第39卷第3期 2023年3月 商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào) JOURNAL OF SHANGQIU NORMAL UNIVERSITY Vol 39 No 3 Mar 2023 收稿日期 2021 08 08 修回日期 2021 09 12 基金項(xiàng)目 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目 212102310911 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目 212102110280 作者簡(jiǎn)介 丁錦平 1976 女 河南長(zhǎng)垣縣人 商丘師范學(xué)院副教授 博士 主要從事植物與微生物互做的研究 番茄黃萎病抗性快速鑒定方法探討 丁錦平 侯穎 劉冬梅 宋旸 商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南商丘476000 摘 要 為了找到快速準(zhǔn)確的番茄黃萎病抗性鑒定方法 試驗(yàn)采用時(shí)間和孢子濃度2個(gè)因素 4個(gè)孢子濃度梯 度105孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL 浸泡時(shí)間1 min 3 min 5 min 7 min設(shè)計(jì)正交試驗(yàn) 對(duì)浸泡 葉片法和灌根法進(jìn)行抗性試驗(yàn)對(duì)比 對(duì)12份番茄材料進(jìn)行抗性鑒定 觀察并記錄處理材料的萎蔫程度 研究了浸 泡葉片法與灌根法在番茄抗性鑒定上的一致性 結(jié)果表明 離體接種苗齡為4真葉期 選取第2片真葉進(jìn)行試驗(yàn) 接種濃度為106孢子 mL 室溫 25 條件下 接種3 d即可表現(xiàn)萎蔫癥狀 灌根法選取4片真葉期苗 10 d植株表 現(xiàn)出發(fā)病癥狀 明顯時(shí)間比離體鑒定時(shí)間長(zhǎng) 結(jié)論 利用黃萎菌孢子溶液浸泡葉片法 可以快速 準(zhǔn)確地檢測(cè)番茄的 抗病性強(qiáng)弱 關(guān)鍵詞 番茄 品種 黃萎菌 抗病性 中圖分類號(hào) S432 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1672 3600 2023 03 0040 04 Discussion on rapid identification of tomato against verticillium wilt DING Jinpin HOU Yin LIU Don mei SONG Y n Key Laboratory of Plant Microbe Interactions Sh n qiu Normal University Sh n qiu 476000 China Abstract In order to find a rapid and accurate identification method of tomato verticillium wilt resistance this experiment adopted two factors time and spore concentration four spore concentration gradients of 105 spores mL 106spores mL 107 spores mL and 108 spores ml and orthogonal test was designed for the invasion time of 1min 3min 5min and 7min The resistance test was compared between soaking leaf method and root irrigation method and the resistance identification of 12 tomato materials was carried out The wilting degree of treated materials was observed and recorded The consistency of soaking leaf method and root irrigation method in tomato resistance identification was studied The results showed that the in vitro seedling age was 4 true leaf stage the second true leaf was selected for the experiment and the inoculation concentration was 106 spores ml Under the condition of room temperature 25 4 true leaf stage seedlings were selected by irrigation root method and the plants showed disease symptoms at 10 days which was longer than the in vitro identification time Conclusion The method of impregnating