中國農業(yè)科技導報 2022 24 9 50 57 JournalofAgriculturalScienceandTechnology 八仙花萼片有色原生質體游離及應用 張蓋天 祁惠 楊鎖寧 褚志云 袁素霞 劉春 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 北京100081 摘 要 為建立八仙花 Hydrangea macrophylla 有色原生質體游離體系 以八仙花萼片為試驗材料 分別對材 料的預處理方式 酶液組分 酶解時間 純化離心力等影響酶解的關鍵因素進行研究 結果表明 預處理方式 選擇分離花萼片上下表皮法 纖維素酶和離析酶水平分別為4 和0 4 質量體積分數(shù) 甘露醇0 6mol L 1 酶解液加熱冷卻后加入0 1 質量體積分數(shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 酶解2h 低溫離心機4 1426r min 1 離心5min 為最優(yōu)的八仙花萼片原生質體游離條件 利用所建的原生質體游離體系對4個不同品種的八仙花 萼片進行有色原生質體游離 200 鏡下單視野內可獲得13 35個有色的原生質體 對有色原生質體進行液泡 的H 流測定 發(fā)現(xiàn)藍色液泡較粉色液泡H 流的外排趨勢明顯 說明同一八仙花品種藍色液泡的pH高于粉色 液泡 關鍵詞 八仙花 有色原生質體游離 液泡離子流 doi 10 13304 j nykjdb 2021 0372 中圖分類號 S682 1 9 文獻標志碼 A 文章編號 1008 0864 2022 09 0050 08 Isolation and Application of Sepal Colored Protoplast in Hydrangea macrophylla ZHANGGaitian QIHui YANGSuoning CHUZhiyun YUANSuxia LIUChun InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China Abstract In order to establish isolation system of sepals colored protoplast in Hydrangea macrophylla sepals of Hydrangea macrophylla were used as experimental materials The factors influencing enzymolysis were analyzed suchastreatedmethodsofsepals thecomponentsofenzymatichydrolysates enzymolysistime centrifugalspeeds etc Theresultsshowedthattheoptimalprocedureofenzymolysiswasfollowedwiththetoringepidermisofsepals 4 w v cellulase 0 4 w v macerozyme 0 6 mol L 1 mannitol and 0 1 w v BSA 10 mmol L 1 CaCl 2 enzymolysisfor2h and1426r min 1 centrifugeat4 Thissystemwasusedtoisolatesepalcoloredprotoplastof4 Hydrangea macrophylla cultivars and 13 35 protoplasts per microscope vision at 200 were obtained H flux measurementshowedthattheH effluxingtendencyofbluevacuoleswasmoreobviousthanthatofpinkvacuolesin thesamecultivar itindicatedthatpHinbluevacuoleswashigherthanthatinpinkvacuolesofsamecultivar Key words Hydrangea macrophylla coloredprotoplastisolation vacuoleionflux 八仙花 Hydrangea macrophylla 又名繡球花 為虎耳草科八仙花屬植物 觀賞部位為大部分不 孕花及其萼片組成的傘狀頂生花序 1 原產于中 國 日本等國家 2 3 八仙花品種眾多 花色豐富 花型繁多 在歐美地區(qū)被廣泛應用于庭院綠化 切 花等 近年來 八仙花盆栽 切花和干花也受到越 來越多中國消費者的喜愛 八仙花具有特殊的栽培學特性 即在合適的 土壤pH條件下 部分品種施鋁處理后花萼片顏色 會由原本的粉色變?yōu)樗{色 4 因此 八仙花花色變 收稿日期 2021 05 06 接受日期 2021 09 22 基金項目 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項 IVF