Guihaia Apr 2022 42 4 682 690 http www guihaia DOI 10 11931 guihaia gxzw202007025 席銀凱 楊武德 大花蕙蘭 黃金小神童 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究 J 廣西植物 2022 42 4 682 690 XI YK YANG WD Embryogenic callus induction and plant regeneration of Cymbidium Golden Elf Sundust J Guihaia 2022 42 4 682 690 大花蕙蘭 黃金小神童 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究 席銀凱 楊武德 貴州中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)教研室 貴陽550000 摘 要 為解決大花蕙蘭園藝品種 黃金小神童 Cymbidium Golden Elf Sundust 人工繁育周期長 系數(shù) 低等問題 該研究以其側(cè)芽莖尖為外植體 在1 2MS 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1香蕉泥 15 g L 1蔗糖 中培養(yǎng)60 d后 以獲得的愈傷組織與原球莖混合物為材料 通過L9 3 4正交與完全組合實(shí)驗(yàn)研究不同因素 及組合對 黃金小神童 胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生及增殖的影響 進(jìn)而建立 黃金小神童 高效 穩(wěn)定的叢 芽增殖和植株再生體系 結(jié)果表明 1 在MS 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1椰汁 20 g L 1蔗糖中 培 養(yǎng)70 d后增殖系數(shù)達(dá)8 13 同時可獲得桑葚狀原球莖團(tuán) 2 原球莖團(tuán)在MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA中培養(yǎng)70 d后 原球莖發(fā)育為幼芽 叢芽發(fā)生系數(shù)可達(dá)5 36 此時 將由原球莖誘導(dǎo)得到的簇 狀叢芽轉(zhuǎn)接至MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA中 以 芽繁芽 方式增殖 其增殖系數(shù)也達(dá)到 4 28 此時可建立起穩(wěn)定的增殖體系 3 無菌苗生根則在MS 1 0 mg L 1 NAA 150 g L 1香蕉泥中進(jìn) 行 培養(yǎng)60 d可得到具4 7片真葉 高度為8 10 cm的健壯生根苗 生根率達(dá)96 5 再生苗經(jīng)露苗后移栽 到松樹皮和山基土體積比為3 2的基質(zhì)中 成活率在85 以上 通過愈傷組織與原球莖 胚性愈傷組織與 原球莖 原球莖 叢芽 再生植株途徑最終建立了 黃金小神童 高效 穩(wěn)定的叢芽快速繁殖體系 該研究結(jié) 果為進(jìn)一步開展其人工繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù) 也為蘭科其他物種的無性快速繁殖提供了參考 關(guān)鍵詞 黃金小神童 胚性愈傷組織 原球莖 叢芽 側(cè)芽莖尖 中圖分類號 Q943 1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000 3142 2022 04 0682 09 Embryogenic callus induction and plant regeneration of Cymbidium Golden Elf Sundust XI Yinkai YANG Wude Chemistry Department Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Guiyang 550000 China Abstract In order to solve the obstacle of a long artificial breeding cycle and low coefficient of Cymbidium Golden Elf Sundust the stem tip of the lateral bud was used as the explant for the initial culture in 1 2MS with 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1 banana puree and 15 g L 1 sucrose After 60 d culture the mixture of callus and protocorm was used as the materials for investigating the effects of different factors and