吉林農(nóng)業(yè)大學學報 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳 轉化 樊書羽 金時酉 王藝燃 曲 靜 劉思言 關淑艷 馬義勇 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 長春 摘 要 玉米的產(chǎn)量深受蟲害的影響 抗蟲 基因對玉米黏蟲抗性有重要意義 利用外源抗蟲基因 構建到原核表達載體 中 對其進行 檢測和抗黏蟲性鑒定 檢測結果表 明 基因編碼的殺蟲蛋白在大腸桿菌 中得到正確的表達 條帶大小為 抗黏蟲性鑒定結 果表明 當 蛋白濃度為 時 對東方黏蟲致死率達到 同時構建 植物表達載體 通過農(nóng)桿菌介導法將外源抗蟲基因 轉入玉米自交系 愈傷組織中 利用除草劑篩選及 技術檢測得到 轉基因陽性植株 株 獲得的轉基因抗蟲玉米植株為抗蟲轉基因玉 米的研發(fā)及抗蟲玉米新種質的創(chuàng)制奠定了基礎 關鍵詞 玉米 基因 表達載體 功能分析 中圖分類號 文獻標志碼 文章編號 引文格式 樊書羽 金時酉 王藝燃 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉化 吉林農(nóng)業(yè)大學學 報 基金項目 吉林省自然科學基金項目 吉林省科技引導計劃項目 吉林省科技支撐計劃項目 吉林省教育廳 十三五 科學技術項目 作者簡介 樊書羽 女 碩士研究生 研究方向 細胞生物學 收稿日期 通信作者 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉化 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 玉米 是一種廣泛種植的農(nóng)作物 是我國主要的糧食 經(jīng)濟和飼料作物 轉基 因或基因改造的抗蟲和耐除草劑的玉米 已在 部分國家商業(yè)化大規(guī)模種植 目前 玉米主要 用于飼養(yǎng)牲畜或用作工業(yè)產(chǎn)品的原料 而僅 的玉米用作人類食品 近年來 在中國 個省和 個地區(qū)都暴發(fā)了黏蟲蟲害 造 成的糧食作物損失 東北地區(qū)黏蟲 暴發(fā)的面積范圍較大 華北地區(qū)的成蟲數(shù)量多 危害較重 黃淮地區(qū)和湖南省呈局部大暴發(fā)狀態(tài) 西北和西南地區(qū)蟲害暴發(fā)較晚 成蟲數(shù)量較少 初步統(tǒng)計 全國蟲害暴發(fā)面積約為 萬公頃 主要為害玉米 水稻 高粱 小麥和谷子等禾本科 作物 因此本試驗將培育抗黏蟲轉基因玉米 作為首要目的 蘇云金芽孢桿菌 是 具有昆蟲病原性特征的革蘭氏陽性孢子形成的細 菌 在孢子形成階段產(chǎn)生殺蟲蛋白作為伴孢 晶體 這些晶體基本上由一種或多種蛋白質 和 毒素 組合而成 也被稱為 內(nèi)毒 素 蛋白是來自蘇云金芽孢桿菌的伴隨包 涵體 晶體 蛋白 其對靶生物具有可驗證的毒性 或與已知的 蛋白序列具有極高的相似性 類似地 蛋白是來自蘇云金芽孢桿菌的伴孢 包含蛋白 其表現(xiàn)出溶血 活性或與已知 的 蛋白序列具有較高的相似性 這些毒素對 人類 脊椎動物和植物無害并對其目標昆蟲具有 高度特異性 是完全可生物降解的 因此 蛋白是可代替農(nóng)藥 控制農(nóng)業(yè)中鱗翅目害蟲的可 行替代方案 通常 蛋白會被腸道蛋白酶攝入并加工 在昆蟲堿性腸道中轉化為活性毒素 活性毒 素與易感昆蟲腸道中存在的特定受體結合 結合 的毒素受體復合物導致腸膜孔形成 隨后引起敗 血病并最終導致死亡 人類和其他哺乳動物 為酸性腸道以及 蛋白結合受體 因此不易受 到相應 蛋白的毒性作用 多年來 幾種 含 基因的 蛋白已被安全地用于商業(yè)和農(nóng) 業(yè)的殺蟲噴霧劑 在過去的 年中 來自表 達 蛋白的轉基因農(nóng)作物的產(chǎn)品已安全地用于 食品和飼料 這些毒素對其目標昆蟲具有高 度特異性 對人類 脊椎動物和植物無害 