BRF2020021 中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目 CAAS ASTIP 2020 IVFCAAS 聯(lián)系方式 張蓋天E mail gaitianzhang 通信作者袁素霞E mail yuansuxia 劉春E mail liuchun 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質體游離及應用 化機理逐漸成為研究熱點 八仙花萼片有色細胞 主要集中于花萼片上表皮下部和葉肉細胞上部的 組織中 5 為方便對有色細胞獨有的生理與分子 特性進行深入研究 揭示花器官有色細胞中特有 的膜結構 蛋白結構及功能 6 10 需將組織中的有 色細胞與無色細胞有效分離 因此 必需建立八仙 花萼片有色原生質體游離體系 原生質體是細胞 除去細胞壁后所得的由膜包裹的結構 包括膜結 構 液泡 細胞核 質體及線粒體等 其中 液泡是 植物儲藏色素類物質的器官 成熟細胞的液泡體 積約占細胞體積的90 11 即在顯微鏡下觀察到 的有色細胞液泡內含有色素類物質 而無色細胞 液泡內不含色素類物質 原生質體用途廣泛 主要用于瞬時表達 如亞 細胞定位 12 原生質體融合 13 等 其游離受諸多因素 影響 主要包括植物組織材料類型 14 預處理方 式 12 酶濃度及配比 15 滲透壓 16 酶解時間 17 和離心 力 18 等 目前 在擬南芥 Arabidopsisthaliana 19 和水 稻 Oryza sativa 20 中已建立了成熟的原生質體游離 體系 而關于八仙花有色原生質體游離體系的研 究尚未見報道 極大地限制了八仙花花色形成機理 的相關研究 因此 本研究擬建立高效的八仙花有 色細胞原生質體游離體系 并應用于不同品種八仙 花萼片的原生質體游離 以期為后續(xù)八仙花有色細 胞瞬時轉化相關研究 細胞水平上的生理生化研究 以及單細胞測序奠定基礎 1 材料與方法 1 1 供試材料 本研究選用種植于中國農業(yè)科學院試驗基地 的4個八仙花 Hydrangea macrophylla 品種 Bailmer BabyBlue Bela 和 Duro 進行研究 所有材料均 選用盛花期萼片 其中 Bailmer BabyBlue 和 Bela 在不施鋁栽培條件下花萼片呈粉色 施鋁栽 培條件下花萼片呈藍色 Duro 在施鋁和不施鋁栽 培條件下萼片顏色變化較小 基本均呈品紅色 1 2 試劑和儀器 試 劑 纖 維 素 酶 cellulase 離 析 酶 macerozymeR 10 甘露醇 D mannitol 嗎啉乙 磺酸 morpholineethylsulfonicacid MES 三羥甲 基氨基甲烷 Tris 牛血清蛋白 bovine serum albumin BSA KCl NaCl MgSO 4 7H 2 O 乙二醇雙 2 氨基乙基醚 四乙酸 ethyleneglycoltetraacetic acid EGTA 和甘油 glycerol 購自于北京拜爾迪 生物技術有限公司 聚 L 賴氨酸 poly L lysine 購 自于西格瑪奧德里奇貿易有限公司 CaCl2購自 于國藥集團化學試劑有限公司 儀器 電子天平 BSM 220 4 上海卓精電子科 技有限公司 恒溫震蕩儀 MQT 60R 上海旻泉儀 器有限公司 離心機 BY 80C 北京白洋醫(yī)療器 械有限公司 低溫離心機 1 14K Sigma 倒置顯 微鏡 DMIL LED Leica 非損傷微測儀 NMT YG 100 Younger 1 3 原生質體游離 取盛花期萼片0 8 1 0g 經預處理后 立即移 至含有10mL酶解液的離心管中 之后 將離心管 放置在恒溫震蕩儀 28 40r min 1 內進行酶解 待酶解后 將混合液置于200目篩網過濾殘渣 所 得濾液倒入燒杯中 將所得濾液移至10mL離心管 中 并用改良后的W5洗液 19 154mmol L 1 NaCl 125mmol L 1 CaCl 2 5mmol L 1 KCl和4mmol L 1 MES TrispH6 3 滅菌 4 保存 輕柔沖洗濾網上 的殘渣及燒杯 沖洗后的液體移入離心管中 2000r min 1 離心5min 棄上清 沉淀由W5洗液重 懸后移至1 5mL離心管中 低溫 4 離心5min 棄上清 最后 用200 L儲存液 5 將離心管中的沉 淀懸浮 4 保存 酶解液配制方法 將纖維素酶 離析酶 甘露醇和20mmol L 1 pH6 3的MES Tris 混勻后于55 水浴10min 待冷涼至室溫后加入 0 1 質量體積比 BSA和10mol L 1 CaCl 2 儲存液 配制方法 甘露醇 2mmol L 1 MgSO 4 10mmol L 1 KCl 20mmol L 1 MES Tris 5mmol L 1 EGTA pH 6 0 和2 質量體積分數(shù) 甘油 滅菌 4 保存 采用單因素試驗設計 分別設置不同預處理方 式 酶濃度 酶解時間 甘露醇濃度 離心力 添加 BSA和CaCl 2 對原生質體游離體系和方法進行 優(yōu)化 1 4 單因素實驗 1 4 1 試驗材料預處理方式 對試驗材料采用 2種不同的預處理方式進行處理 