中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2022 38 33 116 123 ChineseAgriculturalScienceBulletin 辣椒根腐病菌拮抗鏈霉菌的篩選及 16 S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析 努爾夏提 努爾買買提 李煥宇 楊成德 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室 蘭州730070 摘 要 為 獲 得 對(duì) 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 鐮 孢 菌 Fusarium oxysporum 有 拮 抗 作 用 的 鏈 霉 菌 并 明 確 其 抑 菌 效 果 與 分 類 情 況 以 尖 鐮 孢 菌 為 指 示 菌 采 用 平 板 對(duì) 峙 法 篩 選 結(jié) 合 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 法 測(cè) 定 抑 菌 率 采 用16S rRNA 基 因 序 列 進(jìn) 行 聚 類 分 析 初 篩 獲 得8 株 有 拮 抗 作 用 的 鏈 霉 菌 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 中 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 為 45 18 62 81 對(duì) 其 他4 種 根 腐 病 菌 的 抑 菌 率 為28 51 60 00 菌 株ZY12 53b 的 拮 抗 作 用 最 好 對(duì) 5 種 根 腐 病 菌 的 抑 菌 率 均 大 于50 菌 株MDI2 4 和ZY12 23a 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 三 線 鐮 孢 菌 的 拮 抗 作 用 最 強(qiáng) 抑 菌 率 均 大 于60 16SrRNA 基 因 序 列 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 中 8 株 鏈 霉 菌 聚 在5 個(gè) 不 同 的 分 支 中 且 其 中2 個(gè) 分 支 很 可 能 為 該 屬 潛 在 的 新 種 本 研 究 獲 得 鏈 霉 菌 屬8 個(gè) 拮 抗 菌 株 至 少 包 括5 個(gè) 種 其 中3 個(gè) 菌 株 拮抗效果較好 具挖掘利用價(jià)值 關(guān)鍵詞 鏈霉菌 尖鐮孢菌 篩選 系統(tǒng)發(fā)育分析 中圖分類號(hào) S311 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 論文編號(hào) casb2022 0027 Antagonistic Streptomyces Against Pepper Root Rot Pathogen Fusarium oxysporum Screening and Phylogenetic Analysis of 16S rRNA Gene Sequence Nuerxiati Nuermaimaiti LI Huanyu YANG Chengde College of Plant Protection Gansu Agricultural University Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province Lanzhou 730070 Abstract In order to obtain Streptomyces strains with antagonistic effect on Fusarium oxysporum causing pepper root rot and clarify their antagonistic effect and classification F oxysporum was used as the indicator strain to screen by plate confrontation method The inhibition rate wa s determined by mycelial growth rate method Phylogenetic analysis was conducted based on 16 S rRNA gene sequence In this study eight antagonistic Streptomyces strains were obtained by primary screening The results of confrontation culture showed that the inhibition rate against F oxysporum was 45 18 62 81 and the inhibition rate against the other four root rot fungi was 28 51 60 00 Among them the strain ZY 12 53 b showed the best antagonistic effect with more than 50 inhibition rate against five root rot fungi The fermentation filtrates of strains MDI 2 4 and ZY 12 23 a had the highest antagonistic effect on F tricinctum and the inhibition rates were