中國農業(yè)大學學報 2 0 2 3 2 8 2 5 9 7 3 J o u r n a l o f C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y h t t p z g n y d x x b i j o u r n a l s c n 梁蕤 徐雷鋒 畢蒙蒙 王靜 唐玉超 郝澤慧 劉一潔 楊盼盼 明軍 杜方 檸檬色百合實時熒光定量P C R內參基因篩選 J 中國農業(yè)大學學報 2 0 2 3 2 8 0 2 5 9 7 3 L I A N G R u i X U L e i f e n g B I M e n g m e n g W A N G J i n g T A N G Y u c h a o H A O Z e h u i L I U Y i j i e Y A N G P a n p a n M I N G J u n D U F a n g V a l i d a t i o n o f r e f e r e n c e g e n e s f o r q u a n t i t a t i v e r e a l t i m e P C R i nLiliumleichtlinii J JournalofChinaAgriculturalUniversity 2 0 2 3 2 8 0 2 5 9 7 3 D O I 1 0 1 1 8 4 1 j i s s n 1 0 0 7 4 3 3 3 2 0 2 3 0 2 0 6 檸檬色百合實時熒光定量PCR內參基因篩選 梁蕤1 3 徐雷鋒3 畢蒙蒙3 王靜3 唐玉超3 郝澤慧3 4 劉一潔3 5 楊盼盼3 明軍3 杜方2 1 山西農業(yè)大學園藝學院 山西太谷0 3 0 8 0 1 2 山西農業(yè)大學城鄉(xiāng)建設學院 山西太谷0 3 0 8 0 1 3 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 北京1 0 0 0 8 1 4 北京農學院園林學院 北京1 0 2 2 0 6 5 青島農業(yè)大學園林與林學院 山東青島2 6 6 1 0 9 摘 要 為篩選檸檬色百合 Liliumleichtlinii 實時熒光定量P C R穩(wěn)定的內參基因 以檸檬色百合不同發(fā)育時期 花被片 根 莖 葉和鱗片為試驗材料 測定比較總類胡蘿卜素含量 使用R T P C R和熒光定量P C R檢測9個候選 內參基因 AP4 Actin TUB CYP eIF GAPDH RH2 UBC和18S 特異性及表達水平 利用g e N o r m N o r m F i n d e r B e s t k e e p e r C T程序和R e f F i n d e r網站綜合評估候選內參基因表達穩(wěn)定性 選用八氫番茄紅素酶基 因PSY對內參基因穩(wěn)定性進行驗證 最終確定合適且穩(wěn)定的內參基因 結果表明 1 檸檬色百合花被片發(fā)育過程 中Actin和AP4為9個候選內參基因中最穩(wěn)定的內參基因 UBC為最不穩(wěn)定的內參基因 2 檸檬色百合不同器 官間eIF和AP4為候選內參基因中最穩(wěn)定的內參基因 18S為最不穩(wěn)定的內參基因 3 在檸檬色百合花被片發(fā) 育過程和不同器官間 以篩選出最穩(wěn)定的內參基因為參照計算所得PSY基因表達情況與實際測得總類胡蘿卜素 含量變化趨勢一致 以篩選出最不穩(wěn)定的內參基因作為參照計算所得PSY基因表達情況與總類胡蘿卜素含量變 化趨勢不同甚至相反 研究表明在試驗中不能隨意使用內參基因 需要在使用前對其進行篩選 評價和驗證 同時 研究結果為檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間基因表達分析提供了穩(wěn)定的內參基因 關鍵詞 檸檬色百合 實時熒光定量P C R 內參基因 類胡蘿卜素 中圖分類號 S 6 8 2 2 文章編號 1 0 0 7 4 3 3 3 2 0 2 3 0 2 0 0 5 9 1 5 文獻標志碼 A 收稿日期 2 0 2 2 0 8 2 2 基金項目 山西省基礎研究計劃 自由探索類 自然科學研究面上項目 2 0 2 1 0 3 0 2 1 2 3 4 1 6 國家自然科學基金項目 3 2 1 7 2 6 2 4 3 1 8 0 1 8 9 9 山西農業(yè)大學橫向科技 合作項目 2 0 2 1 N Y G G 1 1 1 第一作者 梁蕤 0 0 0 0 0 0 0 3 0 9 9 1 5 8 7 5 碩士研究生 E m a i l l r u i 1 1 1 8 1 6 3 c o m 通訊作者 杜方 0 0 0 0 0 0 0 3 4 8 5 3 7 7 8 2 教授 主要從事花卉種質資源利用及分子生物學研究 E m a i l d f 7 3 0 2 2 7 y e a h n e t 明軍 0 0 0 0 0 0 2 2 9 4 9 6 1 9 9 研究員 主要從事花卉育種及分子生物學研究 E m a i l m i n g j u n c a a s c n Validationofreferencegenesforquantitativereal