leaves with spore solution of C flaxetifolia can quickly and accurately detect the disease resistance of tomato Key W ords tomato variety verticillium disease resistance 番茄 Solanum lycopersicum 是一種重要的蔬菜作物 是保護(hù)地和露地栽培經(jīng)濟(jì)效益較高的蔬菜之一 番 茄黃萎病是番茄生產(chǎn)的重要病害之一 可大幅度降低番茄的產(chǎn)量和品質(zhì) 是番茄生產(chǎn)的一個(gè)主要限制因素 黃萎病病原 Vertillium dahliae 為半知菌亞門(mén) 淡色孢科 輪枝菌屬 該病具有潛伏侵染和連續(xù)發(fā)作等特點(diǎn) 一旦發(fā)病 無(wú)藥可治 因此 鑒定番茄黃萎病抗性種質(zhì) 培育抗性品種 是防治黃萎病的重要舉措 是今后抗性 育種的重要方向 目前常用的鑒定番茄黃萎病抗性的方法多用灌根法 1 浸根法 2 和田間病圃鑒定法 田間 病圃鑒定法和灌根法所需時(shí)間長(zhǎng)和占據(jù)空間多 不適于大批材料的抗病性鑒定 而且受環(huán)境條件影響較大 常常會(huì)影響鑒定結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性 此外田間病圃鑒定法還受季節(jié)限制 浸根法占地面積小 傷根處理 后 發(fā)病時(shí)間較短 但同樣受環(huán)境的影響較大 由于番茄黃萎病抗性鑒定時(shí)受到的影響因子較多 因此減少?gòu)?處理到發(fā)病中間的環(huán)節(jié) 有利于準(zhǔn)確地鑒定寄主植物對(duì)病原菌的抗性反應(yīng) 3 本研究采用離體葉片 將葉柄浸泡在菌液中 有效地減少了所需時(shí)間和占地面積 同時(shí)也可避免外界環(huán) 境的影響 以灌根接種法作為參比 表明本方法僅用微量的菌液就可快速直觀地檢測(cè)番茄的抗性強(qiáng)弱 大大 縮短了鑒定的時(shí)間 可應(yīng)用于對(duì)番茄種質(zhì)資源抗病性篩選 為番茄保護(hù)地生產(chǎn)地中黃萎病病害防治及番茄抗 黃萎病育種提供理論依據(jù) 也可用于番茄黃萎病的早期檢測(cè) 從而及時(shí)采取預(yù)防措施 有效地減少損失 1 材料與方法 1 1 材 料 菌種 由商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定 番茄品種 抗病性鑒定采用的10個(gè)番茄品種 太空99F1 GBS 改良908 重茬帝龍F(tuán)1 白果強(qiáng)豐 上海 908 寶冠一號(hào)F1 經(jīng)典F1 金盾 粉鉆石 達(dá)利寶 兩個(gè)對(duì)照品種抗病性最強(qiáng)的野生番茄1221 抗病性最弱的 Money Marker MM 1 2 方 法 1 2 1 孢子菌液制備 分生孢子的繁殖方法 采用察氏液體培養(yǎng)基 4 從冷凍保藏菌種平板培養(yǎng)基一側(cè)邊緣打孔器打取直徑 0 4 cm的菌餅 移入察氏100 mL液體培養(yǎng)基中 每瓶移入3個(gè)菌餅 在搖床上28 220 r min條件下震蕩 培養(yǎng)7 10 d 培養(yǎng)基由透明變成乳白色液體 將乳白色液體用雙層紗布過(guò)濾 棄菌絲體保留過(guò)濾液 冷凍離 心機(jī)2000 r min 離心10 min 棄上清液 沉淀即病菌孢子 用無(wú)菌水稀釋孢子 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 配成梯度濃 度為105孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL的懸浮液 1 2 2 離體葉片鑒定法 利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 孢子濃度和侵染時(shí)間2個(gè)因素 4個(gè)水平配制成16個(gè)實(shí)驗(yàn)組合 如表1 待番茄苗 長(zhǎng)至4真葉時(shí) 用滅菌過(guò)的剪刀取同一位置番茄葉片 將葉片洗凈 然后分別插入濃度為105孢子 mL 106孢 子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL的懸浮液中1 min 3 min 5 min 7 min 葉片取出后 將葉柄插入滅菌過(guò)的 培養(yǎng)皿中 培養(yǎng)皿中盛有20 mL清水 以保鮮膜密封 試驗(yàn)過(guò)程中適時(shí)對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行補(bǔ)水 以浸沒(méi)0 2 cm葉 柄為標(biāo)準(zhǔn) 以清水處理作為對(duì)照 一個(gè)培養(yǎng)皿為一個(gè)重復(fù) 每個(gè)處理6個(gè)葉片 重復(fù)三次 室溫25 浸泡3 d 后 進(jìn)行第一次調(diào)查 然后每24 h觀察一次 共記錄4次 記載癥狀變化 表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 孢子濃度 浸泡時(shí)間 10 5孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL 1 min組合1組合5組合9組合13 3 min組合2組合6組合10組合14 5 min組合3組合7組合11組合15 7 min組合4組合8組合12組合16 1 2 3 幼苗灌根法 將番茄種子播種于裝有無(wú)菌土的無(wú)底塑料營(yíng)養(yǎng)缽中 每個(gè)品種3缽置于1個(gè)托盤(pán)里 番茄出苗后 每一 營(yíng)養(yǎng)缽留苗3棵 待4片真葉時(shí)接菌 接種時(shí) 每缽從上向下灌入50 mL孢子懸浮液 以灌入等量清水的作為 對(duì)照 每個(gè)處理9株 重復(fù)3次 接種后10 d開(kāi)始第一次發(fā)病調(diào)查 以后每7 d調(diào)查一次 共調(diào)查4次 分別依 據(jù)病情指數(shù)和發(fā)病程度進(jìn)行比較和分析 1 3 致萎力分級(jí)及病情指數(shù) 葉片浸泡法病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照齊俊生 2006 標(biāo)準(zhǔn)劃分為 0級(jí) 1級(jí) 2級(jí) 3級(jí) 4級(jí) 3 灌根法病情分 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照尤海波 2007 標(biāo)準(zhǔn)劃分為 0級(jí) 1級(jí) 2級(jí) 3級(jí) 4級(jí) 2 1 4 抗性劃分標(biāo)準(zhǔn) 免疫 I 病情指數(shù)為0 高抗 HR 病情指數(shù)在15以下 抗病 R 病情指數(shù)在15 30 中抗 MR 病 情指數(shù)在30 40 感病 S 病情指數(shù)在40 60 高感 HS 感病指數(shù)在60以上 5 6 病情指數(shù)的計(jì)算公式 病情指數(shù) DI 發(fā)病級(jí)數(shù) 相應(yīng)發(fā)病株數(shù) 調(diào)查總株數(shù) 最高發(fā)病級(jí)數(shù) 100 最后按國(guó)家統(tǒng)一 14 第3期 丁錦平 等 番茄黃萎病抗性快速鑒定方法探討 標(biāo)準(zhǔn)劃分番茄品種對(duì)黃萎病的抗病類型 7 2 結(jié)果與分析 2 1 離體葉片鑒定法 2 1 1 不同實(shí)驗(yàn)組合對(duì)番茄葉片的致萎性反應(yīng) 在溫室條件下 25 大約3 d后 不同濃度的孢子懸浮液對(duì)番茄葉片的致萎性差異很大 濃度為105孢 子 mL病菌孢子處理過(guò)的葉片基本沒(méi)有變化 感病品種MM不發(fā)病 說(shuō)明濃度太小 108孢子 mL病菌孢子處 理過(guò)的葉片則出現(xiàn)嚴(yán)重的萎蔫癥狀 葉片50 發(fā)黃或嚴(yán)重萎蔫 所有的品種包括抗病野生品種都感病 說(shuō)明 濃度太大 而106 107孢子 mL病菌孢子處理過(guò)的葉片出現(xiàn)程度不同的萎蔫 且清水對(duì)照則不會(huì)出現(xiàn)萎蔫 濃度較高的病菌孢子比低濃度的病毒孢子具有較強(qiáng)的致病力 侵染的時(shí)間太短不能發(fā)病 時(shí)間太長(zhǎng)也無(wú)法正 確判斷抗病性的差異 以5 min時(shí)間為最佳侵染時(shí)間 重復(fù)試驗(yàn)3次的結(jié)果表明該方法的處理成功率可達(dá) 99 以上 離體葉片鑒定法對(duì)不同濃度的病菌孢子溶液檢測(cè)結(jié)果顯示 孢子濃度及番茄品種不同 致萎效果也會(huì)出 現(xiàn)明顯的差別 這種差異可以作為定量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 圖1 圖中0級(jí)至4級(jí)為黃萎菌孢子 106孢子 mL 所致 由此可看出黃萎菌孢子在濃度為106孢子 mL時(shí) 仍具有很強(qiáng)的致萎力 所以本研究采用的黃萎菌濃度為 106孢子 mL侵染5 min 圖1 離體葉片鑒定致萎程度分級(jí) 自左到右為0 4級(jí) 2 1 2 不同番茄品種的病情指數(shù)分析 對(duì)12份番茄材料進(jìn)行抗病性鑒定 接種后3 d進(jìn)行第1次調(diào)查 第7 d時(shí)病情基本不再發(fā)生變化 GBS 改良和上海908病情指數(shù)為0 表現(xiàn)為免疫 寶冠一號(hào) 金盾病情指數(shù)為16 7 表現(xiàn)為抗病 太空99F1 和粉鉆石病情指數(shù)為33 3 表現(xiàn)為中抗 經(jīng)典F1 達(dá)利寶和重茬帝龍F(tuán)1病情指數(shù)為50 55 表現(xiàn)為感病 白 果強(qiáng)豐病情指數(shù)為75 表現(xiàn)為高感 表2 表2 番茄材料的抗病性鑒定結(jié)果 品種名稱病情指數(shù)抗性分級(jí) 1221 0 I GBS 改良908 0 I 上海908 0 I 寶冠一號(hào)F1 16 7 R 金盾16 7 R 太空99F1 33 3 MR 粉鉆石33 3 MR 重茬帝龍F(tuán)1 55 S 經(jīng)典F1 50 S 達(dá)利寶50 S 白果強(qiáng)豐75 HS MM 80 HS 2 2 離體葉片鑒定法與灌根法的比較 2 2 1 灌根法對(duì)不同番茄品種的病情分析 用濃度為107孢子 mL的病菌懸浮液對(duì)12種番茄試材進(jìn)行灌根處理 