both more than 60 In the phylogenetic tree of 16 S rRNA gene sequence the eight antagonistic Streptomyces strains clustered into five different branches and two of them were likely to be potential new species In this study eight antagonistic Streptomyces strains belonging to at least five species were obtained among which three strains showed satisfied antagonistic effect with the value of potential exploration Keywords Streptomyces Fusarium oxysporum screening phylogenetic analysis 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 基于形態(tài)特征和譜系相合性系統(tǒng)發(fā)育物種識(shí)別的甘肅省辣椒鐮刀菌根部病害病原菌分類 31960009 第 一 作 者 簡(jiǎn) 介 努 爾 夏 提 努 爾 買 買 提 男 1996 年 出 生 新 疆 伊 犁 人 在 讀 碩 士 研 究 生 研 究 方 向 資 源 利 用 和 植 物 保 護(hù) 通 信 地 址 730070 甘 肅 省 蘭 州市安寧區(qū)營(yíng)門村1 號(hào) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) Tel 15652323299 E mail 784436461 通 訊 作 者 李 煥 宇 女 1984 年 出 生 河 南 新 鄉(xiāng) 人 講 師 博 士 研 究 方 向 植 物 病 原 真 菌 分 類 學(xué) 與 植 物 病 害 生 物 防 治 通 信 地 址 730070 甘 肅 省 蘭 州 市 安 寧 區(qū) 營(yíng) 門 村1 號(hào) 甘 肅 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) Tel 0931 7632161 E mail 648372453 楊 成 德 男 1975 年 出 生 甘 肅 武 都 人 教 授 博 士 研 究 方 向 植 物 病害及微生物 通信地址 730070 甘肅省蘭州市安寧區(qū)營(yíng)門村1 號(hào) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) Tel 0931 7640744 E mail yangcd 收稿日期 2022 01 17 修回日期 2022 03 28 0 引言 近 年 來(lái) 隨 著 中 國(guó) 保 護(hù) 地 栽 培 的 發(fā) 展 和 作 物 的 常 年連作 土傳病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重 給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán) 重 損 失 1 生 物 防 治 由 于 能 夠 顯 著 減 少 農(nóng) 藥 使 用 量 有 效 保 障 糧 食 和 蔬 果 等 農(nóng) 產(chǎn) 品 的 安 全 生 產(chǎn) 有 利 于 恢 復(fù) 土 壤 生 態(tài) 系 統(tǒng) 以 及 保 護(hù) 生 物 多 樣 性 具 有 顯 著 的 經(jīng) 濟(jì) 效 益 社 會(huì) 效 益 和 生 態(tài) 效 益 2 因 而 利 用 土 壤 中 的 微 生 物 對(duì) 土 傳 病 害 進(jìn) 行 生 物 防 治 受 到 研 究 者 的 關(guān) 注 3 其 中 鏈 霉 菌 屬 Streptomyces 是 研 究 最 多 的 拮 抗 微 生 物 之 一 該 屬 的 物 種 能 夠 產(chǎn) 生 許 多 具 有 生 物 活 性 的 次 級(jí)代謝產(chǎn)物 對(duì)土壤中的植物病原物有抑制作用 對(duì)植 物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用 4 由 鐮 孢 菌 屬 Fusarium 引 起 的 根 腐 病 是 辣 椒 生 產(chǎn) 中的常見(jiàn)病害 在設(shè)施辣椒栽培中由于多年重茬連作 往 往 發(fā) 病 比 較 重 5 鐮 孢 菌 屬 的 多 個(gè) 種 均 可 引 起 辣 椒 根 腐 病 包 括 茄 鐮 孢 菌 F solani 5 尖 鐮 孢 菌 F oxysporum 6 和 輪 枝 鐮 孢 菌 F verticillioides 7 已 報(bào) 道的對(duì)辣椒根腐病菌有拮抗作用的微生物多為真菌和 細(xì) 菌 如 短 密 木 霉 Trichoderma brevicompactum 8 黃 綠 木 霉 T aureoviride 9 和 枯 草 芽 胞 桿 菌 Bacillus subtilis 10 等 小 麥 根 腐 病 和 莖 基 腐 病 也 是 小 麥 生 產(chǎn) 中 的 重 要 病 害 根 腐 病 由 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 Bipolaris sorokiniana 引 起 11 莖 基 腐 病 則 由 包 括 三 線 鐮 孢 菌 F tricinctum 在 內(nèi) 的 鐮 孢 菌 屬 多 