timePCR inLiliumleichtlinii LIANGRui1 3 XULeifeng3 BIMengmeng3 WANGJing3 TANGYuchao3 HAOZehui3 4 LIUYijie3 5 YANGPanpan3 MINGJun3 DUFang2 1 CollegeofHorticulture ShanxiAgriculturalUniversity Taigu030801 China 2 CollegeofUrbanandRuralConstruction ShanxiAgriculturalUniversity Taigu030801 China 3 InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China 4 CollegeofLandscapeArchitecture BeijingUniversityofAgriculture Beijing102206 China 5 CollegeofLandscapeArchitectureandForestry QingdaoAgriculturalUniversity Qingdao266109 China 中國農業(yè)大學學報2 0 2 3年第2 8卷 Abstract Inordertoselectandvalidatethereal timePCRreferencegenesstablyexpressedinLiliumleichtlinii tepals indifferentstages root stem leafandscaleweretakenasstudyobjects Thisstudymeasuredandcomparedthe totalcarotenoidscontents analyzedthespecificityandtheexpressionlevelsofAP4 Actin TUB CYP eIF GAPDH RH2 UBCand18SinL leichtliniibyRT PCRandqRT PCR GeNorm NormFinder Bestkeeper CTand RefFinderwereusedtoevaluateexpressionstabilityofthesecandidatereferencegenes PSYgenewasusedtoverify thestabilityofreferencegenes Theresultsshowedthat IntepalsduringdevelopmentofL leichtlinii AP4andActin werethemoststablegenesandUBCwastheleaststablegeneamong9candidatereferencegenes Indifferent tissues eIFandAP4werethemoststable 18Swasthemostunstable Inaddition theexpressionlevelsofPSY calculatedusingthemoststablereferencegeneswereconsistentwiththetrendoftotalcarotenoidscontentsduring tepaldevelopmentprocessandatdifferenttissues TheexpressionlevelofPSYcalculatedusingunstablereference geneswasdifferentandevenoppositetothetrendoftotalcarotenoidscontents Inconclusion referencegenesshould notbeusedrandomlyintest andtheyneedtobeevaluatedandverifiedbeforeuse Thisstudyprovidedthestable referencegenesfortheanalysisofgeneexpressionduringtepaldevelopmentanddifferenttissuesinL leichtlinii Keywords Liliumleichtlinii reversetranscriptionreal timepolymerasechainreaction referencegene carotenoid 花色是觀賞園藝植物最重要的觀賞性狀之一 其主要由類黃酮 類胡蘿卜素 甜菜色素和葉綠素這 4大類化合物構成 其中 類黃酮和類胡蘿卜素是百 合花色的主要呈色物質 1 相比于類黃酮代謝研 究 類胡蘿卜素代謝研究較少 2 3 且類胡蘿卜素代 謝更為復雜 類胡蘿卜素既作為色素在花和果實中 積累呈色 也參與光合作用 參與植物生長發(fā)育和調 控激素水平 4 產自日本的檸檬色百合 Lilium leichtlinii 屬于百合科百合屬 其花被片背景富含 類胡蘿卜素呈檸檬黃色 花1 5朵下垂 開放時花 被片向上反卷 具有極高的觀賞價值 是研究百合類 胡蘿卜素花色呈色機理的優(yōu)選材料 5 在以檸檬色百合為試驗材料揭示百合類胡蘿卜 素分子調控機理的過程中 