植物保護(hù)學(xué)報Journal of Plant Protection 2022 49 4 1111 1118 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2022 2020289 蘭州百合枯萎病病原菌鑒定及罹病組織超微結(jié)構(gòu)觀察 牟曉玲 1 2 李瀟瀟 1 師桂英 1 王文珠 1 李謀強(qiáng) 3 張愛菊 4 1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 蘭州730070 2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 臨洮730500 3 臨洮縣龍門鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村 綜合服務(wù)中心 甘肅臨洮730500 4 臨洮縣園藝站 甘肅臨洮730500 摘要 為明確引起甘肅省蘭州百合主產(chǎn)區(qū)百合枯萎病的致病鐮孢菌種類 對從百合主產(chǎn)區(qū)枯萎病 罹病植株上分離純化的4株鐮孢菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定 分子生物學(xué)鑒定以及致病性測定 同時利用 電子顯微鏡對尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum侵入百合鱗片后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察 結(jié)果表 明 4株鐮孢菌菌株經(jīng)鑒定分別為尖孢鐮孢菌 茄病鐮孢菌F solani 三線鐮孢菌F tricinctum和燕 麥鐮孢菌F avenaceum 4株鐮孢菌菌株的致病力由強(qiáng)到弱的順序依次是尖孢鐮孢菌 燕麥鐮孢菌 茄 病鐮孢菌 三線鐮孢菌 尖孢鐮孢菌侵入后 鱗片細(xì)胞壁 細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被破壞 細(xì)胞核附近出 現(xiàn)大量線粒體 細(xì)胞中淀粉粒數(shù)量減少 表明尖孢鐮孢菌是蘭州百合枯萎病防治的重點防控對象 關(guān)鍵詞 食用百合 枯萎病 鐮孢菌 致病性 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) IdentificationofpathogenscausingFusariumwiltofLanzhoulily andtheobservation ofcellultrastructuresintheinfectedbulbscales Mou Xiaoling 1 2 Li Xiaoxiao 1 Shi Guiying 1 Wang Wenzhu 1 Li Mouqiang 3 Zhang Aiju 4 1 College of Horticulture GansuAgricultural University Lanzhou 730070 Gansu Province China 2 College ofApplied Technology GansuAgricultural University Lintao 730500 Gansu Province China 3 Agriculture and Rural Comprehensive Service Center of Longmen Town Lintao County Lintao 730500 Gansu Province China 4 Lintao County Gardening Station Lintao 730500 Gansu Province China Abstract To clarify Fusarium species causing the wilt disease of Lanzhou lily in the main producing region of Gansu Province four Fusarium strains were isolated and purified from lily with wilt symp toms and morphological characters and molecular sequence analysis as well as pathogenicity test were performed In addition the cell ultrastructures in the lily bulb scales infected by F oxysporum were also observed with electronic microscope The four strains were identified as F oxysporum F solani F tricinctum and F avenaceum respectively The pathogenicity of these strains decreased in the following order F oxysporum F avenaceum F solani F tricinctum The electronic microscope observation