個(gè) 種 引 起 12 目 前 對(duì) 小 麥 根 腐 病 和 莖 基 腐 病 的 防 治 仍 以 化 學(xué) 防 治 為 主 13 也 有研究者嘗試用分離自植物的天然物質(zhì)抑制小麥根腐 病 14 目 前 有 關(guān) 用 拮 抗 鏈 霉 菌 防 治 辣 椒 根 腐 病 以 及 小 麥根腐病和莖基腐病的報(bào)道比較少 本研究在前期從 辣 椒 田 土 壤 中 分 離 得 到 一 批 鏈 霉 菌 菌 株 的 基 礎(chǔ) 上 以 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 鐮 孢 菌 F oxysporum 為 指 示 菌 篩 選 優(yōu) 良 的 拮 抗 鏈 霉 菌 并 測(cè) 定 其 對(duì)5 種 辣 椒 和 小 麥 根 腐 病 菌 的 抑 制 作 用 基 于16S rRNA 基 因 序 列 分 析 所 得 拮 抗 鏈 霉 菌 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 關(guān) 系 以 期 獲 得 對(duì) 辣 椒 和 小 麥 根 腐 病 菌 有 拮 抗 作 用 的 鏈 霉 菌 菌 株 為 辣 椒 和 小 麥 根 腐病的生物防治奠定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 供試鏈霉菌菌株 從甘肅省蘭州市 武威市和張掖 市辣椒根腐病發(fā)生較重的大棚或露地田塊的健康植株 根 際 土 樣 分 離 得 到 的 鏈 霉 菌 菌 株357 株 保 存 于 甘 肅 農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室 供 試 病 原 真 菌 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 鐮 孢 菌 Fusarium oxysporum 菌 株3 4 茄 鐮 孢 菌 F solani 菌 株45 3 輪 枝 鐮 孢 菌 F verticillioides 菌 株52 5 小 麥 莖 基 腐 病 菌 三 線 鐮 孢 菌 F tricinctum 菌 株J4 2c 小 麥 根 腐 病 菌 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 Bipolaris sorokiniana 菌 株B2 5a 保 存 于 甘 肅 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 植 物 保 護(hù) 學(xué) 院 植 物 病 原 真 菌 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 室 高 氏 一 號(hào) 培 養(yǎng) 基 淀 粉20 0g 瓊 脂 粉15g KNO3 1 0 g K2HPO4 3H2O 0 5 g MgSO4 7H2O 0 5 g NaCl 0 5 g FeSO4 7H2O 0 01 g 蒸 餾 水1000 mL pH 7 2 7 4 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 Potato DextroseAgar PDA 葡 萄 糖20g 馬 鈴 薯200g 瓊 脂 粉15g 自 來(lái) 水 1000mL 高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基 成分同高氏一號(hào)培養(yǎng)基 不 加瓊脂粉 本試驗(yàn)于2020 年10 月至2021 年12 月在甘肅農(nóng)業(yè) 大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 1 2 主要儀器 S1000 梯 度PCR 儀 美 國(guó)Bio Rad 公 司 生 產(chǎn) LRH 70 型 生 化 培 養(yǎng) 箱 上 海 一 恒 科 學(xué) 儀 器 有 限 公 司 生 產(chǎn) SW CJ 2FD 型 潔 凈 工 作 臺(tái) 蘇 凈 集 團(tuán) 蘇 州 安 泰 空 氣 技 術(shù) 有 限 公 司 生 產(chǎn) LDXZ 50KBS 型 立 式 高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋 上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn) 1 3 方法 1 3 1 鏈霉菌和植物病原真菌的活化培養(yǎng) 鏈霉菌的活 化 培 養(yǎng) 將4 保 存 的 鏈 霉 菌 菌 株 接 種 于 高 氏 一 號(hào) 培 養(yǎng) 基 平 板 上 28 黑 暗 培 養(yǎng)7 天 用 直 徑5mm 的 無(wú) 菌 打孔器打取菌餅備用 植 物 病 原 真 菌 活 化 培 養(yǎng) 將4 保 存 的 植 物 病 原 真 菌 接 種 于PDA 平 板 上 25 黑 暗 培 養(yǎng)5 天 用 直 徑 5mm 的無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅備用 1 3 2 拮 抗 鏈 霉 菌 的 初 篩 以 尖 鐮 孢 菌 菌 株3 4 為 指 示 病 原 真 菌 采 用 平 板 對(duì) 峙 法 15 篩 選 有 拮 抗 效 果 的 菌 株 在PDA 平 板 背 面 十 字 交 叉 做 好 標(biāo) 記 后 在 中 心 點(diǎn) 接 入 病 原 菌 的 菌 餅 中 心 點(diǎn) 四 周 等 距 2 2 cm 接 種 同 一 株 鏈 霉 菌 的 菌 餅 以 只 接 種 病 原 菌 菌 餅 的PDA 平 板 作 為 對(duì) 