檢測類胡蘿卜素代謝關 鍵基因表達是必不可少的環(huán)節(jié) 常規(guī)檢測基因表達 的方法有N o r t h e r n雜交 N o r t h e r n b l o t t i n g 半定 量R T P C R S e m i q u a n t i t a t i v e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 實時熒光定量P C R R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a l t i m e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n q R T P C R 微陣列分析 M i c r o a r r a y s a n a l y s i s 轉錄組測序 R N A s e q u e n c i n g 和原位雜 交 I n s i t u h y b r i d i z a t i o n I S H 等 6 7 其中q R T P C R技術憑借其高準確度 高靈敏度 高通量和操 作方便等優(yōu)點被廣泛應用 8 該技術支持絕對定量 分析和相對定量分析 絕對定量常用來探究單個樣 品的本質屬性 相對定量常用來比較多個樣本間某 一特定性質 6 9 試驗中通常運用相對定量探究不 同樣本間同一基因表達情況 相對定量分析的準確 性受到R N A質量和完整性 反轉錄效率和擴增效 率等因素的影響 1 0 因此 需要使用1個或多個穩(wěn) 定內參基因 R e f e r e n c e g e n e s 對目的基因的表達進 行均一化 1 1 1 3 內參基因指的是在各個樣品中表達恒定的基 因 1 4 其穩(wěn)定性和可靠性直接關系到目的基因表達 檢測結果的準確性和整體試驗研究的可靠性 在不 同百合種 品種 花發(fā)育過程 花被片不同部位 不 同器官及不同處理下 大多使用Actin或GAPDH Glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase 作為內 參基因 1 5 2 0 在研究百合體細胞胚的生長發(fā)育過程時 也用到FP F boxfamilyprotein 作為內參基因 2 1 但幾種常用內參基因在百合不同組織器官間 花發(fā)育 過程 花遮光處理及葉 鱗片和根脅迫處理中的穩(wěn)定 性是可能變化的 因此 具體百合種 品種 及研究條 件下仍需重新篩選穩(wěn)定適宜的內參基因 2 2 2 3 本研究根據(jù)前期建立的轉錄組數(shù)據(jù)庫和已報道 的百合內參基因 選取了9個候選內參基因 使用 g e N o r m N o r m F i n d e r C T B e s t k e e p e r程序和 R e f F i n d e r網站比較分析這9個候選內參基因在檸 檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間的表達情 況 并對候選內參基因穩(wěn)定性進行評估排序 為檢 驗內參基因評估的準確性 本研究以篩選出最穩(wěn)定 的內參基因和最不穩(wěn)定的內參基因作為參照 檢測 了八氫番茄紅素酶基因PSY Phytoenesynthase 表達情況 P S Y作為類胡蘿卜素代謝途徑的第1 個限速酶 在植物花 葉 果實和根等不同器官中 PSY基因表達的情況直接決定總類胡蘿卜素含量 的積累 1 6 2 4 2 7 因此 本試驗將PSY基因在檸檬色 百合花被片發(fā)育過程和不同器官間表達情況與對應 06 第2期梁蕤等 檸檬色百合實時熒光定量P C R內參基因篩選 的總類胡蘿卜素含量變化趨勢結合 用來驗證候選 內參基因的穩(wěn)定性 本研究旨在綜合多個程序網站 評估候選內參基因穩(wěn)定性 通過檢測總類胡蘿卜素 積累和PSY基因表達驗證內參基因穩(wěn)定性 最終確 定檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間適宜穩(wěn) 定的內參基因 以期為百合類胡蘿卜素的研究提供 理論基礎 1 材料與方法 1 1 試驗材料 以檸檬色百合 L leichtlinii 為試驗材料 種 植于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所資源圃內 依 照花蕾顏色變化和花被片發(fā)育2項指標進行取材 花被片發(fā)育第1時期 S 1 花色轉變前期 花蕾長 約5 5 c m 整體呈綠色 取其綠偏黃色內花被片作 為試材 花被片發(fā)育第2時期 S 2 花開放前一天 花蕾整體柔軟 不緊實 呈鮮艷檸檬黃色 花蕾中部 膨大 有張開趨勢 取其檸檬黃色內花被片作為試 材 花被片發(fā)育第3時期 S 3 花開放當天 花被片 向上反卷 取其反卷的檸檬黃色內花被片作為試材 圖1 a c 同時 取開放當天內花被片 葉 莖 鱗片和根作為不同器官試驗材料 圖1 d h 每個樣品設3個生物學重復 樣品經液氮速 凍后存于 8 0 超低溫冰箱備用 a 第1時期 花色轉變前期 b 第2時期 花開放前一天 c 第3時期 花開放當天 d 花 e 