re vealed that the cell walls cytoplasmic membranes and nuclei in lily bulb scale were damaged by infec tion of F oxysporum It was also found that lots of mitochondria appeared near the nucleus and plas molysis occurred in the infected cells The sever damages suggested that the prevention and control of Fusarium wilt should have the top priority in the edible Lanzhou lily production region Key words edible lily wilt disease Fusarium pathogenicity cells ultrastructure 蘭州百合Lilium davidii var unicolor是中國唯 一的甜百合 是極具地方特色的甘肅名優(yōu)蔬菜 僅適 宜于甘肅省中部蘭州市周邊二陰山區(qū)種植 狹域分 布 無性繁殖 多年生栽培 連作現(xiàn)象十分普遍 陳艷 華等 2003 蘭州百合枯萎病是一種典型的土傳病 害 一般于5月下旬左右開始發(fā)病 6月雨水多時發(fā) 基金項目 國家自然科學(xué)基金 31860549 蘭州市科技計劃項目 2017 4 95 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科建設(shè)基金 GAU XKJS 2018 05 通信作者 Author for correspondence E mail shigy 收稿日期 2020 11 11 1112 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報 49卷 病程度嚴(yán)重 植株根部腐爛 地上部分黃化 枯萎死 亡 該病害在百合產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生 是影響連作的重 要因素之一 Wu et al 2015 食用百合是指以鱗莖作為蔬菜的百合類型 在 中國食用百合廣為栽培有3個類群 包括蘭州百合 宜興百合和龍芽百合 其中以蘭州百合栽培占絕對 主導(dǎo)地位 食用百合栽培面積相對較小 其枯萎病 病原菌研究僅有零星報道 目前分離鑒定的致病菌 主要有尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum 串珠鐮孢 菌F moniliforme和茄病鐮孢菌F solani和三線鐮孢 菌F tricinctum等 李誠和李俊杰 1996 潘其云等 2004 邊小榮等 2016 相對而言 觀賞百合枯萎病 病原菌研究報道較多 L ffler et al 1995 研究表 明 尖孢鐮孢菌為荷蘭百合枯萎病的主要病原菌 Prados Ligero et al 2008 首次報道引起西班牙百合 枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢菌和層出鐮孢菌F pro liferatum 鐮孢菌形態(tài)相似 很難區(qū)別同屬的不同 種 近年來 PCR擴(kuò)增病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) internal transcribed spacer ITS 以及翻譯延長因子 translation elongation factor TEF 序列分析等技術(shù) 在植物枯萎病病原菌鑒定 檢測及病害診斷方面得 到了應(yīng)用 張凡等 2018 王喜剛等 2020 該技術(shù)在 觀賞百合枯萎病病原菌尖孢鐮孢菌 茄病鐮孢菌 三 線鐮孢菌 串珠鐮孢菌等鑒定方面應(yīng)用也有報道 楊 秀梅等 2010 Li et al 2013 李琬玥等 2016 另 外 還有關(guān)于鐮孢菌菌絲侵入罹病組織過程的顯微 觀察 李琬玥等 2016 以及百合枯萎病抗性分析 楊秀梅等 2012 張藝萍等 2018 等報道 蘭州百 合栽培面積小 上述提及的蘭州百合致病鐮孢菌鑒 定工作均采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法 李誠和李俊 杰 1996 鐮孢菌種類很多 其種類分布表現(xiàn)出很強(qiáng)的地 域性 劉波等 2013 本課題組于2015年利用鱗片 接種方法對蘭州百合主產(chǎn)區(qū)枯萎病進(jìn)行了病原菌研 究 邊小榮等 2016 然而在實際生產(chǎn)中 百合枯萎 病發(fā)生時 其典型癥狀表現(xiàn)為植株根部腐爛 地上部 黃化 最終枯萎死亡 因此 利用植株接種試驗來確 定鐮孢菌的致病性非常必要 植株水平的致病性鑒 定存在鑒定周期長 植株發(fā)病癥狀復(fù)雜 病情分級存 在一定難度 該方面在蘭州百合上還未見文獻(xiàn)報 道 鑒于此 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上 利用ITS 序列分析技術(shù)以及TEF序列分析技術(shù) 