照 3 次 重 復(fù) 28 黑 暗 培 養(yǎng)5 天 后 用 十 字 交 叉 法 測(cè) 量 病 原 菌 的 菌 落 直 徑 抑 菌 率 按 公 式 1 計(jì) 算 抑菌率 對(duì)照菌落 平均直徑 處理 菌 落平均 直徑 對(duì)照菌落平均 直徑 5 m m 1 0 0 1 努 爾 夏 提 努 爾 買 買 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 鏈 霉 菌 的 篩 選 及16S rRNA 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 117中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 1 3 3 拮抗鏈霉菌的抑菌譜測(cè)定 對(duì)初篩拮抗效果較好 的 鏈 霉 菌 菌 株 測(cè) 定 其 對(duì)5 種 供 試 辣 椒 和 小 麥 根 腐 病 菌 的 抑 制 作 用 采 用 平 板 對(duì) 峙 法 15 測(cè) 定 鏈 霉 菌 菌 體 的 抑 菌 效 果 采 用 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 法 16 測(cè) 定 鏈 霉 菌 發(fā) 酵 濾 液的抑菌效果 平板對(duì)峙法同1 2 2 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 法 在 活 化 培 養(yǎng) 的 鏈 霉 菌 平 板 上 打 取5mm 菌 餅 放 入 裝 有100mL 無(wú) 菌 高 氏 一 號(hào) 培 養(yǎng) 液 的150mL 三 角 瓶 中 每 個(gè) 三 角 瓶 放 入5 個(gè) 菌 餅 28 180r min 振 蕩 培 養(yǎng)7 天 將 搖 培 的 菌 液4 10000r min 離 心15 min 上 清 液 用0 22 m 的 微 孔 濾 膜 過(guò) 濾 取 10 mL 濾 液 與90 mL 滅 菌 并 冷 卻 至45 左 右 的PDA 培 養(yǎng) 基 混 勻 后 倒 平 板 得 到 發(fā) 酵 液 與PDA 比 例1 9 的 含 發(fā) 酵 液 平 板 以 無(wú) 菌 水 和PDA 比 例1 9 制 成 的 平 板 作 為 對(duì) 照 3 次 重 復(fù) 在 平 板 中 央 以 菌 絲 面 向 下 的 方 式 放 置 供 試 植 物 病 原 真 菌 的 菌 餅 5mm 25 黑 暗 培 養(yǎng)5 天 后 測(cè) 量 病 原 真 菌 的 菌 落 直 徑 測(cè) 量 方 法 和 抑 菌率計(jì)算同1 2 2 采 用Excel2010 對(duì) 所 得 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 通 過(guò)SPSS 軟 件 用Ducan 新 復(fù) 極 差 法 對(duì) 抑 菌 率 進(jìn) 行 差 異 顯 著 性 分 析 P 0 05 1 3 4 16S rRNA 基 因 序 列 分 析 用OMEGA 柱 式 細(xì) 菌 基 因 組 抽 提 試 劑 盒 提 取 拮 抗 鏈 霉 菌 菌 株 的 基 因 組 DNA 以 通 用 引 物 27F 5 AGTTTGATCCTGGCTC AG 3 和1492r 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 擴(kuò) 增16S rRNA 基 因 片 段 PCR 反 應(yīng) 體 系 25 L 為 模 板DNA0 5 L 上 下 游 引 物 各0 5 L dNTPs1 0 L 10 緩 沖 液2 5 L Taq 酶0 2 L ddH2O19 8 L PCR 反 應(yīng) 程 序 為 94 預(yù) 變 性4 min 之 后94 變 性45 s 55 退 火45 s 72 延 伸1 min 30 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸 10min PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 經(jīng)1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 后 送交北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行雙向 測(cè)序 對(duì) 測(cè) 序 所 得 圖 譜 用BioEdit v 7 2 5 17 進(jìn) 行 校 正 和 拼 接 以 拼 接 序 列 作 為 查 詢 序 列 在GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 用nucleotide BLAST 搜 索 相 似 性 高 的 序 列 根 據(jù) 相 似 性 序 列 的 物 種 名 稱 查 詢 并 下 載 該 物 種 模 式 菌 株 的 16SrRNA 基 因 序 列 與 本 研 究 所 得 鏈 霉 菌 菌 株 的 序 列 一起 用BioEditv 7 2 5 17 進(jìn)行比對(duì)和手動(dòng)校正 用 鄰 接 法 Neighbor joining NJ 和 最 大 簡(jiǎn) 約 法 Maximum Parsimony MP 將 比 對(duì) 后 的 序 列 用PAUP version 4 0a 18 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 以 解 纖 維 素 熱 酸 菌 Acidothermus cellulolyticus AJ007290 和 糖 多 孢 紅 霉 菌 