葉 f 莖 g 外層鱗片 h 根 標尺 2 c m a S t a g e 1 e a r l y p h a s e o f c o l o r t r a n s i t i o n b S t a g e 2 t h e d a y b e f o r e a n t h e s i s c S t a g e 3 0 d a y p o s t a n t h e s i s d F l o w e r e L e a f f S t e m g T h e o u t e r s c a l e h R o o t S c a l e 2 c m 圖1 檸檬色百合不同發(fā)育時期的花和不同器官 F i g 1 F l o w e r s i n d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s a n d d i f f e r e n t t i s s u e s o fLiliumleichtlinii 1 2 總類胡蘿卜素含量測定 將超低溫保存的檸檬色百合內花被片 葉 莖 鱗片和根樣品冷凍干燥后用研磨儀研磨 稱取 0 0 1 5 g干樣溶于1 m L提取液 V 正己烷 V 丙 酮 V 乙醇 2 1 1 包含質量濃度為0 0 1 的2 6 二叔丁基對甲酚 B H T 中 渦旋3 0 s 置于 2 5 超聲波清洗儀振蕩2 0 m i n 之后4 離心 5 m i n 1 2 0 0 0 r m i n 收集上清避光保存 對沉淀 重復上述步驟 收集上清 用提取液定容至5 m L 用 0 2 2 m有機濾膜過濾后 取3 m L于紫外分光光 度計4 4 0 6 4 5和6 6 3 n m波長下檢測吸光值 每個 樣品3個生物學重復 2 8 總類胡蘿卜素含量根據(jù) 莫玉楠等 2 9 的方法進行計算 1 3 候選內參基因選擇及引物序列 文獻檢索分析L i等 2 2 和X u等 2 3 合成的百合 內參基因引物 AP 4complexsubunit AP4 N C B I 登錄號 K P 8 6 1 8 7 8 Beta tubulin1 TUB N C B I 登錄號 K P 8 6 1 8 7 5 Cyclophilin CYP Eukaryotic 16 中國農業(yè)大學學報2 0 2 3年第2 8卷 initiationfactor1 eIF N C B I登錄號 K P 8 6 1 8 7 4 Glyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase1 GAPDH N C B I登錄號 K P 1 7 9 4 1 7 1 DEADboxRNA helicase RH2 N C B I登錄號 K P 8 6 1 8 8 0 和18S RibosomalRNA 18S N C B I登錄號 A Y 6 8 4 9 2 7 1 同時在已有檸檬色百合轉錄組數(shù)據(jù)庫中對所有 U n i g e n e不同樣本的f p k m值進行標準差分析 在 f p k m值高且標準差小的U n i g e n e中搜索常用內參 基因 最終篩選出Actin2 Actin N C B I登錄號 O P 5 3 9 3 1 0 和Ubiquitin conjugatingenzymeE22 UBC N C B I登錄號 O P 5 3 9 3 1 1 2個常用內參基 因 所有內參基因引物序列如表1所示 PSY引物 序列參照W a n g等 1 6 的設計 F C C A G A G T C C C G T G C A T C G A C R A T A T C G T C C T C T G A A A G G C C 引物由上海生工生物工程股份有限公司 合成 表1 候選內參基因qRT PCR的引物序列和擴增參數(shù) T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s a n d a m p l i f i c a t i o n p a r a m e t e r s f o r c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s 基因 簡稱 G e n e 基因名稱 G e n e n a m e 引物序列 5 3 P r i m e r s e q u e n c e 5 3 斜率 S l o p e 擴增效率 A m p l i f i c a t i o n e f f i c i e n c y 相關系數(shù) R e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t AP4AP 4complexsubunitF G A T G G G G C T T C T T T A T A C G G T R T C A T T A C A G C A A A C T C T C C C T C T 3 4 0 5 5 9 6 6 3 0 9 9 5 5 ActinActin2F A G G C T A C A C T T T C A C G A C T A C T G R A G G A C C T C T G G G C A T