結(jié)合形態(tài)學(xué) 鑒定方法對該病原真菌種類進(jìn)行鑒定 同時進(jìn)行致 病性測定和病原菌侵入寄主體內(nèi)的電子顯微觀察 以期明確各成員的致病性差異和鐮孢菌在寄主亞細(xì) 胞層次的致病生理 為蘭州百合土傳病害的綜合治 理提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 供試菌種及植物 本課題前期利用鱗片接種致 病性測定及形態(tài)學(xué)方法鑒定獲得的4株鐮孢菌菌株 為供試病原菌 供試百合品種為蘭百1號 由甘肅 農(nóng)業(yè)大學(xué)食用百合試驗基地提供 選擇無病蟲 質(zhì)量 為25 g左右種球用于致病性測定 培養(yǎng)基 馬鈴薯蔗糖瓊脂 potato sucrose agar PSA 培養(yǎng)基成分為去皮馬鈴薯200 g 蔗糖20 g 瓊 脂20 g 水1 000 mL pH為自然值 馬鈴薯葡萄糖 液體 potato dextrose broth PDB 培養(yǎng)基成分為去 皮馬鈴薯200 g 葡萄糖20 g 水1 000 mL pH為 自然值 試劑及儀器 SolarbioD2300 50T真菌基因組 DNA提取試劑盒 北京索來寶科技有限公司 其他 試劑均為國內(nèi)分析純 GNP 9160恒溫培養(yǎng)箱 上海 精宏實驗設(shè)備有限公司 TS 200B恒溫培養(yǎng)搖床 上 ?？瞥綄嶒炘O(shè)備有限公司 RDN 300E 4人工氣候 箱 寧波東南儀器有限公司 JEM 1230型透射電子 顯微鏡 日本電子株式會社 TC96G H bB PCR儀 杭州博日科技股份有限公司 TC DYCP 31DN瓊脂 糖水平電泳槽 Imager 600UV凝膠成像系統(tǒng) 美國 Amersham公司 1 2 方法 1 2 1 鐮孢菌的分子鑒定 利用真菌基因組抽提試劑盒提取4株菌株的 DNA 本研究采用鐮孢菌種水平鑒定的專用引物 EF 1 F 5 ATGGGTAAGGA A G GACAAGAC 3 和EF 2 R 5 GGA G A GTACCAGT G C ATCA TGTT 3 O Donnell et al 1998 進(jìn)行序列分析 引 物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 以真 菌DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體 系 模板DNA1 L 10 Buffer 含Mg 2 2 5 L dNTP 1 L Taq酶0 2 L 上下游引物各0 5 L ddH 2 O加至 25 L PCR反應(yīng)程序為 94 預(yù)變性4 min 94 變 性45 s 55 退火45 s 72 延伸1 min 30個循環(huán) 最后72 延伸10 min 4 保存 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 瓊 脂糖凝膠電泳 回收 純化500 bp左右的主帶 送南 京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測定 測序結(jié) 果在NCBI https www ncbi nlm nih gov 數(shù)據(jù)庫中 4期 牟曉玲等 蘭州百合枯萎病病原菌鑒定及罹病組織超微結(jié)構(gòu)觀察 1113 進(jìn)行BLAST比對分析 利用MEGA 7 0 26軟件采 用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 重復(fù)500次 1 2 2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 參考方中達(dá) 1998 方法并加以改良進(jìn)行接種及 病原菌鑒定 將4株病原菌株分別接種于PDB培養(yǎng) 基上 每個錐形瓶100 mL培養(yǎng)基 培養(yǎng)7 d后打取并 接種15塊直徑為5 mm的菌餅 于恒溫培養(yǎng)搖床上 于28 120 r min培養(yǎng)7 d 然后收集培養(yǎng)物 用無 菌水稀釋 得到濃度為10 7 個 mL的孢子懸浮液用 于接種 選用直徑8 cm 高10 cm且裝有基質(zhì) 蛭 石 珍珠巖 3 1 的營養(yǎng)缽進(jìn)行栽培 高溫蒸汽基質(zhì) 滅菌 選用周徑為14 16 cm蘭州百合種球播種 待 90 植株株高達(dá)到10 cm時接種 采用浸根 刺傷 和灌根相結(jié)合的方法進(jìn)行接種 將百合植株剪去約 0 5 1 cm根尖 將鱗莖與根部在菌液中浸泡30 min 然后選3個不同部位 用針頭刺傷鱗莖刺傷 深度1 2 mm 刺傷后重新播種于營養(yǎng)缽中 然后每缽用 10 mL同濃度的菌液灌根 5 d后等量灌根1次 直 至首株植株開始發(fā)病 停止灌根 將處理好的植 株放置于人工氣候箱中 于25 相對濕度85 12 h光暗交替條件下培養(yǎng) 植株接種后7 10d開始 發(fā)病 將植株發(fā)病組織剪成約0 5 cm 0 5 cm的小塊 消毒后接種于PSA培養(yǎng)基上 置于25 12 h光暗交 替條件下培養(yǎng)10 d 觀察菌落性狀 孢子形態(tài) 測定 菌落直徑 從培養(yǎng)物上挑取少許菌絲 制成簡易裝 