農(nóng)藝 園藝 78 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技 2022 年第 33 卷第 17 期 總第 541 期 近年來 設(shè)施園藝在我國發(fā)展迅速 種植面積 連年增加 設(shè)施生產(chǎn)逐步規(guī)?；l(fā)展 由于受到種 植習(xí)慣及對經(jīng)濟(jì)效益追求的影響 設(shè)施內(nèi)種植種類 單一 隨著種植年限的增加 連作障礙現(xiàn)象嚴(yán)重 制 約了蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展 連作導(dǎo)致了一系列問 題 比如土壤環(huán)境惡化 土傳病蟲害蔓延 產(chǎn)量品質(zhì) 下降等 成為生產(chǎn)上一個亟須解決的問題 1 黃瓜是 設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中主要種植種類之一 有著顯著的經(jīng)濟(jì) 效益 因此人們越來越重視黃瓜的連作障礙問題 2 目前 關(guān)于連作障礙的研究主要集中在土壤理 化性狀劣變 根系分泌物的自毒作用 土傳病害的 發(fā)生等方面 1 3 5 而導(dǎo)致連作障礙的主要原因是根 系分泌物對土壤微生物 特別是對病原微生物的選 擇性促進(jìn)作用導(dǎo)致的微生物群落變化 5 前人對連 作導(dǎo)致的土壤微生物變化已做了諸多研究 認(rèn)為作 物連作導(dǎo)致土壤有害微生物數(shù)量增加 有益微生物 數(shù)量減少 6 7 而也有研究發(fā)現(xiàn) 連作導(dǎo)致土壤有 益微生物的數(shù)量增加 這可能是植物受到病原菌侵 害時 自發(fā)的調(diào)節(jié)有益微生物的數(shù)量形成抑菌土來 抵抗病原菌 8 9 總之 目前對連作導(dǎo)致土壤微生 物數(shù)量變化的認(rèn)識尚不統(tǒng)一 前期研究了盆栽溫室條件下不同連作茬次黃 瓜的生長變化 黃瓜在第7茬表現(xiàn)出明顯的生長障 礙 各生長指標(biāo)均顯著低于其他茬次 第9茬又有所 好轉(zhuǎn) 10 造成這種現(xiàn)象的原因尚不清楚 因此 利 用熒光定量PCR技術(shù)研究不同連作茬次黃瓜根際土 壤芽孢桿菌 假單胞菌的數(shù)量變化 探究微生物數(shù) 量變化在黃瓜連作障礙中所起的作用 為黃瓜連作 障礙的緩解提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 供試土樣 土樣取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施園藝與 蔬菜生理生態(tài)試驗站 共45份土樣 其中連作茬 次不同 分為連作第1 3 5 7 9茬 每茬次種 植后30 40 50天取土樣各3份 即3次重復(fù) 于 80 冰箱保存 1 2 qPCR分析 1 2 1 提取土壤微生物總DNA 采用試劑盒 PowerSoilnull DNA Isolation Kit MO BIO Laboratories CA USA 提取土壤微生物總DNA 1 2 2 芽孢桿菌和假單胞菌的熒光定量PCR擴(kuò)增 芽孢桿菌和假單胞菌熒光定量PCR擴(kuò)增體系見表1 擴(kuò)增條件見表2 表 1 熒光定量 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系 20 L體 系 L 2 Real SYBR Mixture TianGen L 引物 10 mmol L L 模板 L 去離子 水 L 芽孢桿菌 9 0 0 5 2 0 8 5 陰性對照1 9 0 0 5 0 10 5 假單胞菌 9 0 0 2 2 5 8 3 陰性對照2 9 0 0 2 0 10 8 注 芽孢桿菌引物為BacF 1378R 11 假單胞菌引物為Ps for Ps rev 12 PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在溫度63 93 條件下 進(jìn)行溶解曲線 采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產(chǎn)物 進(jìn)行檢測 瓊脂糖凝膠電泳和溶解曲線表明生成 的PCR產(chǎn)物均為單一條帶 陰性對照用來排除外源 DNA污染造成的錯誤 1 2 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 土壤總DNA擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物 純化 連接載體轉(zhuǎn)化 提取質(zhì)粒 檢測濃度和純度 分光光度計 標(biāo)準(zhǔn)品制備 重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍 梯度稀釋 100 ng L 1 fg L 