第10 d第一次調(diào)查 結(jié)果表明 GBS 改良908 寶冠一號(hào)F1和粉鉆石病情指數(shù)為0 表現(xiàn)為免疫 重茬帝龍F(tuán)1病情指數(shù)為20 表現(xiàn)為中抗 上海908 經(jīng)典F1 金盾和達(dá)利寶病情指數(shù)為16 7 33 3 表現(xiàn)為抗病 白果強(qiáng)豐病情指數(shù)為75 表現(xiàn)為高 24商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年 感 其表現(xiàn)癥狀與離體葉片鑒定法相差較大 然后每7 d調(diào)查一次 結(jié)果發(fā)現(xiàn)第24 d的調(diào)查結(jié)果與離體葉片 鑒定法基本相同 GBS 改良908 上海908病情指數(shù)為0 表現(xiàn)為免疫 寶冠一號(hào)F1和金盾病情指數(shù)為 16 7 表現(xiàn)為抗病 太空99F1和粉鉆石病情指數(shù)為33 3 表現(xiàn)為中抗 重茬帝龍F(tuán)1 經(jīng)典F1和達(dá)利寶病情指 數(shù)為50 55 表現(xiàn)為感病 只有白果強(qiáng)豐病情指數(shù)為100 但仍表現(xiàn)為高感 與離體葉片鑒定法有差異 但不 明顯 2 2 2 離體葉片鑒定法與灌根法測(cè)定抗病性的比較 利用離體葉片鑒定法得出GBS 改良908 上海908表現(xiàn)為免疫 寶冠一號(hào)F1和金盾表現(xiàn)為抗病 太空 99F1和粉鉆石表現(xiàn)為中抗 重茬帝龍F(tuán)1 經(jīng)典F1和達(dá)利寶表現(xiàn)為感病 白果強(qiáng)豐表現(xiàn)為高感 與灌根法鑒 定結(jié)果相同 只是兩種方法得到的白果強(qiáng)豐的病情指數(shù)不太相符合 不過(guò)都表現(xiàn)為高感 由此可知離體葉片 鑒定法和灌根法具有較高的一致性 3 討 論 菌液毒素浸泡離體材料 由于是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行處理 所以可以較為有效地避免病菌分布不均對(duì)植物材 料抗病鑒定造成的影響 因此離體鑒定法已在棉花 茄子黃萎病抗性鑒定時(shí)被采用 8 9 本方法利用106孢 子 mL進(jìn)行浸泡5 min處理效果較好 每個(gè)處理只需要10 mL的菌液 只要浸泡時(shí)間掌握合適 室溫合適 可 確保全部處理的效果明顯 排除可能造成的系統(tǒng)誤差 葉片經(jīng)浸泡處理后發(fā)病迅速 適合快速大量鑒定 經(jīng)過(guò) 與灌根法比較 本方法具有較高的準(zhǔn)確性 且更簡(jiǎn)單和快速 浸泡葉片接種避免了大量用土和對(duì)土壤滅菌的 繁瑣步驟 占用空間較小 所用菌液少 成本較低 同時(shí)還可避免因土壤滅菌不徹底所帶來(lái)的系統(tǒng)誤差 因此 可作為番茄品種資源抗黃萎病鑒定的方法之一 本方法與齊俊生在棉花上采用的離體鑒定效果一致 3 由 于番茄抗病性鑒定時(shí)受到的影響因子較多 所以鑒定的時(shí)間越短受其它因素干擾越少 該方法還可以為其它 植物黃萎病抗性鑒定提供參考 參考文獻(xiàn) 1 雷晶 番茄苗期多抗性鑒定方法研究及抗病種植資源篩選 D 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007 2 尤海波 番茄黃萎病病原菌鑒定及抗病種質(zhì)資源篩選 D 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003 3 齊俊生 李懷方 一種檢測(cè)棉花黃萎菌毒素致萎性的新方法 葉片針刺涂抹法 J 棉花學(xué)報(bào) 2006 18 04 228 232 4 王生榮 張俊華 普通植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn) M 北京 北京大學(xué)出版社 2013 5 張興華 李捷 棉花抗枯 黃萎病研究進(jìn)展及其抗性鑒定方法 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2008 20 03 43 49 6 馬前程 王麗麗 張海萍 等 棉花黃萎病抗性鑒定及抗病相關(guān)的分子標(biāo)記檢測(cè) J 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2016 39 03 198 205 7 王明耀 王學(xué)穎 鹿秀云 等 抗黃萎病番茄種質(zhì)材料的篩選 J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 48 06 48 49 92 8 王銘 臧麗麗 范凱 等 黃萎病菌毒素聯(lián)合法鑒定棉花對(duì)黃萎病的抗性 J 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015 48 09 1678 1688 9 趙明敏 劉正坪 霍秀文 利用病原真菌毒素離體篩選茄子抗黃萎病突變體的研究 J 華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2006 21 01 92 95 責(zé)任編輯 孟團(tuán)結(jié) 34 第3期 丁錦平 等 番茄黃萎病抗性快速鑒定方法探討