片 進(jìn)行病原菌鑒定 在顯微鏡下觀察了分生孢子 和厚垣孢子的形態(tài) 大小 每種鐮孢菌觀察10個 以上視野 觀察的分生孢子100個以上 厚垣孢子 40個以上 形態(tài)學(xué)鑒定參考 鐮孢菌屬 Booth 1988 真 菌鑒定手冊 魏景超 1979 以及 植物病原學(xué) 張 中義 1986 等分類文獻(xiàn) 同時參照Gerlach 2 3 4 represent the Fusarium strains F1 F2 F3 F4 respectively 圖1 4株鐮孢菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果 A 及基于TEF擴(kuò)增序列構(gòu)建代表菌株及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 B Fig 1 PCR results of four Fusarium strains A and phylogenetic tree of representative strains and the related strains based on TEF gene sequences B 2 2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 4株菌株接種后均可誘導(dǎo)植株發(fā)病 并且其發(fā) 病癥狀相似 病原菌侵染植株后按照葉尖到葉基 下部葉到上部葉的順序逐漸發(fā)黃 變褐 枯萎 且從 葉緣兩側(cè)向下卷曲 地上莖莖尖首先發(fā)黃 繼而由上 及下 莖稈漸漸變成褐色 干枯 最終整株植株變褐 枯萎死亡 地下部鱗莖盤變褐 根系腐爛 發(fā)病嚴(yán) 重的整株死亡 圖2 A 對照 B E 分別表示接種后葉片1 3葉發(fā)黃 干枯 1 2葉發(fā)黃 干枯 2 3葉發(fā)黃 干枯 全株葉發(fā)黃 植株死亡 A CK B E leaves became yellow on 1 3 1 2 2 3 totally of areas respectively and finally became dry and wilt after infection 圖2 蘭州百合植株接種鐮孢菌后的發(fā)病癥狀 Fig 2 Symptoms on Lanzhou lily artificially inoculated with Fusarium 從植株發(fā)病組織分離培養(yǎng)的4種病原菌 菌落 邊緣均整齊 病原菌菌落背面顏色均呈紅色至深紅 色 正面顏色均為白色 病原菌氣生菌絲均為白色 圖3 4株鐮孢菌菌株均可產(chǎn)生大型分生孢子 小 型分生孢子和厚垣孢子 孢子形態(tài)各異 F1菌株大 型分生孢子鐮孢形 彎曲 兩頭稍尖 無色 3 5隔 大小為10 98 50 65 m 2 11 6 69 m 小型分生孢子 為橢圓形 單胞 少數(shù)雙胞 大小為6 59 13 58 m 2 00 4 90 m 厚垣孢子近圓形 6 87 8 26 m 4 51 7 89 m F2菌株大型分生孢子呈茄形 稍彎 4期 牟曉玲等 蘭州百合枯萎病病原菌鑒定及罹病組織超微結(jié)構(gòu)觀察 1115 曲 兩端稍圓鈍 無色 3 5隔 大小為11 16 38 53 m 2 11 5 57 m 小型分生孢子橢圓形 單胞 大小為 5 13 13 36 m 1 74 5 38 m 厚垣孢子近圓形 單 胞 大小為7 10 27 99 m 4 48 10 33 m F3菌株 大型分生孢子鐮孢形 彎曲 1 2隔 大小為11 21 31 01 m 1 49 7 82 m 小型分生孢子橢圓形 單 胞 大小為3 71 8 91 m 1 14 3 41 m 厚垣孢子近 圓形 大小為8 03 16 96 m 5 93 12 82 m F4菌 株大型分生孢子鐮孢形 略彎曲 3 5隔 大小為 11 35 35 29 m 2 20 4 37 m 小型分生孢子橢圓 形 0 1隔 大小為4 70 10 03 m 1 30 3 89 m 厚 垣孢子橢圓形 大小為9 26 25 38 m 4 70 8 53 m 依據(jù)形態(tài)特點 結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 最終將 F1 F2 F3和F4菌株分別鑒定為尖孢鐮孢菌 茄病 鐮孢菌 三線鐮孢菌和燕麥鐮孢菌 F1 F2 F3和F4 菌株在GenBank中對應(yīng)的序列登記號分別為Seq ID1MT292552 SeqID2MT292553 SeqID3MT292 554和SeqID4MT292555 A B C D分別代表從病組織上分離鑒定的尖孢鐮孢菌 茄病鐮孢菌 三線鐮孢菌和燕麥鐮孢菌 1 2分別代表菌落 的背面和正面 A B C D represent the morphology of F oxysporum F solani F tricinctum F avenaceum isolated after artificial inoculations respectively 1 and 2 represent fugal colonies morphology at back and front respectively 圖3 蘭州百合植株人工接種后從發(fā)病組織再分離培養(yǎng)得到的4種鐮孢菌形態(tài)特征 Fig 3 Colony