C T A A 3 5 1 0 9 9 2 6 8 0 9 9 3 4 TUBBeta tubulin1 F C T A T G A C A T C T G T T T C C G C A C T C R A G C G A T A C T G T T G G G A G C C T 3 4 6 0 8 9 4 5 1 0 9 9 6 8 CYPCyclophilinF C C C G A A T A C G A A T G G C T C A R C A A T C A C C A C C T T G G C A G A A 3 2 5 2 5 1 0 2 9 8 0 9 9 2 5 eIFEukaryoticinitiation factor1 F T A T G G T G A G C T T C C T G A C A A C G T R T C A C A A A G A C A G T A A C A A C A G C G A T 3 3 9 2 1 9 7 1 5 0 9 9 7 0 GAPDH Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase1 F G C T G C A A G T T T C A A C A T T A T T C C R A T C C T C A T C A G T A T A A C C A A G A 3 5 5 7 8 9 1 0 2 0 9 9 6 4 RH2DEADboxRNAhelicaseF C C G A G A C C A G T T C G T T C A R A C A A T A G G A C C A T C C C C A T 3 4 7 7 6 9 3 8 9 0 9 8 8 4 UBCUbiquitin conjugatingenz ymeE22 F C T G C A A C A G G G A G A A T G C A G R T G G A A G A T C A A C C C A T G C A G 3 5 2 5 5 9 2 1 5 0 9 9 5 9 18S18SRibosomalRNAF C G T T T C G G G C A T G A T T T G T G G R T C G C A T T T C G C T A C G T T C T T C 3 4 0 2 9 9 6 7 3 0 9 9 6 3 1 4 總RNA提取和cDNA第1鏈合成 使用R N A p r e p P u r e多糖多酚植物總R N A提 取試劑盒 天根生化有限公司 提取檸檬色百合內花 被片 葉 莖 鱗片和根的R N A 并將不同樣本的 R N A均稀釋為相同濃度 1 1 0 0 n g L 使用 H i f a i r I I 1 s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s S u p e r M i x f o r q P C R g D N A d i g e s t e r p l u s 翊圣生物科技股份 有限公司 進行反轉錄 用E A S Y D i l u t i o n f o r R e a l 26 第2期梁蕤等 檸檬色百合實時熒光定量P C R內參基因篩選 T i m e P C R T a k a r a 進行c D N A稀釋 為檢測引 物擴增效率 將葉的c D N A原液依次稀釋5倍并設 置5個濃度梯度 分別為葉c D N A原液的5 1 5 2 5 3 5 4和5 5倍 將不同樣本c D N A原液稀釋5 倍使用 每個樣本均為3個生物學重復 1 5 候選內參基因RT PCR擴增和qRT PCR反應 以檸檬色百合葉c D N A為模板 進行R T P C R 擴增 擴增體系為 總體積1 0 0 L 其中2 T a q P C R M a s t e r M i x 5 0 L p r i m e r F 1 0 M 0 5 L p r i m e r R 1 0 M 0 5 L c D N A 1 0 L d d H 2 O 3 0 L 反應條件為 9 4 初始變性5 m i n 9 4 變性3 0 s 5 6 退火3 0 s 7 2 延伸2 0 s 3 5個循 環(huán) 7 2 最后延伸1 0 m i n 得到的P C R產物經 2 0 瓊脂糖凝膠電泳檢測 在B I O R A D凝膠成像 儀觀察拍照 以檸檬色百合葉5個濃度梯度的c D N A及不 同樣本c D N A為模板 在B I O R A D C F X 9 6實時熒 光定量P C R儀中對不同內參基因及PSY基因進行 三步法熒光定量 擴增體系 總體積2 0 0 L 其中 q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x 1 0 0 L p r i m e r F 1 0 M 0 4 L p r i m e r R 1 0 M 0 4 L c D N A 2 0 L d d H 2 O 7 2 L 反應條件為 9 5 預變性 5 m i n 9 5 變性1 0 s 5 6 退火2 0 s 7 2 延伸 3 0 s 4 0個循環(huán) 熔解曲線程序為 6 5 9 5 每 5 s升溫0 5 