǒng) 抗 性 過 程 中 被 顯 著 上 調(diào) 說 明 極 有 可 能 參 與 誘 導 番 茄 系 統(tǒng) 抗 性 過 程 家 族 轉(zhuǎn) 錄 因 子 與 植 物 抗 病 信 號 傳 導 密 切 相 關 亞 家 族 轉(zhuǎn) 錄 因 子 被 證 明 均 在 茉 莉 酸 和 乙 烯 信 號 轉(zhuǎn) 導 中 發(fā) 揮 重 要 調(diào) 控 作 用 熒 光 假 單 胞 菌 通 過 信 號 通 路 并 以 依 賴 的 方 式 在 擬 南 芥 中 觸 發(fā) 表 明 信 號 通 路 在 生 防 菌 誘 導 的 中 發(fā) 揮 著 重 要 調(diào) 節(jié) 作 用 等 發(fā) 現(xiàn) 在 乙 烯 茉 莉 酸 信 號 通 路 缺 失 突 變 體 擬 南 芥 中 對 的 抗 性 下 降 說 明 這 條 信 號 通 路 的 激 發(fā) 均 能 在 一 定 程 度 上 抑 制 病 原 菌 在 植 物 體 內(nèi) 第 期 湯 淑 亞 等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 調(diào) 控 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 作 用 機 制 研 究 的 增 殖 共 同 調(diào) 節(jié) 誘 導 的 系 統(tǒng) 抗 性 等 發(fā) 現(xiàn) 轉(zhuǎn) 錄 因 子 和 可 分 別 通 過 激 活 不 同 信 號 通 路 調(diào) 控 誘 導 從 而 減 少 病 害 發(fā) 生 在 這 種 轉(zhuǎn) 錄 因 子 和 單 突 變 體 中 抗 病 能 力 下 降 能 夠 保 留 部 分 防 效 但 在 雙 突 變 體 植 株 中 則 完 全 喪 失 防 效 表 明 和 在 誘 導 的 中 發(fā) 揮 重 要 調(diào) 控 作 用 且 存 在 功 能 冗 余 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在 沉 默 番 茄 中 處 理 與 清 水 對 照 組 青 枯 病 發(fā) 病 率 沒 有 顯 著 差 異 說 明 沉 默 后 對 青 枯 病 的 抗 病 性 顯 著 下 降 表 明 參 與 調(diào) 控 觸 發(fā) 的 系 統(tǒng) 性 抗 性 揭 示 可 通 過 上 調(diào) 編 碼 基 因 表 達 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 的 系 統(tǒng) 抗 性 機 制 此 外 作 為 亞 家 族 轉(zhuǎn) 錄 因 子 有 可 能 通 過 調(diào) 節(jié) 信 號 傳 導 從 而 調(diào) 控 誘 導 的 而 在 沉 默 后 對 青 枯 病 仍 具 有 顯 著 防 效 說 明 誘 導 的 可 能 不 完 全 依 賴 于 但 我 們 也 無 法 排 除 因 沉 默 技 術 沉 默 基 因 不 完 全 導 致 仍 能 發(fā) 揮 部 分 功 能 的 可 能 性 因 此 后 續(xù) 可 通 過 構 建 過 表 達 植 株 對 表 型 進 一 步 驗 證 前 期 研 究 表 明 家 族 轉(zhuǎn) 錄 因 子 可 參 與 植 物 防 御 反 應 以 應 對 各 種 環(huán) 境 脅 迫 和 病 原 體 例 如 非 生 物 脅 迫 冷 熱 干 旱 鹽 度 滲 透 脅 迫 和 生 物 脅 迫 草 食 性 昆 蟲 和 微 生 物 病 原 體 許 多 研 究 證 明 過 表 達 家 族 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 轉(zhuǎn) 基 因 植 物 可 提 高 對 非 生 物 和 生 物 脅 迫 的 耐 受 性 在 沉 默 番 茄 中 無 論 是 否 進 行 處 理 沉 默 植 株 的 病 情 指 數(shù) 都 顯 著 高 于 野 生 型 植 株 說 明 正 向 調(diào) 控 番 茄 對 青 枯 病 的 抗 性 先 前 的 研 究 表 明 在 應 對 生 物 脅 迫 時 轉(zhuǎn) 錄 因 子 可 通 過 調(diào) 控 防 御 相 關 基 因 的 表 達 激 活 靶 基 因 誘 導 植 物 激 素 反 應 調(diào) 控 程 序 性 細 胞 死 亡 等 途 徑 參 與 植 物 防 御 