morphology of four Fusarium strains reisolated from diseased bulb scale tissues of Lanzhou lily after artificial inoculation 2 3 病原菌致病力的測定 鱗片接菌后 鱗片頂端 側(cè)方及基部產(chǎn)生褐色病 斑 進(jìn)而逐漸形成腐爛現(xiàn)象 與無刺傷處理相比較 刺傷處理顯著提高了發(fā)病率及病情指數(shù) 刺傷處理 后發(fā)病率均為100 無刺傷處理發(fā)病率介于11 22 之間 尖孢鐮孢菌處理的病情指數(shù)在刺傷處理 與無刺傷處理2種情況下均最高 其余3個處理病情 指數(shù)排列次序有所不同 各菌株在致病性與鱗片水 平上的致病性存在一定差異 燕麥鐮孢菌處理的發(fā) 病率最高 尖孢鐮孢菌處理的病情指數(shù)最高 4株 鐮孢菌株的致病力由強(qiáng)到弱依次為尖孢鐮孢菌 燕 麥鐮孢菌 茄病鐮孢菌 三線鐮孢菌 表1 2 4 病原菌侵入寄主體內(nèi)的電鏡顯微觀察 電鏡顯微觀察揭示了鐮孢菌入侵細(xì)胞后細(xì)胞超 微結(jié)構(gòu)的變化 圖4 與對照 圖4 J 相比 百合鱗 片罹病組織細(xì)胞中出現(xiàn)大量黑色 高致密度小顆粒 圖4 A 細(xì)胞壁出現(xiàn)大量褶皺 圖4 B 并逐漸被 破壞 細(xì)胞發(fā)生明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象 圖4 C 淀粉 粒數(shù)量減少 圖4 D 細(xì)胞核結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重地破壞 核膜模糊 不完整 細(xì)胞核呈不規(guī)則狀 細(xì)胞核附近 出現(xiàn)大量線粒體 圖4 E 細(xì)胞中出現(xiàn)大量的疑似 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu) 圖4 F 細(xì)胞質(zhì)膜被破壞 圖4 G 細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)邊緣出現(xiàn)大量黑色 扁橢圓體狀 高致 密度顆粒 圖4 H 疑似白色體 1116 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報 49卷 表1 蘭州百合鱗片及植株人工接種4種鐮孢菌的發(fā)病率和病情指數(shù) Table 1 The morbidity and disease index of Lanzhou lily inoculated with four Fusarium species 菌株Strain 尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum 茄病鐮孢菌F solani 三線鐮孢菌F tricinctum 燕麥鐮孢菌F avenaceum 對照CK 鱗片發(fā)病率Morbidity 刺傷后接種 Scales inocula tion after piercing 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 0 00 0 00 b 無刺傷接種 Scales inocula tion without piercing 22 22 0 29 a 22 22 0 34 a 11 11 0 19 b 11 11 0 08 b 0 00 0 00 c 鱗片病情指數(shù)Disease index 刺傷后接種 Scales inocula tion after piercing 38 89 0 78 a 25 93 3 21 c 31 48 0 72 b 33 33 0 45 b 0 00 0 00 d 無刺傷接種 Scales inocula tion without piercing 3 71 0 17 a 3 71 0 09 a 1 85 0 04 b 1 85 0 04 b 0 00 0 00 c 植株發(fā)病率 Morbidity 96 30 0 61 c 82 14 0 24 d 96 67 0 39 b 100 00 0 46 a 0 00 0 00 e 植株病情指數(shù) Disease index 57 41 0 30 a 51 79 0 03 c 35 82 0 15 d 56 25 0 23 b 0 00 0 00 e 表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)誤 同列不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗在P 0 05水平差異顯著 Data are mean SE Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at P 0 05 by Duncan s new multiple range test A 細(xì)胞中出現(xiàn)大量黑色 高致密度小顆粒 8 000 B 細(xì)胞壁出現(xiàn)大量褶皺 10 000 C 細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)壁分離 