Saccharopolysporaerythraea NR 074095 為外群 本 研 究 所 得 拮 抗 鏈 霉 菌 菌 株 的16SrRNA 基 因 序 列 提 交 至GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 菌 株HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 的 GenBank 登 錄 號(hào) 分 別 為 ON248956 ON248957 ON248963 ON248959 ON248958 ON248960 ON248962 ON248961 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗鏈霉菌的初篩 以 尖 鐮 孢 菌 菌 株3 4 為 指 示 菌 初 篩 得 到8 株 拮 抗 效 果 較 好 的 鏈 霉 菌 菌 株 分 別 為HS1 3 HS5 48a2 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 和 HS12 10 對(duì)峙培養(yǎng)的抑菌率均在45 以上 表1 2 2 拮抗鏈霉菌的抑菌譜測(cè)定 2 2 1 平 板 對(duì) 峙 法 平 板 對(duì) 峙 法 試 驗(yàn) 結(jié) 果 表1 圖1 表 明 鏈 霉 菌 菌 株ZY12 53b 對(duì)5 種 供 試 辣 椒 和 小 麥 根 腐 病 菌 的 拮 抗 效 果 最 好 抑 菌 率 均 高 于50 且 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 三 線 鐮 孢 菌 和 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 的 抑 菌 率 均 大 于 60 顯 著 高 于 對(duì) 茄 鐮 孢 菌 和 輪 枝 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 分 別 為50 81 和53 82 其 余7 株 鏈 霉 菌 均 對(duì) 部 分 植 物 病 原 菌 有 較 好 的 拮 抗 作 用 其 中 菌 株HS1 3 對(duì) 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 的 拮 抗 效 果 最 好 抑 菌 率 為57 46 菌 株 HS12 10 和ZY12 35b 均 對(duì) 三 線 鐮 孢 菌 的 拮 抗 效 果 最 表 1 平板對(duì)峙法測(cè)定 8 株鏈霉菌對(duì) 5 種辣椒和小麥根腐病菌的抑制作用 注 表中同列數(shù)字后的不同小寫字母表示差異顯著 P 0 05 植物病原真菌 尖鐮孢菌F oxysporum 茄鐮孢菌F solani 輪枝鐮孢菌F verticillioides 三線鐮孢菌F tricinctum 麥根腐平臍蠕孢B sorokiniana 鏈霉菌菌株 HS1 3 45 18b 31 71c 28 51c 46 35b 57 46a HS5 48a2 54 00a 36 54bc 30 89c 55 87a 51 11a HS12 10 49 86b 25 20d 36 14c 64 44a 49 21b ZY12 7a 47 11a 34 55b 34 14b 50 48a 51 43a ZY12 23a 50 69ab 37 80c 44 17bc 51 75ab 57 78a ZY12 35b 46 56b 36 99c 40 16c 63 17a 46 57b ZY12 53b 62 81a 50 81b 53 82b 61 58a 60 00a MDI2 4 50 96a 28 45c 41 36b 49 84ab 47 30ab 118好 抑 菌 率 分 別 為64 44 和63 17 菌 株HS5 48a2 和 ZY12 7a 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 三 線 鐮 孢 菌 和 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 的 抑 菌 率 高 于45 顯 著 高 于 對(duì) 茄 鐮 孢 菌 和 輪 枝 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 低 于40 菌 株ZY12 23a 和MDI2 4 對(duì) 尖鐮孢菌 輪枝鐮孢菌 三線鐮孢菌和麥根腐平臍蠕孢 的 抑 菌 率 高 于40 均 顯 著 高 于 對(duì) 茄 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 低于40 由 以 上 結(jié) 果 可 知 在 平 板 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 中8 株 鏈 霉 菌 對(duì) 供 試5 種 根 腐 病 菌 均 有 一 定 的 拮 抗 效 果 但 拮 抗 效 果 存 在 差 異 菌 株ZY12 53b 的 拮 抗 效 果 最 好 供 試 的 5 種 植 物 病 原 真 菌 中 8 株 鏈 霉 菌 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 三 線 鐮 孢菌和麥根腐平臍蠕孢的拮抗效果高于對(duì)茄鐮孢菌和 輪枝鐮孢菌的拮抗效果 2 2 2 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 法 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 法 試 驗(yàn) 結(jié) 果 表 2 圖2 表 明 菌 株MDI2 