combinations on the embryonic callus and protocorm occurrence proliferation via L9 3 4 orthogonal and complete combination experiments Finally an efficient and stable proliferation system of Cymbidium Golden Elf Sundust was established in the present study The results were as follows 1 Proliferation coefficient was 8 13 and the protocorm masses similar to mulberry could be obtained on the MS medium containing 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1 coconut juice and 20 g L 1 sucrose for 70 d 2 The protocorm 收稿日期 2020 09 10 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金 81660647 一流中藥學(xué)專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目 黔高教發(fā) 2017 158號 Supported by National Natural Science Foundation of China 81660647 Construction of First Class Traditional Chinese Medicine Specialty 2017 158 第一作者 席銀凱 1993 碩士研究生 主要從事藥用植物化學(xué)成分研究 E mail xyk xyt 通信作者 楊武德 教授 主要從事藥用植物化學(xué)成分研究 E mail ywd 680708 was cultured in MS medium containing 1 0 mg L 1 6 BA and 1 0 mg L 1 NAA for 70 d the protocorm developed into shoots with a 5 36 bud proliferation coefficient At this time cluster buds induced from protocorm were transferred into MS medium with 1 0 mg L 1 6 BA and 1 0 mg L 1 NAA to proliferate via the proliferation mode of bud to bud and the proliferation coefficient reached 4 28 and the stable proliferation system could be established 3 The rooting rate was up to 96 5 in MS medium equipped with 1 0 mg L 1 NAA and 150 g L 1 banana puree and the healthy seedlings with 4 7 true leaves and a height of 8 10 cm could be obtained after 60 d culture The survival rate of seedlings was more than 85 when they were transplanted into polyethylene basin with a volume ratio of pine bark to mountain soil of 3 2 In this study the efficient and rapid propagation system of cluster bud of Cymbidium Golden Elf Sundust was established by the pathway of callus and protocorm to embryonic callus and protocorm to protocorm to cluster bud to regeneration plant which provides an experimental basis for further artificial breeding and genetic transformation Meanwhile this protocol also provides the reference for asexual rapid propagation of other Orchidaceae species Key words Cymbidium Golden Elf Sundust embryonic callus protocorm cluster bud the stem tip of the lateral bud 