分別為 花萼片 切絲法 花萼片上下表皮分離法 原生質體游離 所用的纖維素酶和離析酶濃度分別為4 和0 4 質量體積分數(shù) 甘露醇濃度為0 6mol L 1 酶解 時間2h 4 條件下1426r min 1 離心 儲存液甘 51 中國農業(yè)科技導報 24卷 露醇濃度為0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 2 酶濃度 設置纖維素酶質量體積分數(shù)分別 為2 4 6 和8 離析酶的質量體積分數(shù)分別 為0 2 0 4 0 6 和0 8 試驗材料預處理方式 采用花萼片上下表皮分離法 甘露醇0 6mol L 1 酶 解時間2h 4 條件下1426r min 1 離心5min 儲存 液甘露醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 3 酶解時間 酶解時間設4個水平 分別為 1 2 3和4h 試驗材料預處理方式采用花萼片上 下表皮分離法 纖維素酶與離析酶濃度質量體積 比分數(shù)分別為4 和0 4 甘露醇0 6mol L 1 4 條件下1426r min 1 離心5min 儲存液甘露 醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 4 甘露醇 對酶解液與儲存液中的甘露醇分 別設0 4 0 6和0 8mol L 1 3個梯度 試驗材料預處 理方式為花萼片上下表皮分離法 纖維素酶與離析 酶質量體積分數(shù)分別為4 和0 4 酶解時間2h 4 條件下1426r min 1 離心5min 其余同1 3 1 4 5 添加BSA和CaCl 2 酶與甘露醇融于含 20mmol L 1 MES Tris pH6 3 的溶液并水浴后 加入 0 1 質量體積分數(shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 以不加BSA和CaCl 2 的酶解液為對照 試 驗材料預處理方式均為花萼片上下表皮分離法 纖維素酶與離析酶質量體積分數(shù)分別為4 和 0 4 甘露醇0 6mol L 1 酶解時間2h 4 條件 下1426r min 1 離心5min 其余同1 3 1 4 6 離心力 在4 條件下 分別用1164 1426 1646和1841r min 1 離心5min 試驗材 料預處理方式為花萼片上下表皮分離法 纖維素 酶與離析酶質量體積分數(shù)分別為4 和0 4 甘 露醇0 6mol L 1 酶解時間2h 其余同1 3 1 5 游離原生質體計數(shù) 使原生質體均勻懸浮后 分別制片3張 每張 滴30 L懸浮液后覆24mm 50mm蓋玻片 鏡檢 拍照 分別從3張制片中選取9張鏡檢圖并統(tǒng)計有 色原生質體數(shù)量 SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析 Origin 2018軟件進行繪圖 1 6 液泡H 流測定 將牙簽尖頭部用少量脫脂棉包裹成拖把狀 蘸取0 008 質量體積分數(shù) 聚 L 賴氨酸 21 涂抹 在一次性培養(yǎng)皿中 置于冰箱冷藏層晾干備用 使用特定檢測H 流的離子交換液及質子選 擇性微電極制作探針 液泡H 流測試液繪制H 流 測定標線 吸取部分原生質體懸浮液移至培養(yǎng)皿中 加 入特定液泡H 流測試液 避光條件下靜置 使原 生質體在重力作用下下沉 根據(jù)陰陽離子互作原 理 聚 L 賴氨酸涂層吸附住原生質體 保證非損 傷微測儀質子選擇性微電極在運行過程中不 移動 分別隨機選取 BabyBlue 粉色 藍色原生質 體各7個 將探針置于靠近液泡的位置 對其液泡 H Na 流進行測定并繪制相應測定曲線 導出曲 線相應讀數(shù) SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析 Origin2018 軟件進行繪圖 2 結果與分析 2 1 單因素對有色原生質體酶解的影響 2 1 1 材料預處理方式對有色原生質體游離效率 的影響 對 Bailmer 和 BabyBlue 的粉色和藍 色花萼片分別采用切絲和上下表皮分離法進行處 理 結果表明 相較于切絲法 萼片上下表皮分離 法更能高效地游離4種花萼片的有色原生質體 圖1A 每個視野分別獲得有色原生質體11 14 個 Bailmer 和17 22個 BabyBlue 2 1 2 不同酶含量對有色原生質體游離效率的影 響 由圖1B可知 當纖維素酶與離析酶質量體積 分數(shù)分別為4 和0 4 時 4份材料所獲得的有 色原生質體數(shù)量 每個視野 均顯著高于其他含量 組合 因此 4 和0 4 為纖維素酶與離析酶最 佳酶解含量 2 1 3 不同酶解時間對有色原生質體游離效率的 影響 不同的酶解時長的結果 圖1C 表明 對 Bailmer 藍色和粉色萼片來說 酶解2h獲得有 色原生質體的數(shù)量均顯著高于酶解1 3和4h 而 對于 BabyBlue 藍色和粉色萼片 酶解1和2h 所得有色原生質體的數(shù)量無明顯差異 但均顯著 高于酶解3和4h 綜合考慮 