反 應 因 此 為 了 進 一 步 研 究 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 調(diào) 控 植 物 抗 性 中 的 作 用 本 研 究 對 轉(zhuǎn) 錄 活 性 亞 細 胞 定 位 等 生 化 功 能 進 行 初 步 分 析 結 果 表 明 是 具 有 轉(zhuǎn) 錄 激 活 活 性 的 核 蛋 白 且 轉(zhuǎn) 錄 激 活 域 位 于 端 說 明 其 可 能 作 為 一 個 轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子 參 與 植 物 抗 病 過 程 但 對 于 其 如 何 調(diào) 控 下 游 基 因 表 達 是 否 參 與 調(diào) 節(jié) 信 號 傳 導 還 需 要 進 一 步 研 究 綜 上 所 述 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 誘 導 的 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 依 賴 于 編 碼 基 因 的 上 調(diào) 表 達 同 時 可 作 為 轉(zhuǎn) 錄 因 子 正 向 調(diào) 控 植 物 的 基 礎 抗 性 但 在 誘 導 番 茄 對 青 枯 病 系 統(tǒng) 抗 性 過 程 中 發(fā) 揮 的 具 體 作 用 仍 有 待 后 續(xù) 進 一 步 系 統(tǒng) 研 究 參 考 文 獻 李 林 章 高 天 一 古 斌 權 苗 期 注 射 接 種 法 快 速 鑒 定 番 茄 青 枯 病 抗 性 水 平 的 研 究 蔬 菜 宮 超 黎 振 興 麥 培 婷 等 番 茄 青 枯 病 抗 性 相 關 根 際 微 生 物 的 研 究 進 展 廣 東 農(nóng) 業(yè) 科 學 徐 欣 韻 王 寧 丁 佳 等 番 茄 青 枯 病 拮 抗 菌 的 定 向 篩 選 及 其 抗 病 促 生 機 制 研 究 微 生 物 學 報 賴 寶 春 姚 錦 愛 戴 瑞 卿 等 株 拮 抗 放 線 菌 復 合 防 治 番 茄 青 枯 病 的 研 究 中 國 生 物 防 治 學 報 王 杰 龍 世 芳 王 正 文 等 番 茄 青 枯 病 防 治 研 究 進 展 中 國 蔬 菜 喬 俊 卿 陳 志 誼 梁 雪 杰 等 枯 草 芽 孢 桿 菌 防 治 番 茄 青 枯 病 中 國 生 物 防 治 學 報 朱碧 春 顧 麗 李 正 等 南極土 壤 芽孢桿菌 的分離鑒定 及其防治玉 米細菌性褐 腐病的研究 南 京農(nóng)業(yè)大學 學報 劉 艷 霞 沈 宏 李 想 等 煙 草 青 枯 病 勞 爾 氏 菌 與 拮 抗 菌 對 根 系 分 泌 物 的 競 爭 作 用 微 生 物 學 報 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 張 亮 盛 浩 袁 紅 等 熒 光 假 單 胞 菌 誘 導 番 茄 抗 枯 萎 病 的 研 究 土 壤 吳 躍 開 植 物 促 生 根 圈 細 菌 誘 導 植 物 系 統(tǒng) 抗 性 的 研 究 進 展 中 國 森 林 病 蟲 許 世 達 耿 興 敏 王 露 露 植 物 乙 烯 響 應 因 子 的 結 構 功 能 及 表 達 調(diào) 控 研 究 進 展 浙 江 農(nóng) 林 大 學 學 報 蔣 春 號 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 誘 導 植 物 對 丁 香 假 單 胞 菌 及 南 方 根 結 線 蟲 抗 性 機 理 研 究 南 京 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 賀 嬋 汪 順 娥 郝 海 婷 等 小 介 導 蠟 質(zhì) 芽 胞 桿 菌 激 活 通 路 誘 導 擬 南 芥 系 統(tǒng) 抗 病 性 研 究 植 物 病 理 學 報 方 中 達 植 病 研 究 方 法 版 北 京 中 國 農(nóng) 業(yè) 出 版 社 張 悅 婧 李 穎 王 娟 娟 等 不 同 轉(zhuǎn) 化 條 件 對 種 農(nóng) 桿 菌 基 因 在 本 氏 煙 草 中 瞬 時 表 達 的 影 響 植 物 研 究 陳 雪 代 園 風 余 祥 文 等 煙 草 青 枯 病 生 物 防 治 研 究 進 展 農(nóng) 業(yè) 災 害 研