并且是 完全可生物降解的 截至 年 月 共有 近 種 類抗蟲基因被發(fā)掘鑒定出來 涵 蓋了從 至 共 小類 其中 蛋白占其中的大多數(shù) 類是僅次于 類的殺蟲晶體蛋白 對鱗翅目 直翅目等類昆 蟲具有較好的殺蟲活性 其中 蛋白僅對鱗翅目昆蟲具有殺蟲活 性 且 對黏蟲的毒力要高于 和 因此在害蟲防治方面具有較為廣泛 的應用前景 本研究將 基因構建到 原核表達載體與植物表達載體中 利用除草劑篩 選及 技術檢測得到 轉基因陽性植株 株 為抗蟲玉米新種質的獲得奠定了基礎 材料與方法 材料 基因由吉林省庫美生物科技有限公 司合成 以克隆載體 形式保存在 大腸桿菌 中 以自交系 愈傷組 織為基因受體 黏蟲幼蟲購于河南省濟源白云實 業(yè)有限公司 方法 質粒 的提取 利用質粒 試劑 盒提取吉林農(nóng)業(yè)大學植物生物中心實驗室保存的 克隆載體 質粒 和原核表達載 體 具體試驗方法參見文獻 擴增 基因 根據(jù) 基 因的完整序列 設計 基因的特異性下游引 物 表 利用 技術擴增 基 因 其中 反應體系為 分別添加 總 計 反應條件 預變性 變 性 退火 延伸 次循環(huán) 延伸 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 年 月 表 引物序列 目的片段上游引物序列 下游引物序列 目的片段大小 注 分別表示該引物用于 基因 擴增 連接植物表達載體和原核表達載體 線性化載體及目的基因片段的制備 利 用同源重組的原理 將 基因連入原核表達 載體 上 綜合 基因序列上的酶切 位點和 載體序列上的可用酶切位點 選取 限制性內(nèi)切酶 對 載體進行 雙酶切 將載體大片段與 基因連接 其中 酶切體系為 各 載體 質粒 總計 并在 條 件下酶切 重組體系為目的基因 線性 載體 重組蛋白的表達 將構建好的重組質粒 轉化 感受態(tài)細胞 經(jīng) 誘導表達并進行 電泳檢測 蛋白殺蟲活性的生物鑒定 人工 飼料的配制參照文獻 方法和條件 含 載體的破碎菌液為陽性對照 含空載體的 破碎菌液為陰性對照 每 培養(yǎng)皿中加入 人工黏蟲飼料 并加入不同濃度的破碎菌液 攪拌均勻 將培養(yǎng)皿放在室溫環(huán)境中蒸發(fā) 水分直至沒有明顯水滴 將 頭初孵黏蟲幼蟲接入各皿中 每個濃度 設 次重復 接蟲后 為避免蟲子逃逸在其中墊 入紗布并封緊培養(yǎng)皿 將培養(yǎng)皿置于 光照 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 光周期為黑暗 光照 濕度為 每天添加新鮮飼料 培養(yǎng) 后 調(diào)查活蟲數(shù)和死蟲數(shù) 并計算死亡率 質粒 的提取 利用小提質粒 試劑盒提取 實驗室保存克隆載體 質粒 和植物表達載體 具體試驗方法 參照文獻 擴增 基因 根據(jù) 基因 的完整序列 設計 基因的特異性引物 表 利用 技術擴增 基因 線性化載體及目的基因片段的制備 利 用同源重組的原理 將 基因連入載體 上 綜合 基因序列上的酶 切位點和 載體序列上的可用酶切 位點 選取限制性內(nèi)切 對 載體進行雙酶切 將載體大片段與 基因連接 酶切體系為 各 載體質粒 總計 并在 條件下酶切 滅活 通過 擴增技術制備 基因片段 根據(jù)同源重組原理設計引物 以植物 表達載體 質粒為模板 按照本文 中的 擴增體系和條件 擴增 基 因 待酶切和 擴增反應結束后 將酶切產(chǎn)物 和 產(chǎn)物進行電泳驗證 回收并純化 基 因和載體大片段 具體方法參見文獻 目的片段與線性載體的連接 將線性載 體片段與 目的基因片段按照同源重組試 劑盒方法進行連接 在干式恒溫器中 反應 然后放在冰上靜止 后進行工程菌制 備 構建重組載體 重 組體系為 倍 線性載 體 與線性載體片段物質的量的比為 重組表達載體的鑒定 對表達載體 進行 及酶切驗證 反應體 系和反應條件同本文 和 農(nóng)桿菌介導玉米愈傷組織遺傳轉化 將 轉入農(nóng)桿菌 