現(xiàn)象 12 000 D 細(xì)胞中的淀粉粒數(shù)量減少 3 000 E 細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重地破壞 核膜模糊 不完整 細(xì)胞核 呈不規(guī)則狀 細(xì)胞核附近出現(xiàn)大量線粒體 25 000 F 細(xì)胞中出現(xiàn)大量的疑似內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu) 20 000 G 細(xì)胞質(zhì)膜 被破壞 5 000 H 細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)邊緣出現(xiàn)大量黑色 扁橢圓體狀 高致密度顆粒 疑似白色體 10 000 I 細(xì)胞質(zhì) 膜被破壞 8 000 J 對照細(xì)胞 8 000 A Alarge number of black high density particles appeared in the cell 8 000 B a large number of folds appeared in the cell wall 10 000 C plasmolysis occurred in the cells 12 000 D the number of starch grains decreased 3 000 E the seriously damaged nucleus structure in which the nuclear membrane become fuzzy and incomplete the nucleus become irregular and lots of mitochondria appeared near the nucleus 25 000 F a large number of suspected endoplasmic reticulum appear 20 000 G the cytoplasmic membrane was destroyed 5 000 H a large number of black and oblate ellipsoidal and highly density particles appeared at the inner edge of the cytoplasmic mem brane which were suspected as leucoplasts 10 000 I the cytoplasmic membrane was destroyed 8 000 J cell in CK 8 000 圖4 尖孢鐮孢菌侵入后百合鱗片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 Fig 4 Changes of lily scale cells ultrastructure after invasion by Fusarium oxysporum 3 討論 病原菌鑒定主要采用形態(tài)學(xué)鑒定 隨著分子生 物學(xué)發(fā)展 基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析逐漸作 為真菌分類的重要補(bǔ)充依據(jù) 本研究以形態(tài)學(xué) 鑒定結(jié)果為依據(jù) 參考TEF分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 證明4株鐮孢菌菌株分別為尖孢鐮孢菌 茄病鐮孢 菌 三線鐮孢菌和燕麥鐮孢菌 與觀賞百合相比 蘭州百合株型小而緊湊 葉面積小 盛花期單葉面 積2 cm 2 師桂英等 2020 觀賞百合植株水平上枯 4期 牟曉玲等 蘭州百合枯萎病病原菌鑒定及罹病組織超微結(jié)構(gòu)觀察 1117 萎病分級標(biāo)準(zhǔn) 楊秀梅等 2010 鄭思鄉(xiāng)等 2014 并 不適合蘭州百合 本研究首次制訂了鐮孢菌人工接 種后植株水平上枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn) 利用該鑒定標(biāo)準(zhǔn) 對4種病原菌致病性進(jìn)行了比較 發(fā)現(xiàn)與鱗片水平 上的人工接種鑒定結(jié)果有一定差異 由此說明了蘭 州百合植株水平上人工接種鐮孢菌進(jìn)行致病性鑒定 的必要性和重要性 尖孢鐮孢菌是國內(nèi)外最為廣泛 報道 Loffler et al 1995 李誠和李俊杰 1996 李琬 玥等 2016 的百合枯萎病致病鐮孢菌類群 以尖孢 鐮孢菌作為致病菌 研究學(xué)者們開展了百合種質(zhì)資 源對枯萎病的抗性鑒定以及病原性連作障礙機(jī)理研 究工作 楊秀梅等 2010 2012 Wu et al 2015 本 研究結(jié)果顯示 供試的4株鐮孢菌菌株致病力由強(qiáng) 到弱的順序依次是尖孢鐮孢菌 燕麥鐮孢菌 茄病鐮 孢菌 三線鐮孢菌 據(jù)此分析 尖孢鐮孢菌是甘肅蘭 州百合主產(chǎn)區(qū)重點防控對象 而燕麥鐮孢菌作為百 合枯萎病致病鐮孢菌類群 屬于首次報道 鐮孢菌的生化致病機(jī)制非常復(fù)雜 有多種細(xì)胞 壁降解酶和毒素參與 董章勇和王振中 2012 胡長 志等 2016 細(xì)胞壁降解酶主要是降解寄主植物的 