標(biāo)準(zhǔn)樣與土壤樣品 同時進(jìn)行熒光定量PCR 連作對黃瓜根際兩種生防菌數(shù)量的影響 喬蓬蕾 李玉明 華則科 崔 瑛 萊陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 山東 萊陽 265200 摘要 以不同連作年限黃瓜根際土壤為研究對象 利用熒光定量 PCR 技術(shù)分析其功能微生物菌群芽孢桿菌 假單胞菌的數(shù)量 結(jié)果顯示 黃瓜種植后 30 天 芽孢桿菌數(shù)量在第 1 茬顯著高于除第 7 茬外的其他茬次 假單胞菌 數(shù)量在第 5 茬顯著高于其他茬次 種植后 40 天時 從第 1 茬到第 7 茬兩種菌數(shù)量呈先升高后降低的趨勢 在第 5 茬 達(dá)到最高 但假單胞菌數(shù)量在第 9 茬顯著高于第 7 茬 芽孢桿菌數(shù)量則差異不顯著 種植后 50 天時 兩種菌數(shù)量從 第 3 茬到第 9 茬呈先升高后降低的趨勢 第 7 茬達(dá)到最高 關(guān)鍵詞 連作 黃瓜 芽孢桿菌 假單胞菌 數(shù)量 中圖分類號 S642 2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 收稿日期 2022 03 22 基金項目 國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目 CARS 25 作者簡介 喬蓬蕾 1987 女 山東萊陽人 中級農(nóng)藝師 農(nóng)學(xué)碩士 研究方向 農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣 農(nóng)藝 園藝 79 1 3 數(shù)據(jù)分析 采用Office Excel 2010進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理 采用 SAS 9 1 3軟件進(jìn)行單因素方差分析 2 結(jié)果與分析 2 1 不同連作茬次黃瓜根際土壤芽孢桿菌數(shù)量變化 注 不同小寫字母表示差異顯著 P 0 05 下同 圖 1 不同連作茬次黃瓜根際土壤芽孢桿菌數(shù)量變化 黃瓜種植后30天 第1茬顯著高于除第7茬外的 其他茬次 黃瓜種植后40天 第5茬顯著高于其他茬 次 第3茬顯著高于除第5茬的其他茬次 黃瓜種植 后50天 第7茬數(shù)量最高 與其他茬次差異顯著 第9茬顯著高于第3茬 芽孢桿菌數(shù)量在第1 7 9 茬呈下降的趨勢 第3 5茬呈先上升后下降的趨勢 圖1 2 2 不同連作茬次黃瓜根際土壤假單胞菌數(shù)量變化 圖 2 不同連作茬次黃瓜根際土壤假單胞菌數(shù)量變化 黃瓜種植后30天 第5茬顯著高于其他茬次 第1茬顯著高于第9茬 種植后40天 第5茬顯著高于 其他茬次 第3 9茬顯著高于第1 7茬 種植后50 天 第7茬數(shù)量最高且與其他茬次差異顯著 第5茬 顯著高于第1 3 9茬 第9茬顯著高于第1 3茬 假單胞菌數(shù)量在第1 3 5茬整體呈先上升后下降的 趨勢 第7茬 第9茬呈上升趨勢 圖2 3 小結(jié)與討論 研究發(fā)現(xiàn) 連作大多致使土壤中有益微生物數(shù) 量減少 例如 隨著太子參連作年限的增加 根系分 泌物對某些有益菌產(chǎn)生了抑制作用 土壤中具有拮抗 能力的有益菌數(shù)量明顯降低 13 豌豆連作導(dǎo)致叢枝 菌根真菌的數(shù)量呈下降趨勢 14 芝麻連作導(dǎo)致根際 土壤芽孢桿菌的數(shù)量也下降了 15 但有研究表明 連作使土壤有益微生物的數(shù)量升高 這可能是植物 在受到病原菌侵害時 能夠自發(fā)聚集有益微生物來 抑制病原菌 形成抑菌土 大豆長期連作方式下 木霉菌數(shù)量升高 形成了根腐病抑制性土壤 減輕 大豆根腐病發(fā)病程度 抑制病原鐮孢菌的生長 還 對大豆生長發(fā)育具有促生作用 8 Weller等 9 發(fā)現(xiàn)小 麥的全蝕病發(fā)病率會隨著長期連作自發(fā)降低 大量 研究表明 不同作物連作后 土壤中有益微生物數(shù) 量大都呈上升或下降趨勢 但本試驗結(jié)果與前人研 究不同 種植后30天 第5茬的假單胞菌數(shù)量顯著高 于其他茬次 第1茬的芽孢桿菌數(shù)量顯著高于除第7 茬外的其他茬次 種植后40天時 假單胞菌及芽孢 桿菌數(shù)量從第1茬到第7茬呈先升高后降低的趨勢 在第5茬達(dá)到最高 但假單胞菌在第9茬顯著高于第7 茬 芽孢桿菌則差異不顯著 黃瓜種植后50天時 假單胞菌及芽孢桿菌數(shù)量從第3茬到第9茬呈先升高 后降低的趨勢 在第7茬達(dá)到最高 研究表明 作 物不同生物期 根系分泌物的種類及數(shù)量也不同 對微生物的影響也不同 16 這可能是本試驗中黃瓜 在不同生育期 芽孢桿菌及假單孢菌數(shù)量變化不同 的主要原因 芽孢桿菌和假單胞菌是常見的生防細(xì) 菌 當(dāng)植物受到病原菌侵染時 它們能激發(fā)植物的 系統(tǒng)抗性 