中 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉化 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 制成工程菌 對工程菌進行擴繁制備成侵染菌液并 對 幼胚誘導形成的愈傷組織塊進行侵 染 對侵染后的愈傷組織進行抗性篩選 分化成苗 具體的侵染及再生過程參見文獻 圖 區(qū)結構圖 轉基因植株的 檢測 對轉化的玉 米植株進行除草劑篩選 提取出抗性苗的葉片 陰性對照為未轉化玉米植株葉片 陽 性對照為植物表達載體質粒 分別對表達元件中的 基因 基因進行 擴增 反應條件 預變性 變性 退火溫度分別 為 退火時間 延伸 后延伸 次循環(huán) 擴增產(chǎn)物利用 瓊脂糖凝膠電泳分離 參照康為世紀公司的植物 基因組提取試劑盒說明書提取目的基因 結果與分析 基因的 擴增及鑒定 對 基因進行 擴增 約在 處有條帶 圖 證明 基因的 擴增 成功 陰性對照 目的基因 圖 基因的 鑒定 原核表達載體的構建 以 質粒為模板擴增 目 的基因 構建 原核表達載體 并 進行 擴增及雙酶切驗證 目的片段大小為 圖 成功構建 原核 表達載體 目的基因 重組質粒 圖 原核表達載體 鑒定及酶切鑒定 表達蛋白的 檢測 電泳分析 圖 經(jīng) 誘導后 含 工程菌 非可溶性組分 蛋白大小約在 表達出 條明顯的特異性條帶 與預期 條帶大小相吻合 表明 基因編碼的殺蟲蛋 白在大腸桿菌 中得到正確的表達 圖 誘導表達 檢測 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 年 月 原核表達蛋白對黏蟲的抗性分析 由表 可知 蛋白對黏蟲的致死率隨 濃度的增大而增加 濃度為 和 時 黏蟲的死亡率分別為 和 表 蛋白對黏蟲的致死率 接蟲數(shù)死蟲數(shù)死亡率 植物表達載體 的構建 將構建的植物表達載體 進行 擴增及雙 酶切驗證 目的片段大小為 圖 成功構 建植物表達載體 農(nóng)桿菌介導玉米的遺傳轉化 通過農(nóng)桿菌介導法侵染玉米愈傷組織 經(jīng)過 共培養(yǎng) 篩選 分化 生根等再生過程共得到 株 再生幼苗 移栽幼苗并對 葉期幼苗進行除草劑 篩選獲得抗除草劑 代植株 株 圖 將獲得 的抗性植株移栽到土壤并在溫室中培養(yǎng) 進行分 子檢測 陰性對照 目的基因 重組質粒 圖 植物表達載體 鑒定及酶切鑒定 預培養(yǎng) 共培養(yǎng) 篩選 分化培養(yǎng) 生根培養(yǎng) 移栽 圖 農(nóng)桿菌介導玉米的遺傳轉化 樊書羽 等 抗蟲 基因的原核表達及玉米的遺傳轉化 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 代轉基因玉米 檢測結果 對抗除草劑玉米植株的葉片提取基因組 以未轉化植株為陰性對照 質粒為陽性對照 分別對 基 因 基因進行 檢測 能夠擴增出明顯的 基因及 基因條帶 得到 代陽性植株 株 圖 代陽性植株 株 圖 基因 基因 陽性對照 陰性對照 空白組 轉化植株 圖 代轉基因玉米陽性植株 檢測 基因 基因 陽性對照 陰性對照 空白組 轉化植株 圖 代轉基因玉米陽性植株 檢測 討 論 抗蟲轉基因玉米的應用取決于抗蟲的效 果 大量研究證實 與其他抗蟲基因相比 在表 達量相等的情況下 轉 基因的作物抗蟲性最 強 類基因是轉基因玉米研發(fā)中的重要 基因 李冬雪等 證明了對小菜蛾 煙草天蛾等 較強的殺蟲活性是由其 毒蛋白的結構決定 的 第 批成功用于商業(yè)化的轉基因玉米 如 所用的抗蟲基因均為 類 基因 類基因的晶體蛋白在玉米中的表 達 能夠有效地控制苗期及穗期的蟲害 魏紀珍 研究了 與 互作對棉 鈴蟲的影響 結果顯示 種蛋白同時運用于棉鈴 蟲時其腸道中的酶活力顯著高于 種蛋白單獨作 用和對照組 幼蟲校正死亡率依次為雙價棉 轉 棉 轉 棉 李靜靜 利用含 與 雙基因的轉基因水稻飼喂棉鈴 蟲與稻縱卷葉螟 