細(xì)胞壁 從而利于病原真菌的侵入 定殖與擴(kuò)展 董 章勇和王振中 2012 本研究結(jié)果顯示 尖孢鐮孢 菌通過破壞細(xì)胞壁 細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu) 侵染到細(xì)胞內(nèi) 部結(jié)構(gòu) 進(jìn)一步對寄主植物進(jìn)行破壞 導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié) 構(gòu)不完整 細(xì)胞大量失水而發(fā)生嚴(yán)重的質(zhì)壁分離現(xiàn) 象 O Donnell et al 1998 研究表明 病原菌侵染植 物后能迅速引起寄主組織的生理生化變化 寄主組 織呼吸強(qiáng)度迅速上升 呼吸產(chǎn)生的能量用于合成寄 主組織對病原菌侵染的抵抗和平衡自身代謝時需要 的各種代謝物質(zhì) 本研究結(jié)果顯示 鐮孢菌入侵細(xì) 胞 細(xì)胞核結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞 核膜模糊 不完整 細(xì) 胞核呈不規(guī)則狀 細(xì)胞核附近出現(xiàn)大量線粒體 細(xì)胞 中淀粉粒數(shù)量減少 大量線粒體的出現(xiàn)與淀粉粒數(shù) 量減少均與罹病細(xì)胞呼吸強(qiáng)度迅速上升有關(guān) 楊秀 梅等 2010 采用石蠟切片 苯胺蘭染色 熒光顯微鏡 下藍(lán)光激發(fā)等技術(shù) 在細(xì)胞水平上研究了罹病百合 中鐮孢菌菌絲在鱗莖和根部的侵染過程 發(fā)現(xiàn)菌絲 在細(xì)胞間隙擴(kuò)展 集聚于細(xì)胞與細(xì)胞之間 被菌絲包 圍的細(xì)胞中淀粉粒明顯減少 細(xì)胞開始變形 這與 本研究結(jié)果類似 在百合鱗片感病細(xì)胞中出現(xiàn)大量 的疑似內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及疑似白色體結(jié)構(gòu) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有承擔(dān) 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔?白色體具有貯藏淀粉 蛋白 質(zhì)及油脂的功能 二者的出現(xiàn)可能與感病細(xì)胞呼吸 強(qiáng)度增加 物質(zhì)代謝加快有關(guān) 本研究對百合健康 鱗片和罹病鱗片所進(jìn)行的電鏡顯微觀察結(jié)果為揭示 鐮孢菌的致病生理提供了依據(jù) 細(xì)胞核是遺傳物質(zhì) 存在的場所 百合感病細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破 壞的病理學(xué)意義需要深入研究 參 考 文 獻(xiàn) References Bian XR Shi GY Liang QL Sun HQ Fan SF Chen JL 2016 Isola tion and identification of wilt disease pathogen from Lanzhou lily and its pathogenicity Journal of Gansu Agricultural University 51 4 58 64 in Chinese 邊小榮 師桂英 梁巧蘭 孫鴻強(qiáng) 樊生 豐 陳君良 2016 蘭州百合枯萎病病原菌的分離鑒定與致病性 測定 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 51 4 58 64 Booth C 1988 The genus Fusarium Chen QY translated Beijing Chi na Agricultural Press in Chinese Booth C 1988 鐮孢菌屬 陳 其瑛譯 北京 中國農(nóng)業(yè)出版社 Chen YH Shi BX Xie L Qi SF 2003 Climate adaptability and favor able planting division of lily in central parts of Gansu Province Chinese Journal of Agrometeorology 24 3 51 53 in Chinese 陳艷華 史寶秀 謝玲 齊士福 2003 甘肅中部百合氣候適應(yīng) 性及適生種植區(qū)劃 中國農(nóng)業(yè)氣象 24 3 51 53 Chen HM Li JH Chai ZX Guo C Wang D 2012 Resistance evalua tion of 35 potato varieties to the dominant pathogens of potato Fu sarium dry rot Journal of Plant Protection 39 4 308 314 in Chinese 陳紅梅 李金花 柴兆祥 郭成 王蒂 2012 35個馬鈴 薯品種對鐮孢菌干腐病優(yōu)勢病原的抗病性評價 植物保護(hù)學(xué) 報 39 4 308 314 Dong ZY Wang