反應結束后由C F X M a n a g e r軟件生成熔解曲 線 根據(jù)熔解曲線分析候選內參基因引物特異性 根據(jù)各內參基因在不同檸檬色百合葉c D N A梯度 下CT值繪制標準曲線并計算斜率 k 擴增效率 E 和線性相關系數(shù) R2 利用C F X M a n a g e r軟件 G e n e S t u d y程序中P f a f f l方法計算基于單個內參 基因的PSY相對表達量 運用V a n d e s o m p l e方法 計算基于多個內參基因的PSY相對表達量 使用 S P S S分析PSY相對表達情況與總類胡蘿卜素積累 間斯皮爾曼相關性 1 6 數(shù)據(jù)分析及候選內參基因穩(wěn)定性評價 整理全部樣本中候選內參基因CT值 使用 g e N o r m N o r m F i n d e r C T B e s t k e e p e r程序和 R e f F i n d e r網站 h t t p s w w w h e a r t c u r e c o m a u r e f f i n d e r t y p e r e f e r e n c e 分析檸檬色百合花被 片發(fā)育過程和不同器官間候選內參基因的表達穩(wěn) 定性 g e N o r m程序將循環(huán)數(shù)轉換為基因相對表達 量 即將所有CT值轉換為2 C T CT 各CT值 最 小CT值 通過計算候選內參基因表達穩(wěn)定值 M 來評估 M值與穩(wěn)定性呈負相關 M值越小 穩(wěn)定 性越高 若M值超過1 5即認定該基因不適合作內 參基因 之后計算出標準化所需的最佳內參基因數(shù) 量 程序默認值為Vn n 1 0 1 5 當Vn n 1即視為不 穩(wěn)定內參基因 同時將所有輸入候選內參基因組成 1個B e s t k e e p e r指數(shù) 計算每個候選內參基因和 B e s t k e e p e r指數(shù)之間的相關性 通過皮爾遜相關系 數(shù) r 決定系數(shù) r2 和顯著水平P值 P 描述候選 內參基因與B e s t k e e p e r指數(shù)之間的關系 1 4 最后依托R e f F i n d e r在線網站基于以上4個程 序結果 給每個候選內參基因分配1個適當權重 并 計算它們權重的幾何平均值 以獲得最終的整體 排名 3 3 2 結果與分析 2 1 總類胡蘿卜素含量 在檸檬色百合花被片中 隨著生長發(fā)育 花被片 背景顏色由綠變黃 積累的總類胡蘿卜素含量增加 圖2 a 檸檬色百合葉子為綠色 莖和鱗片表面 附著淺紫色 根為乳白色 總類胡蘿卜素在不同器官 間積累依次為 花被片 葉 莖 根 鱗片 且根和 鱗片中含量極少 圖2 b 2 2 引物特異性及擴增效率 以檸檬色百合葉c D N A為模板 用9個候選內 參基因的引物進行R T P C R擴增 電泳圖顯示片段 大小正確 條帶單一 均無引物二聚體 圖3 a 以5個濃度梯度的檸檬色百合葉c D N A為模板 進 行q R T P C R反應 結果顯示 熔解曲線均為單一信 號峰 且同一樣品重復性好 表明9個候選內參基因 36 中國農業(yè)大學學報2 0 2 3年第2 8卷 引物特異性高 圖3 b j 根據(jù)q R T P C R反 應所得CT值繪制標準曲線 9個候選內參基因的相 關系數(shù)R2介于0 9 8 8 4 0 9 9 7 0之間 擴增效率 介于9 1 0 2 1 0 2 9 8 之間 表1 同一圖中不同字母表示差異顯著 P 0 0 5 0 W i t h i n t h e s a m e g r a p h d i f f e r e n t l e t t e r s r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s P 0 0 5 0 圖2 總類胡蘿卜素含量 F i g 2 T o t a l c a r o t e n o i d c o n t e n t 2 3 表達水平分析 利用所有樣本中得到的CT值可以預測9個候 選內參基因的表達水平 CT值越低 表達豐度越 高 9個候選內參基因在花被片發(fā)育過程和不同器 官間的CT值分布見圖4 結果表明 18S表達豐度 最高 eIF和UBC的表達水平變異最小 2 4 穩(wěn)定性分析 將g e N o r m和N o r m F i n d e r結果按照M值排 序 C T結果按照平均標準偏差排序 B e s t k e e p e r 結果中 按S D從小到大 C V從低到高依次進行穩(wěn) 定性排序 同時考慮候選內參基因與B e s t k e e p e r指 數(shù)間r和P值 若2個內參基因間S D值相近 C V 值也相近 則將r值低的內參基因排在后面 若候選 內參基因S D 1則視為不穩(wěn)定內參基因 候選內參 基因與B e s t k e e p e r指數(shù)間P 0 0 5也視為不穩(wěn)定 內參基因 表2 由于不同程序算法不同 所得結果并不一致 用 R e f F i n d e r網站對上述程序結果進行綜合分析確定 最終內參基因穩(wěn)定性排序 2 4 1 檸檬色百合花被片發(fā)育過程中候選內參基 