4 和ZY12 23a 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì)5 種 辣 椒 和 小 麥 根 腐 病 菌 都 有 一 定 的 拮 抗 效 果 以 對(duì) 三 線 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 最 高 分 別 為68 48 和62 22 顯 著 高 于 對(duì) 其 他4 種 病 原 菌 的 抑 菌 率 菌 株MDI2 4 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 也 有 較 好 的 抑 制 作 用 抑 菌 率 為 40 77 菌 株HS12 10 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 也 有 較 好 的 拮 抗 效 果 抑 菌 率 為48 18 對(duì) 鐮 孢 菌 屬4 個(gè) 種 則 基 本 無(wú) 抑 制 作 用 其 他5 株 鏈 霉 菌 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 各 供 試 病 原 菌 的 抑 菌 率 均 低 于40 但 不 同 鏈 霉 菌 菌 株 對(duì) 各 病 原 菌 的 抑 菌 率 仍 存 在 顯 著 差 異 菌 株 ZY12 7a 和ZY12 53b 的發(fā) 酵濾 液都 對(duì)麥 根腐 平臍 蠕孢 的 抑 菌 率 最 高 分 別 為38 87 和35 23 對(duì) 鐮 孢 菌 屬 4 個(gè) 種 則 無(wú) 抑 制 作 用 甚 至 還 能 促 進(jìn) 三 線 鐮 孢 菌 的 生 長(zhǎng) 菌 株ZY12 35b 對(duì) 三 線 鐮 孢 菌 和 麥 根 腐 平 臍 蠕 的 抑 菌 率 都 大 于30 但 對(duì) 其 他3 種 病 原 菌 抑 制 作 用 較 弱 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 各 病 原 菌 字母代表供試植物病原真菌 數(shù)字代表對(duì)照和鏈霉菌菌株 a 尖鐮孢菌 b 茄鐮孢菌 c 輪枝鐮孢菌 d 三線鐮孢菌 e 麥根腐平臍蠕孢 1 9 CK HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 圖 1 平板對(duì)峙法測(cè)定 8 株鏈霉菌對(duì) 5 種辣椒和小麥根腐病菌的抑制效果 表 2 菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定 8 株鏈霉菌對(duì) 5 種辣椒和小麥根腐病菌的抑制作用 供試植物病原真菌 尖鐮孢菌F oxysporum 茄鐮孢菌F solani 輪枝鐮孢菌F verticillioides 三線鐮孢菌F tricinctum 麥根腐平臍蠕孢B sorokiniana 鏈霉菌菌株 HS1 3 23 98ab 16 96ab 0 31c 31 93a 12 96bc HS5 48a2 25 18ab 19 73ab 8 40b 29 00a 34 01a HS12 10 4 56b 2 07b 2 49b 0 32b 48 18a ZY12 7a 6 95b 0 00b 3 40bc 15 03c 38 87a ZY12 23a 24 94bc 11 07d 13 40cd 62 22a 37 25b ZY12 35b 16 55c 4 50d 7 16d 37 79a 30 37b ZY12 53b 6 47b 2 41b 0 93b 23 11c 35 23a MDI2 4 40 77b 24 57c 18 07d 68 48a 29 16c 注 表中同列數(shù)字后的不同小寫字母表示差異顯著 P 0 05 努 爾 夏 提 努 爾 買 買 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 鏈 霉 菌 的 篩 選 及16S rRNA 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 119中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 的抑制效果都較弱 2 3 拮抗鏈霉菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 用 于 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 的16SrRNA 基 因 序 列 比 對(duì) 文件包括外群2 個(gè) 內(nèi)群分類單元62 個(gè) 其中本研究篩 選 得 到 的 鏈 霉 菌 菌 株8 個(gè) 從GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 下 載 的 鏈霉菌序列54 個(gè) 比對(duì)序列共1356 個(gè)特征堿基 其中 1098 個(gè) 為 保 守 位 點(diǎn) 117 個(gè) 為 非 簡(jiǎn) 約 信 息 位 點(diǎn) 141 個(gè) 為 簡(jiǎn) 約 信 息 位 點(diǎn) 構(gòu) 建 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 如 圖3 所 示 鄰 接 法 NJ 和 最 大 簡(jiǎn) 約 法 MP 所 得 大 于70 的 自 展 支 持 率分別標(biāo)注于各分支的斜杠前和斜杠后 由 圖3 可 知 所 有 的 鏈 霉 菌 菌 株 以100 的 支 持 率 聚在一起 本研究所得8 株拮抗鏈霉菌分別聚在5 個(gè)分 支 中 