蘭科是世界上最龐大的植物科之一 多達(dá) 20 000 30 000種 大多具有極高觀賞價值 Chugh et al 2009 黃金小神童 Cymbidium Golden Elf Sundust 為小花型品種 葉片尖挺 總狀花 序 著花十余朵 該品種一年四季均能開花 在珠三 角地區(qū)多夏秋季開放 可人為控制花期 在花開之 季 不僅能看到金光燦燦的花朵 還能聞到陣陣幽 香 朱根發(fā)和徐曄春 2011 朱根發(fā) 2012 但 黃 金小神童 歸屬何種存在較大的爭議 據(jù)文獻(xiàn)報道 由于其開花物候和性狀更接近于建蘭 C ensifolium 的生長特性 故把其歸于建蘭品種 王濟(jì) 紅等 2014 但也有文獻(xiàn)報道 黃金小神童 為10 多年前由我國臺灣地區(qū)虎頭蘭和四季蘭雜交 C hybridium C ensifolium 而得 余洪 2005 因此一 些研究者將 黃金小神童 歸于大花蕙蘭品種 韓明 等 2012 姚婧等 2015 綜合考慮前人的看法 該 研究將 黃金小神童 歸為大花蕙蘭品種 大花蕙蘭 C hybridium 因其株型 花型大 花 多 花期長且每年春節(jié)期間開放 故在中國蘭花市 場上獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷 其又名虎頭蘭 東亞蘭和西姆比 蘭 為蘭科 Orchidaceae 蘭屬 Cymbidium 多年生 草本 是蘭屬部分附生性種類的雜交種 因與蕙蘭 C faberi 較相似且花朵碩大 故稱大花蕙蘭 劉 園和王四清 2005 大花蕙蘭傳統(tǒng)繁殖方式為分 株繁殖和種子繁殖 分株繁殖盡管能夠保持母本 性狀 但效率低 增殖倍數(shù)只有1 3倍 且周期較 長 難以滿足工廠化生產(chǎn)的需要 劉園和王四清 2005 而大花蕙蘭種子細(xì)小 缺乏胚乳且胚發(fā)育 不完全 萌發(fā)率極低 即使萌發(fā)成功 生長速度也 非常緩慢 從種子萌發(fā)成苗到能進(jìn)行性狀鑒定的 開花植株一般需要4 5 a 甚至更久 且無法準(zhǔn)確 判斷其品種特性保持與否 陳箐瑛和藍(lán)賀勝 2004 現(xiàn)代大花蕙蘭繁殖方式多為組織培養(yǎng) 可 對優(yōu)良材料進(jìn)行快速繁殖 比常規(guī)方法快數(shù)萬到 數(shù)十萬倍 并能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和以及雜種胚 發(fā)育不良的問題 不受地區(qū) 季節(jié)和氣候限制 曹 孜義和劉國民 2002 自Morel 1960 用大花蕙蘭的莖尖在含有細(xì)胞 分裂素的KC培養(yǎng)基上培養(yǎng) 首次獲得了蘭花無病 毒植株后 蘭花的組織培養(yǎng)逐漸興起 目前 我國 蘭科植物的組培研究主要集中在兜蘭屬 Paphiopedilum 龍波和龍春林 2006 杜鵑蘭屬 Cremastra 張明生等 2005 獨(dú)蒜蘭屬 Pleione 李招文和陳文光 1988 石斛屬 Dendrobium 吳 志剛等 2005 和白及屬 Bletilla 張愛麗等 2018 等 不同學(xué)者對蘭花組織培養(yǎng)的途徑以及影響因 素進(jìn)行了大量研究 利用不同外植體再結(jié)合適宜的 植物生長調(diào)節(jié)劑 人為創(chuàng)造適合蘭花生長發(fā)育的小 環(huán)境 可以實(shí)現(xiàn)不同品種蘭花的植株再生 從而達(dá) 到保護(hù)瀕危蘭花 保持雜交蘭種性以及使一部分品 種商品化的目的 黃金小神童 為雜交種 花色艷 麗且氣幽香 極具觀賞價值 為了推廣新品種 達(dá)到 工廠化生產(chǎn)的目的 很有必要對其進(jìn)行組織培養(yǎng)研 究 因此 該研究以 黃金小神童 側(cè)芽莖尖為外植 體 試圖誘導(dǎo)愈傷組織 再誘導(dǎo)具有胚性而直接產(chǎn) 生原球莖 進(jìn)而通過原球莖萌發(fā)成苗 最終建立 黃 金小神童 高效 穩(wěn)定的叢芽快速繁殖體系 為進(jìn)一 步開展其人工繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù) 同時 也可為蘭科其他物種的無性快速繁殖提供參考 1 材料與方法 1 1材料和消毒 5盆 黃金小神童 植株由云南春之蘭花卉有 限公司贈送 植株經(jīng)云南文山學(xué)院丁長春博士鑒 定為Cymbidium Golden Elf Sundust 選取形態(tài) 3864期席銀凱等 大花蕙蘭 黃金小神童 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究 健康無病害植株的側(cè)芽莖尖 輕輕刷去表皮污漬 后 先用10 的洗衣粉溶液 質(zhì)量比 浸泡10 min 再用流水沖洗30 min 然后置于超凈工作臺中 用 75 的乙醇 體積比 表面消毒5 min 再用0 1 的HgCl2 質(zhì)量比 消毒10 min 最后用無菌水漂洗 6次 每次不少于3 min 植物生長調(diào)節(jié)劑6 芐氨 基嘌呤 6 BA 1 萘乙酸 NAA 蔗糖和瓊脂均為 分析純 