從而應(yīng)對病原菌的攻擊 17 18 分泌特定 的根系分泌物來選擇有益微生物應(yīng)對這種攻擊 19 前期的研究結(jié)果表明 黃瓜連作到第7茬出現(xiàn)明顯的 生長障礙 到第9茬又有所好轉(zhuǎn) 本試驗中在黃瓜種 表 2 熒光定量 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件 反應(yīng) 條件 預(yù)變性 變性 退火 延伸 循環(huán) 次數(shù) 終延伸 獲取熒光數(shù)據(jù) 溫度 時間 min 溫度 時間 s 溫度 時間 s 溫度 時間 s 溫度 時間 min 芽孢桿菌 94 5 94 60 65 90 72 90 26 72 10 83 假單胞菌 95 95 50 63 30 60 30 喬蓬蕾 等 連作對黃瓜根際兩種生防菌數(shù)量的影響 農(nóng)藝 園藝 80 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技 2022 年第 33 卷第 17 期 總第 541 期 植后50天時假單胞菌和芽孢桿菌的數(shù)量在第7茬顯著 增加了 這可能是植物應(yīng)對生長障礙的一種方式 到第9茬這種生長障礙有所緩解 這兩種生防菌的數(shù) 量也下降了 本研究采用熒光定量PCR技術(shù) 研究連作對黃 瓜根際土壤芽孢桿菌 假單胞菌數(shù)量的影響 發(fā)現(xiàn) 黃瓜連作改變了這兩種菌的數(shù)量 黃瓜生長后期這 兩種生防菌數(shù)量在第7茬升高了可能是應(yīng)對黃瓜生長 障礙的一種方式 因此 進(jìn)一步研究連作條件下土 壤根際微生物菌群活性及其功能變化 對于連作障 礙的緩解具有重要意義 參考文獻(xiàn) 1 喻景權(quán) 杜堯舜 蔬菜設(shè)施栽培可持續(xù)發(fā)展中的連作障礙問題 J 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2000 1 124 126 2 吳鳳芝 周新剛 黃瓜連作障礙的研究進(jìn)展 J 大豆科學(xué) 2013 32 6 8 0 5 3 原 靜 云 王 曉 玲 王 文 英 等 不 同 連 作 年 限 對 甜 瓜 土 壤 理 化 性 狀 的 影 響 J 種 業(yè)導(dǎo) 刊 2 0 2 1 3 4 0 4 3 4 閆 敏 龐金梅 焦曉燕 等 溫室黃瓜連作土壤微生物區(qū)系和養(yǎng)分 含量變化 J 山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012 40 12 1296 1298 5 Huang LF Song LX Xia XJ et al Plant soil feedbacks and soil sickness From mechanisms to application in agriculture J Journal of Chemical Ecology 2013 39 232 242 6 王 覺 聶春鵬 羅夫來 等 半夏連作障礙與土壤微生物數(shù)量變化 初步探究 J 南方農(nóng)業(yè) 2016 10 19 101 105 7 周寶利 徐 妍 尹玉玲等 不同連作年限土壤對茄子土壤生物 學(xué)活性的影響及其嫁接調(diào)節(jié) J 生態(tài)學(xué)雜志 2010 29 2 90 294 8 魏 巍 大豆長期連作土壤對根腐病病原微生物的抑制作用 D 北 京 中國科學(xué)院大學(xué) 2012 9 Weller D M Raaijmakers J M Gardener B B M et al Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens J Annual Review of Phytopathology 2002 40 1 309 348 10 周新剛 連作黃瓜土壤生態(tài)環(huán)境特征及對黃瓜生長的影響 D 哈 爾 濱 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 2 0 1 1 11 Drigo B Van Veen J A Kowalchuk G A Specific rhizosphere bacterial and fungal groups respond differently to elevated atmospheric CO 2 J The ISME Journal 2009 3 10 1204 1217 12 Widmer F Seidler R J Gillevet P M et al A highly selective PCR protocol for detecting 16S rRNA genes of the genus of the genus Pseudomonas ensu 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