2h為最適酶解 時長 2 1 4 不同甘露醇濃度對有色原生質體游離效率 的影響 對酶解液與儲存液中甘露醇的不同濃度 進行比較 結果 圖1D 表明 當甘露醇濃度為 0 6mol L 1 時 其滲透壓最適合有色原生質體的 解離與儲存 52 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質體游離及應用 2 1 5 添加BSA和CaCl 2 對有色原生質體游離效 率的影響 由于前4組酶解離條件篩選試驗中 同一八仙花品種不同顏色萼片的有色原生質體游 離結果表現(xiàn)趨勢一致 故本試驗只選用了 Bailmer 藍色萼片和 BabyBlue 粉色萼片為試 驗材料 結果 圖1E 顯示 在酶解液中添加 0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 后 Bailmer 藍色 萼片所得有色原生質體的數(shù)量與對照差異不顯 著 但 BabyBlue 粉色萼片在添加0 1 BSA和 10mmol L 1 CaCl 2 后 酶解液中所得有色原生質 體的數(shù)量顯著高于對照 綜合考慮 在酶解液中 添加0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 效果較好 2 1 6 不同離心力對有色原生質體游離效率的影 響 以 Bailmer 藍色萼片和 BabyBlue 粉色萼 A 預處理方式 B 酶水平 C 酶解時長 D 甘露醇濃度 E 酶液組分 F 離心速率 不同小寫字母表示不同處理間差異在P 0 05水平顯 著 A Material handling method B Enzymes concentration C Hydrolysis time D Mannitol concentration E Enzyme solution component F Centrifugalspeed differentlowercaselettersindicatesignificantdifferencesbetweendifferenttreatmentsat P 0 05level 圖1 單因素對有色原生質體酶解的影響 Fig 1 Effectofsinglefoctoronenzymatichydrolysis 53 中國農業(yè)科技導報 24卷 片為材料 分析不同離心力下獲得有色原生質 體數(shù)量的差異 結果 圖1F 顯示 4 條件下 1426r min 1 離心時獲得有色原生質體的數(shù)量顯 著高于其他3種離心速率 離心速率過低 不能 有效地沉淀有色原生質體 而離心速率過高會破 損有色原生質體 降低產量 上述研究表明 采用花萼片上下表皮分離 法 纖維素酶和離析酶的質量體積分數(shù)分別為 4 和 0 4 加入0 1 質量體積分數(shù) BSA和 10 mmol L 1 CaCl 2 酶解時間2 h 4 條件下 1426r min 1 離心5min 甘露醇0 6mol L 1 為八 仙花萼片有色原生質體游離的最佳條件 2 2 八仙花萼片有色細胞原生質體酶解體系 應用 2 2 1 不同品種中酶解體系的應用 按上述最優(yōu) 酶解體系對4個八仙花品種在施鋁處理 Al 3 和 未施鋁處理 CK 條件下的花萼片進行有色原生 質體游離 將原生質體懸浮均勻后制片 200 鏡 下單視野內可獲得13 35個有色的原生質 體 圖2 圖2 不同品種八仙花花器官及原生質體游離示意圖 Bar 50 m Fig 2 Schematicdiagramoffloralorgansandprotoplastdissociationofdifferentspeciesof Hydrangea Bar 50 m 54 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質體游離及應用 2 2 2 液泡H 離子流分析 使用非損傷微測技 術對八仙花品種 Babyblue 粉色 藍色液泡的 H Na 流進行測定 結果 圖3 表明 從H 流平均 值來看 藍色液泡H 流外排趨勢較粉色液泡更加 明顯 由此推斷 藍色液泡的pH高于粉色液泡 從 Na 流平均值來看 藍色液泡Na 流吸收趨勢更為 明顯 由此推斷 H 在外流后 液泡吸收Na 來維 持液泡內部原有溶質含量 3 討論 八仙花萼片酶解游離出的原生質體分為有色 原生質體與無色原生質體兩種 其中 有色原生質 體是研究花色形成的重要研究對象 原生質體游 離的基礎是酶解細胞壁釋放原生質體 1960年 Cocking 22 首次利用從疣孢菌中獲得的纖維素酶 以番茄根系為材料游離出了原生質體 這也是酶 解法游離原生質體在植物上的首次應用 隨后從 木霉素中提取出纖維素酶 這也是后續(xù)大量原生 質體游離試驗中使用頻率最高的酶 23 酶解游離 原生質體越來越廣泛地應用于不同物種 本研究發(fā)現(xiàn) 八仙花萼片原生質體游離的數(shù)量 少于其他植物葉片 嫩莖和愈傷組織產生的原生質 體數(shù)量 這可能是由組織材料的差異造成 酶解液 更容易浸入疏松的組織 充分與細胞壁接觸 斷開 纖維鏈并消解果膠 Yoo等 19 對擬南芥葉片原生質 