ZZ 2012 Research progress of fungal cell wall de grading enzyme Hubei Agricultural Sciences 51 21 181 200 in Chinese 董章勇 王振中 2012 植物病原真菌細(xì)胞壁降解 酶的研究進(jìn)展 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 51 21 181 200 Fang ZD 1998 Research methods on plant diseases 3rd edition Bei jing ChinaAgricultural Press in Chinese 方中達(dá) 1998 植病研 究方法 第3版 北京 中國農(nóng)業(yè)出版社 Gerlach W Nirenberg H 1982 The genus Fusarium a pictorial atlas Berlin Dahlem pp 345 350 Hu CZ Sun XT Wang HG Zeng YJ Zheng XW Cui RQ 2016 Purifi cation and characterizationofcellwalldegradingenzymesfrom Fu sarium oxysporum f sp nelumbicola Biological Disaster Science 39 1 14 19 in Chinese 胡長志 孫曉棠 汪和貴 曾雅靜 鄭 興汶 崔汝強(qiáng) 2016 蓮腐敗病菌細(xì)胞壁降解酶的提取及活性分 析 生物災(zāi)害科學(xué) 39 1 14 19 Li C Li JJ 1996 Identification of the causal agent of lily wilt Acta Phytopathologica Sinica 26 2 192 in Chinese 李誠 李俊杰 1996 百合枯萎病病原菌鑒定 植物病理學(xué)報 26 2 192 Li YY Wang YJ Xie ZK Wang RY Qiu Y Pan HQ Hu JC 2013 First report of lily blight and wilt caused by Fusarium tricinctum in China Plant Disease 97 7 993 994 Li WY Liu ZP He XF Wang WH 2016 The pathogen isolation iden tification and pathogenicity of lily blight Journal of ShenyangAg 1118 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報 49卷 ricultural University 47 2 153 158 in Chinese 李琬玥 劉正 坪 何祥鳳 王文和 2016 百合枯萎病病原菌的分離 鑒定及致 病性研究 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 47 2 153 158 Liu B Huang JS Xiao RF 2013 Biology and biological control of Fu sarium oxysporum Beijing Science Press in Chinese 劉波 黃 俊生 肖榮鳳 2013 尖孢鐮孢菌生物學(xué)及其生物防治 北京 科學(xué)出版社 L ffler HJM Straathof TP Mouris JR Baayen RP 1995 Durability of resistance in lily to basal rot evaluation of virulence and aggres siveness among isolates of Fusarium oxysporum f sp lilii Euro pean Journal of Plant Pathology 101 3 261 271 O Donnell K Kistler HC Cigelnik E Ploetz RC 1998 Multiple evo lutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene geneal ogies Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 95 5 2044 2049 Pan QY Zhu MD Deng JL Tang XN 2004 Occurrence and control of lily wilt disease caused by Fusarium Shanghai Agricultural Sci ence and Technology 3 103 104 in Chinese 潘其云 朱明德 鄧建玲 唐祥寧 2004 百合鐮孢菌枯萎病的發(fā)生與防治研究 上海農(nóng)業(yè)科技 3 103 104 Prados Ligero AM Basallote Ureba MJ Melero Vara JM 2008 First report of Fusarium oxysporum f sp lilii