周后發(fā)現(xiàn)轉基因水稻抗蟲性 明顯高于未轉基因植株 且長勢良好 本研究將 基因與原核表達載體 相連接 并轉化大腸桿菌 使其表達 檢測表明 基因編碼的殺蟲蛋 白在大腸桿菌 中得到正確的表達 條帶大 小為 抗蟲性鑒定試驗結果表明 蛋白對黏蟲有良好的抗性 具有潛在的應 用價值 隨后將 基因導入玉米自交系 通過 檢測 除草劑篩選初步獲得 株 代陽性玉米植株 為后續(xù)植株的分子檢測 及抗蟲鑒定奠定了基礎 楊素娟等 的研究指 出 基因當濃度為 時 對東方黏 蟲致死率達到 本試驗與其結論相似 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 年 月 參考文獻 王月琴 玉米對亞洲玉米螟抗性研究 應用昆蟲 學報 楊素娟 對東方粘蟲 亞洲玉米螟具有抗蟲作用的 蛋白 篩選與分析 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學 魏曉禹 邵詩迪 孫蘇等 農(nóng)桿菌介導的玉米幼胚遺傳轉化 體系的建立 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 梁海生 轉 基因抗蟲玉米的農(nóng)藝性狀分析 綿陽 西南科技大學 季麗麗 玉米遺傳轉化體系的優(yōu)化及 基因轉化玉米的 研究 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學 王國莉 丘裕雄 范紅英 轉基因玉米實驗室 檢測體系的 優(yōu)化及應用 基因組學與應用生物學 趙邯鄲 轉植酸酶基因玉米的獲得及后代鑒定分析 長 春 吉林農(nóng)業(yè)大學 錢雪艷 蘇穎 姚瑤等 農(nóng)桿菌介導抗蟲基因 轉 化大豆的研究 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 王江 武奉慈 劉新穎 等 轉基因抗蟲耐除草劑復合性狀 玉米 雙抗 對亞洲玉米螟的抗性及對草甘膦的耐 受性研究 植物保護學 李國平 劉冰 黃建榮 等 轉聚合 和 基因抗蟲耐除草劑玉米的田間抗性評價 植 物保護 任夢云 陳彥君 關瀟 轉 基因抗蟲玉米對無脊椎 動物多樣性影響研究 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報 陳亮 黃慶華 孟麗輝 等 轉基因作物飼用安全性評價研 究進展 中國農(nóng)業(yè)科學 宋新元 張欣芳 于壯 等 轉基因植物環(huán)境安全評價策略 生物安全學報 孫越 劉秀霞 李麗莉 等 抗亞洲玉米螟 抗草甘膦轉基因 玉米的培育 農(nóng)業(yè)生物技術學報 宋福平 蘇云金芽孢桿菌 和 基因的研究 長春 中國農(nóng)業(yè)科學院 宋苗 轉 基因抗蟲玉米的遺傳穩(wěn)定性分析及農(nóng) 藝性狀觀察 綿陽 西南科技大學 王文治 胡天嬌 楊本鵬 等 轉 基因抗蟲甘蔗植株 的培育 分子植物育種 吳楠 大豆查爾酮還原酶基因 干擾表達載體的 構建及遺傳轉化 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學 李暉 玉米 基因的克隆及功能分析 長 春 吉林農(nóng)業(yè)大學 劉雙 陳昭汀 董昭旭 等 擬南芥抗寒基因 的克隆及 功能分析 西北農(nóng)林科技大學學報 李冬雪 田崇兵 劉長華 等 轉 基因抗蟲超級粳稻 田間目的基因表達及抗螟蟲性研究 中國農(nóng)學通報 汪小福 陳笑蕓 張小明 等 轉 基因水稻分子特征 及其特異性 檢測方法 遺傳 張林 新抗蟲基因 的克隆及其在大豆中的遺 傳轉化和功能鑒定 長春 吉林農(nóng)業(yè)大學 魏紀珍 和 防治棉鈴蟲的交互抗性和互作 北京 中國植物保護學會 植?？萍紕?chuàng)新與農(nóng)業(yè)精準 扶貧 中國植物保護學會 年學術年會論文集 中 國植物保護學會 中國植物保護學會 李靜靜 含 和 雙基因的抗蟲轉基因水稻的 研究 杭州 浙江大學 責任編輯 林海濤