體游離時發(fā)現(xiàn) 酶解材料切絲時應避免擠壓損傷 因為擠壓會造成原生質體在細胞壁構筑的小室內 破裂 然而 八仙花萼片組織質密 韌性強 如果對 萼片采用切絲的預處理方法 會在創(chuàng)口處留下明顯 的擠壓損傷 導致其原生質體游離的難度增大 本 研究發(fā)現(xiàn) 采用分離上下表皮對八仙花萼片進行預 處理 能增加酶液與材料的接觸面積 有利于打破 組織質密造成的酶解障礙 顯著增加原生質體游離 的數(shù)量 在對不同品種八仙花萼片原生質體進行 游離時還發(fā)現(xiàn) 花萼片大且厚時 其上下表皮更易 分離 更有利于原生質體游離 為了高效地游離原生質體 必需配比合適比 例的酶 若酶用量過低 則酶消解細胞壁的能力 不足以支撐原生質體游離工作的完成 若酶用量 過高 則會造成原生質體失活 Yoshida等 5 在游 離八仙花萼片有色細胞原生質體時 采用的纖維 素酶與離析酶質量體積分數(shù)分別為2 和0 2 但本研究發(fā)現(xiàn) 纖維素酶與離析酶含量分別為4 和0 4 質量體積分數(shù) 時 酶解產生的有色原生 質體數(shù)量顯著高于2 和0 2 纖維素酶與離析 酶水平 另外 BSA能夠有效維持酶活 保障酶 解過程中酶功能的持續(xù)性 24 而Ca 2 能與磷脂類 注 正值為外排 負值為吸收 Note Positivevaluesareeffluxandnegativevaluesareinflux 圖3 Babyblue 離子流 Fig 3 Babyblue ionflux 55 中國農業(yè)科技導報 24卷 物質上的負電荷結合維持細胞膜的穩(wěn)定性 在一 定程度上保障原生質體的活性 因此 在酶液中加 入0 1 質量體積分數(shù) BSA和10mmol L 1 CaCl 2 能獲得更多的原生質體 25 此外 若酶解時間較 短 酶液無法與細胞壁充分反應 若酶解時間過 長 會拉長試驗周期 原生質體會失活 因此 2h 為最優(yōu)酶解時長 甘露醇濃度需匹配細胞滲透 壓 細胞滲透壓過小或過大均會造成原生質體活 性降低 甚至失活 前人研究 18 26 27 中甘露醇濃度 為0 4 1mol L 1 本研究結果表明 甘露醇濃度 為0 6mol L 1 時 八仙花有色原生質體游離效果 最佳 由于解離花萼片產生的原生質體數(shù)量較少 故 需在離心過程中獲得盡可能多的原生質體 純化 原生質體的方法主要有離心沉降法 18 與密度梯度 自然沉降法 28 離心速率較小或自然沉淀時 部分 原生質體會重懸于上清中 若離心速率過大 原生 質體會因受機械損傷而失活 甚至破裂 本研究表 明 4 條件下 最佳離心速率為1426r min 1 原生質體游離能有效地分離花萼中有色細胞 和無色細胞 以便于研究有色細胞的生理生化特 性 Yoshida等 5 使用質子選擇微電極測得八仙花 藍色液泡pH約為4 1 紅色液泡約為3 2 本研究 中 Babyblue 藍色原生質體液泡H 流外排 液 泡內H 積累減少 pH相對較高 粉色原生質體液 泡H 流吸收 液泡內H 積累增多 pH相對較低 與前人的研究結果一致 因此 本研究建立的有 色原生質體游離體系為后續(xù)八仙花花色形成機理 研究奠定了基礎 參 考 文 獻 1 GALOPIN G CODARIN S VIEMONT J D et al Architectural development of inflorescence in Hydrangea macrophylla cv 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Anapproachtoisolationand transient transformation of protoplasts in plants J Plant Physiol Commun 2020 56 4 895 903 15 AOYAGI H TAKAYANAGI T JITSUFUCHI T et al Development of an apparatus for monitoring protoplast isolationfromplanttissuesbasedonbothdielectricandoptical methods J J Biosci Bioeng 1999 87 6 752 768 16 ZHUL WANGB ZHOUJ etal Protoplastisolationofcallus in echinacea augustifolia J ColloidsSurfacesBBiointerfaces 2005 44 1 1 5 17 劉維 劉浩 董雙玉 等 水稻葉鞘原生質體轉化體系的構建 及Pik H4和AvrPik H4蛋白的瞬時表達 J 中國農業(yè)科學 2017 50 23 4575 4584 LIU W LIU H DONG S Y et al Construction of rice leaf sheath protoplast transformation system and transient expression of Pik H4 and