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公 司 活性炭 AC 購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有 限公司 天然附加物椰子和香蕉購自農(nóng)貿(mào)市場 1 2方法 1 2 1培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基為1 2MS和MS 附加 瓊脂4 7 g L 1 蔗糖除起始培養(yǎng)和正交試驗(yàn)培養(yǎng) 基外 其他均為30 g L 1 pH值5 4 5 8 培養(yǎng)基 在122 滅菌25 min備用 1 起始培養(yǎng)基 根據(jù) 課題組對蘭科的研究經(jīng)驗(yàn) 采用1 2MS 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1香蕉泥 15 g L 1蔗糖作 為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 未發(fā)表資料 2 胚性 愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)基 MS 為基本培養(yǎng)基 添加不同質(zhì)量和體積濃度的6 BA 0 1 1 0 2 0 mg L 1 椰汁 50 100 150 mL L 1 和蔗糖 20 30 40 g L 1 采用L9 3 4正交試 驗(yàn) 表1 培養(yǎng)70 d后 記錄各組生長情況并統(tǒng) 計增殖系數(shù) 3 叢芽發(fā)生培養(yǎng)基 在MS中添加 不同質(zhì)量濃度的6 BA 0 1 1 0 2 0 mg L 1 和 NAA 0 1 0 5 1 0 mg L 1 進(jìn)行完全組合實(shí)驗(yàn) 探 究不同激素組合對叢芽發(fā)生的影響 70 d后 記 錄各組生長情況并統(tǒng)計叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系 數(shù) 4 叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng)基 根據(jù)上一步叢芽 發(fā)生的情況 采用與之相同的培養(yǎng)基 以 芽繁芽 方式進(jìn)行叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng) 培養(yǎng)3代后計算 芽的平均增殖系數(shù) 5 生根培養(yǎng)基 在MS中添 加不同質(zhì)量的NAA 0 1 0 5 1 0 mg L 1 和香蕉 泥 50 100 150 g L 1 進(jìn)行完全組合實(shí)驗(yàn) 附加 0 5 g L 1AC 培養(yǎng)60 d后 記錄各組生長情況并 統(tǒng)計生根率 1 2 2培養(yǎng)條件與接種方法 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫 度控制在 22 1 光照強(qiáng)度1 500 2 000 lx 光照時間10 h d 1 接種方法 起始培養(yǎng)時將消 毒處理好的側(cè)芽莖尖接于培養(yǎng)基中 每瓶1個材 料 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖培養(yǎng) 將 愈傷組織和少量原球莖混合物切割為0 5 cm 0 5 cm大小轉(zhuǎn)接入各正交組中 每組20瓶 每瓶 15個材料 叢芽發(fā)生培養(yǎng) 將原球莖團(tuán)塊分割成1 cm 1 cm大小接入完全組合實(shí)驗(yàn)組中 每組20 瓶 每瓶15個材料 叢芽增殖與復(fù)壯培養(yǎng) 2 4 表1 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與 增殖同步L9 3 4正交設(shè)計 Table 1 L9 3 4 orthogonal design for occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 水平 Level 因素Factor A 6 BA mg L 1 B 椰汁 Coconut juice mL L 1 C 蔗糖 Sucrose g L 1 1 0 1 50 20 2 1 0 100 30 3 2 0 150 40 棵幼苗為一叢 剪去葉片的2 3再接入新鮮培養(yǎng) 基中 每瓶12叢 共30瓶 生根培養(yǎng) 選取生長健 壯的單苗 剪去2 3葉片接入培養(yǎng)基 每組20瓶 每瓶12個材料 以上各實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次 如出 現(xiàn)污染則重新取材補(bǔ)足各組接種瓶數(shù) 1 2 3煉苗移栽 待生根苗長至8 10 cm 根長2 4 cm時 將生根瓶置于室外適應(yīng)環(huán)境3 d 小心取 出生根苗 洗凈根部殘余的培養(yǎng)基 用質(zhì)量比為 0 1 的多菌靈溶液浸泡5 min 