因穩(wěn)定性分析 檸檬色百合花被片發(fā)育過程所得B e s t k e e p e r 結果中 雖然UBC的S D最小 C V最低 但其與相 應B e s t k e e p e r指數(shù)相關系數(shù)的P值為0 5 0 7 遠大 于0 0 5 0 表明UBC與B e s t k e e p e r指數(shù)不相關 而 其余8個候選內參基因與B e s t k e e p e r指數(shù)相關系 數(shù)的P值均為0 0 0 1 r值在0 8 7 6 0 9 9 6之間 表 明這8個候選內參基因與B e s t k e e p e r指數(shù)間相關 性強且呈極顯著相關 說明在檸檬色百合花被片發(fā) 育過程中 UBC與其它候選基因存在較大差異 不 適合作內參基因 CYP的S D值 1 0 0 為不穩(wěn)定 內參基因 表2 g e N o r m計算最穩(wěn)定的內參基因為AP4和 TUB 圖5 a N o r m F i n d e r計算最穩(wěn)定的內參基 因為 TUB 圖5 c C T計算最穩(wěn)定的內參基因 為Actin 圖5 d B e s t k e e p e r計算最穩(wěn)定的內參 基因為eIF 表2 綜合以上4個程序的結果判斷最 不穩(wěn)定的內參基因為UBC g e N o r m程序默認 Vn n 1 0 1 5 檸檬色百合花被片發(fā)育過程中計算 得V2 3配對變異系數(shù)為0 0 6 小于0 1 5 故檸檬色 百合花被片發(fā)育過程中熒光定量標準化所需的最佳 內參基因數(shù)為2 圖5 b R e f F i n d e r綜合以上4 個程序分析結果 計算得檸檬色百合花被片發(fā)育過 程最穩(wěn)定的內參基因為Actin和AP4 表3 2 4 2 檸檬色百合不同器官間候選內參基因穩(wěn)定 性分析 檸檬色百合不同器官間所得B e s t k e e p e r計算 結果中 9個候選基因與相應B e s t k e e p e r指數(shù)間顯 著相關 TUB和18S的S D 1 0 0 為不穩(wěn)定內 參基因 表2 g e N o r m計算最穩(wěn)定的內參基因為 46 第2期梁蕤等 檸檬色百合實時熒光定量P C R內參基因篩選 AP4和Actin 圖6 a N o r m F i n d e r和 C T計算 最穩(wěn)定的內參基因為eIF 圖6 c 和 d B e s t k e e p e r計算最穩(wěn)定的內參基因為AP4 表2 g e N o r m程序計算的V2 3配對變異系數(shù)為0 1 5 故 至少需要2個內參基因用于檸檬色百合不同器官間 標準化 圖6 b 根據(jù)R e f F i n d e r綜合分析 計算 得檸檬色百合不同器官間最穩(wěn)定的內參基因為eIF 和AP4 最不穩(wěn)定的內參基因為18S 表3 R F U 相對熒光定量值 R F U R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s 圖3 候選內參基因引物特異性 F i g 3 A m p l i f i c a t i o n s p e c i f i c i t y o f p r i m e r s 56 中國農業(yè)大學學報2 0 2 3年第2 8卷 中間橫線表示中位數(shù) T h e m i d d l e h o r i z o n t a l l i n e i s t h e m e d i a n 圖4 9個候選內參基因的CT值分布圖 F i g 4 D i s t r i b u t i o n o fCTv a l u e s o f c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s i n a l l s a m p l e s 表2 Bestkeeper分析候選內參基因穩(wěn)定性 T a b l e 2 E x p r e s s i o n s t a b i l i t y v a l u e s o f c a n d i d a t e r e f e r e n c e g e n e s c a l c u l a t e d b y B e s t k e e p e r 基因 G e n e 花被片發(fā)育過程中 T e p a l s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s 不同器官D i f f e r e n t t i s s u e s 標準偏差 S t a n d a r d d e v i a t i o n 變異系數(shù) C o e f f i c i e n t o f v a r i a n c e P值 Pv a l u e 皮爾遜 相關系數(shù) P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t 標準偏差 S t a n d a r d d e v i a t i o n 變異系數(shù) C o e f f i c i e n t