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 與 天 藍(lán) 黃 鏈 霉 菌 S coelicoflavus 以100 的 支 持 率 聚 為 一 個(gè) 分 支 但 這 兩 個(gè) 菌 株 又 以100 的 支 持 率 單 獨(dú) 聚 為 一 個(gè) 子 分 支 兩 個(gè) 天 藍(lán) 黃 鏈 霉 菌 菌 株 也 以100 的 支 持 率 單 獨(dú) 聚 為 一 個(gè) 子 分 支 表 明 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 很 可 能 代 表 了 鏈 霉 菌 屬 內(nèi) 與S coelicoflavus 親 緣 關(guān) 系 最 近 的 一 個(gè) 新 種 菌 株 ZY12 23a 和 ZY12 7a 與 S maritimus S rochei S vinaceusdrappus 以100 的 支 持 率 聚 為 一 個(gè) 子 分 支 表 明 這 兩 個(gè) 菌 株 與 分 離 自 海 洋 的S maritimus 以 及 屬 于 婁 徹 氏 鏈 霉 菌 類 群 的 S rochei 和 S vinaceusdrappus 親 緣 關(guān) 系 最 近 菌 株ZY12 35b 與 黃 白 鏈 霉 菌 S albidoflavus 產(chǎn) 水 鏈 霉 菌 S hydrogenans 淺 紫 鏈 霉 菌 S violascens 和 桑 氏 鏈 霉 菌 S sampsonii 聚 為 一 個(gè) 分 支 NJ 和MP 的 支 持 率 分 別 為96 和95 這4 個(gè) 種 的 鏈 霉 菌 又 單 獨(dú) 聚 為 一 個(gè) 子 分 支 NJ 支 持 率 為98 但 沒(méi) 有 得 到 高 的MP 支 持 率 表 明 菌 株ZY12 35b 很 可 能 代 表 了 鏈 霉 菌 屬 內(nèi) 的 一 個(gè) 潛 在 新 種 與 S albidoflavus S hydrogenans S violascens 和 S sampsonii 的 親 緣 關(guān) 系 最 近 菌 株 HS12 10 與S clavifer S mutomycini 聚 在 一 起 NJ 和 MP 支 持 率 分 別 為96 和87 它 們 又 與S finlayi 以 100 的 支 持 率 聚 在 一 起 表 明HS12 10 與 這3 種 鏈 霉 菌 的 親 緣 關(guān) 系 最 近 菌 株MDI2 4 和ZY12 53b 與S lavendulae S sporoverrucsus S goshikiensis S roseochromogenus S colombiensis S nojiriensis S xanthophaeus S spororaveus S cinnamonensis S virginiae 聚 為 一 個(gè) 大 的 分 支 NJ 和MP 支 持 率 分 別 為 100 和90 雖 然 內(nèi) 部 也 形 成 一 些 子 分 支 但 都 缺 乏 支 持 率 表 明 這2 個(gè) 菌 株 與 上 述10 種 鏈 霉 菌 的 關(guān) 系 最 近 但 根 據(jù)16S rRNA 基 因 尚 不 足 以 將 各 個(gè) 種 區(qū) 分 開(kāi) 來(lái) 3 討論與結(jié)論 利用拮抗微生物防治土傳病害是近年來(lái)的研究熱 點(diǎn) 3 本 研 究 篩 選 得 到 了 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 等5 種 根 腐 病 菌 有 拮 抗 作 用 的 鏈 霉 菌8 株 都 具 有 生 物 防 治 的 潛 力 且 8 株 鏈 霉 菌 在16SrRNA 基 因 序 列 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 中 聚 在5 個(gè) 不 同 的 分 支 中 表 明 土 壤 中 拮 抗 鏈 霉 菌 資 源 不 僅 數(shù) 量 豐 富 還 具 有 很 高 的 物 種 多 樣 性 這 與 許 多 學(xué) 者 對(duì) 字母代表供試植物病原真菌 數(shù)字代表對(duì)照和鏈霉菌菌株 a 尖鐮孢菌 b 茄鐮孢菌 c 輪枝鐮孢菌 d 三線鐮孢菌 e 麥根腐平臍蠕孢 1 9 CK HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 圖 2 菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定 8 株鏈霉菌對(duì) 5 種辣椒和小麥根腐病菌的抑制效果 120鐮 孢 菌 屬 所 致 枯 萎 病 與 根 腐 病 的 生 防 研 究 結(jié) 果 一 致 周 登 博 等 19 報(bào) 道 多 產(chǎn) 色 鏈 霉 菌 S polychromogenes 菌 本研究所得8 株鏈霉菌以粗體指示 各節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示兩種建樹(shù)方法所得該分支的支持率 NJ 法 MP 法 僅標(biāo)注大于70 的分枝 外群為解纖維 素?zé)崴峋?AJ007290 和糖多孢紅霉菌 NR 074095 括號(hào)內(nèi)的數(shù)值指示下載序列的GenBank 登錄號(hào) 菌株號(hào)后的上標(biāo)T 指示模式菌株 標(biāo)尺指示堿基 變化數(shù)目 圖 3 基于 8 個(gè)鏈霉菌菌株 16S rRNA 基因及其相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 努 爾 夏 提 努 爾 買 買 