AvrPik H4 proteins J Sci Agric Sin 2017 50 23 4575 4584 18 胡添源 王睿 陳上 等 雷公藤懸浮細胞原生質體的制備及 56 9期 張蓋天等 八仙花萼片有色原生質體游離及應用 瞬時轉化體系的建立 J 植物學報 2017 52 6 774 782 HU T Y WANG R CHEN S et al Protoplast isolation and establishment of transient expression system of tripterygium wilfordii suspension culture cells J Bull Bot 2017 52 6 774 782 19 YOOSD CHOYH SHEENJ etal Arabidopsismesophyll protoplasts a versatile cell system for transient gene expressionanalysis J Nat Protocols 2007 2 7 1565 1572 20 ZHANGY SUJ DUANS etal Ahighlyefficientricegreen tissue protoplast system for transient gene expression and studying light chloroplast related processes J OL Plant Methods 2011 7 1 30 2021 03 20 https doi org 10 1186 1746 4811 7 30 21 CHENX BAOH GUOJ etal Na H exchanger1participates in tobacco disease defence against Phytophthora parasitica var nicotianaebyaffectingvacuolarpHandprimingtheantioxidative system J J Exp Bot 2014 65 20 6107 6122 22 COCKINGEC Amethodfortheisolationofplantprotoplasts andvacuoles J Nature 1960 187 962 963 23 COCKING E C Plant cell protoplasts isolation and development J Annu Rev PlantPhysiol 1972 23 29 50 24 王新明 王聯(lián)結 于猛 牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈 的影響 J 食品工業(yè)科技 2012 33 19 194 196 200 WANG X M WANG L J YU M Effect of bovine serum albumin on cellulase in hydrolysis of wheat straw J Sci Technol FoodInd 2012 33 19 194 196 200 25 張濤 仇運廣 羅啟超 等 鈣離子和鎂離子濃度變化對磷脂 酰乙醇胺 磷脂酰甘油雙分子層膜的影響 J 物理化學學報 2019 35 8 840 849 ZHANGT QIUYG LUOQC etal Concentrationdependent effects of Ca 2 and Mg 2 on the phosphatidylethanolamine phosphatidylglycerolbilayer J ActaPhys Chim Sin 2019 35 8 840 849 26 ROBERTS ZOUHARJ CARTERC etal Isolationofintact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf derived protoplasts J Nat Protocols 2007 2 2 259 62 27 宋愛華 張文斌 孫姝蘭 等 非洲菊原生質體游離及瞬時轉 化系統(tǒng)的建立 J 植物學報 2017 52 4 511 519 SONG A H ZHANG W B SUN S L et al Preparation of protoplastandestablishmentoftransientexpressionsystemin Gerbera hybrid J Bull Bot 2017 52 4 511 519 28 段煉 錢君 郭小雨 等 一種快速高效的水稻原生質體制備 和轉化方法的建立 J 植物生理學報 2014 50 3 351 357 DUAN L QIAN J GUO X Y et al A Rapid and efficient method for isolation and transformation of rice protoplast J PlantPhysiol Commun 2014 50 3 351 357 責任編輯 張冬玲 57