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 鏈 霉 菌 的 篩 選 及16S rRNA 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 121中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 株T3 G 59 對(duì) 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 較 強(qiáng) 的 拮 抗 作 用 李 曉 芳 等 20 篩 選 得 到 了 一 株 對(duì) 苦 瓜 枯 萎 病 菌 有 較 強(qiáng) 抑 制 作 用 的 放 線 菌 菌 株 鑒 定 為S rhizosphaericus 王 皓 等 21 從海泥樣品中分離得到的鏈霉菌屬多個(gè)菌株對(duì)黃瓜枯 萎 病 菌 有 明 顯 的 抑 菌 效 果 圓 圓 等 22 從 青 海 湖 附 近 植 被根系的土壤中篩選得到一株對(duì)黃瓜枯萎病菌抑制效 果 較 好 的 鏈 霉 菌 菌 株S 101 并 鑒 定 為S luridus 牛 世 全 等 23 報(bào) 道 藍(lán) 紫 鏈 霉 菌 S tuirus 對(duì) 引 起 黃 芪 根 腐 病 的 尖鐮孢菌和茄鐮孢菌均有較好的抑制作用 本研究試 驗(yàn) 和 上 述 文 獻(xiàn) 結(jié) 果 都 表 明 土 壤 中 對(duì) 鐮 孢 菌 屬 等 土 傳 植物病原真菌具有生物防治潛能的鏈霉菌資源是相當(dāng) 豐富的 非常值得進(jìn)行研究和挖掘 不同的培養(yǎng)方式可能會(huì)改變拮抗微生物的抑菌效 果 張 大 杉 24 對(duì)2 株 鏈 霉 菌 和1 株 細(xì) 菌 采 用 不 同 的 發(fā) 酵 方 式 培 養(yǎng) 后 測(cè) 定 代 謝 產(chǎn) 物 發(fā) 現(xiàn) 不 同 的 發(fā) 酵 方 式 會(huì) 誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生完全不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物 本研究的 試 驗(yàn) 結(jié) 果 也 證 實(shí) 了 這 一 點(diǎn) 本 試 驗(yàn) 所 得8 株 鏈 霉 菌 在 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 中 的 抑 菌 效 果 基 本 上 都 高 于 發(fā) 酵 濾 液 特 別 是 菌 株ZY12 53b 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 時(shí) 的 抑 菌 率 均 高 于50 但 發(fā) 酵 濾 液 基 本 無(wú) 抑 菌 作 用 菌 株 ZY12 23a 和 MDI2 4 的 發(fā) 酵 濾 液 對(duì) 三 線 鐮 孢 菌 的 抑 菌 率 則 高 于 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 菌 株HS12 10 的 發(fā) 酵 濾 液 與 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 對(duì) 麥 根 腐 平 臍 蠕 孢 的 抑 菌 率 基 本 一 致 這 一 結(jié) 果 表 明 不 同 的 培 養(yǎng) 方 式 的 確 會(huì) 使 拮 抗 鏈 霉 菌 的 抑 菌 效 果 發(fā) 生 改 變 但對(duì)不同菌株的影響存在差異 因此 為了更充分 發(fā) 揮 所 得 拮 抗 鏈 霉 菌 的 抑 菌 作 用 不 同 的 菌 株 應(yīng) 采 用 適 宜 的 培 養(yǎng) 方 式 在 本 研 究 中 菌 株ZY12 53b 適 合 固 體 培 養(yǎng) 菌 株ZY12 23a 和MDI2 4 更 適 合 液 體 培 養(yǎng) 而 菌株HS12 10 則兩種方法都適合 尖 鐮 孢 菌 F oxysporum 和 茄 鐮 孢 菌 F solani 是 土 壤 中 常 見(jiàn) 的 兩 種 鐮 孢 菌 屬 病 原 物 人 們 往 往 希 望 獲 得 對(duì) 二 者 都 具 有 拮 抗 作 用 的 微 生 物 但 實(shí) 際 上 同 一 拮 抗 菌 株 對(duì) 二 者 的 抑 菌 效 果 可 能 存 在 較 大 差 異 王 彥 等 25 以 黃 瓜 枯 萎 病 菌 尖 鐮 孢 菌 黃 瓜 專 化 型 F oxysporumf sp cucumerinum 為 指 示 菌 篩 選 到 一 株 抑 菌 效 果 較 好 的 放 線 菌 菌 株 對(duì) 茄 鏈 格 孢 Alternaria solani 也 有 較 高 的 抑 菌 作 用 但 對(duì) 茄 鐮 孢 菌 F solani 的 抑 菌 效 果 較 低 本 研 究 也 得 到 了 類 似 的 試 驗(yàn) 結(jié) 果 以 尖 鐮 孢 菌 為 指 示 菌 篩 選 得 到 的8 株 鏈 霉 菌 對(duì) 尖 鐮 孢 菌 三線鐮孢菌和麥根腐平臍蠕孢的拮抗效果較好 但 對(duì)茄鐮孢菌和輪枝鐮孢菌的拮抗作用相對(duì)較弱 上述 研究表明 在對(duì)尖鐮孢菌和茄鐮孢菌的生防研究中 有 必 要 以 兩 個(gè) 種 分 別 作 為 指 示 菌 進(jìn) 行 篩 選 有 助 于 獲 得 對(duì)二者拮抗效果較好的生防菌 本 研 究 試 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明 所 得8 株 拮 抗 鏈 霉 菌 對(duì) 尖 鐮 孢