取出晾至根部微微 發(fā)白 移栽至經(jīng)高錳酸鉀消毒的碎松樹皮與山基 土 體積比為3 2 中保溫 20 25 保濕 75 95 60 d后統(tǒng)計成活率以及生長情況 1 2 4統(tǒng)計指標(biāo) 所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS 19 0 軟件處理分析 增殖系數(shù) 有效轉(zhuǎn)接瓶數(shù) 原始接種瓶數(shù) 叢芽增殖系數(shù) 有效轉(zhuǎn)接瓶數(shù) 原 始接種瓶數(shù) 生根率 產(chǎn)生不定根的單苗 數(shù) 接種材料總數(shù) 100 成活率 成活苗 數(shù) 移栽總苗數(shù) 100 2 結(jié)果與分析 2 1起始培養(yǎng) 將 黃金小神童 的側(cè)芽莖尖接種于起始培養(yǎng) 基上 7 d后與培養(yǎng)基接觸部位開始膨大 圖1 A 培養(yǎng)30 d后 可以看到莖尖被愈傷組織與原 球莖所包圍 圖1 B 培養(yǎng)60 d后 在體視顯微 鏡下可觀察到愈傷組織與原球莖的混合培養(yǎng)物 圖1 C 2 2胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同步培養(yǎng) 將培養(yǎng)60 d后的愈傷組織和少量原球莖混合 物切割為0 5 cm 0 5 cm大小轉(zhuǎn)接入胚性愈傷組 織和原球莖發(fā)生與增殖同步培養(yǎng)基中 培養(yǎng)結(jié)果 見表2 表3與表4 由表2正交試驗(yàn)結(jié)果表明 各 486廣 西 植 物42卷 A 培養(yǎng)7 d后 膨大的側(cè)芽莖尖 B 培養(yǎng)30 d后 愈傷組織與原球莖發(fā)生 C 培養(yǎng)60 d后 體視鏡下的愈傷組織與原球莖的混合物 A After 7 d culture swollen stem tip of lateral bud B After 30 d culture callus and protocorm occurred C After 60 d culture the mixture of the callus and the protocorm under stereoscope 圖1 起始培養(yǎng) Fig 1 Initial culture 因數(shù)間極差按降序的方式排列為R6 BA 1 554 R椰汁 0 326 R蔗糖 0 260 RError 0 194 這3種 因素的R值均大于空白列 表明3種因素對胚性 愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖的效應(yīng)均是可靠 的 由方差分析結(jié)果可知 表3 6 BA對胚性愈 傷組織和原球莖發(fā)生與增殖有統(tǒng)計學(xué)意義 P0 05 對 6 BA的3個水平進(jìn)行Duncan檢驗(yàn) 表4 可知 6 BA的水平3 2 0 mg L 1 對胚性愈傷組織和原 球莖發(fā)生與增殖的效果較其他兩個水平 0 1 mg L 1與1 0 mg L 1 顯著 通過平均值分析 黃金 小神童 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖同 步培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為A3B3C1 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1椰汁 20 g L 1蔗糖 在此培養(yǎng)基 中 培養(yǎng)70 d后增殖系數(shù)達(dá)到8 13 在此培養(yǎng)基中 培養(yǎng)15 d后 胚性愈傷組織與 原球莖混合物的顏色由嫩綠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G 圖 2 A B 培養(yǎng)45 d后 肉眼可見其體積逐漸增大 從體視鏡下觀察到其質(zhì)地緊密 形成由原球莖組 成的桑葚狀團(tuán)塊 圖2 C 培養(yǎng)70 d后 培養(yǎng)基表 面基本被原球莖覆蓋 圖2 D 此時在進(jìn)行下一 階段的轉(zhuǎn)接中發(fā)現(xiàn) 原球莖下面還存在少量的胚 性愈傷組織 為了保證叢芽發(fā)生的一致性 在下一 階段轉(zhuǎn)接過程中 只轉(zhuǎn)接表面的原球莖團(tuán)塊 盡量 舍棄下面的胚性愈傷組織 故此階段計算的增殖 系數(shù)為原球莖增殖系數(shù) 2 3叢芽發(fā)生培養(yǎng) 在胚性愈傷組織和原球莖發(fā)生與增殖的培養(yǎng) 中 僅少數(shù)原球莖可以直接發(fā)育為幼苗 效果并不 理想 因此 將原球莖團(tuán)塊進(jìn)行叢芽發(fā)生培養(yǎng) 培 養(yǎng)結(jié)果見表5 表5完全組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 在NAA濃度一 定的情況下 叢芽發(fā)生系數(shù)和增殖系數(shù)與6 BA呈 正相關(guān) 當(dāng)6 BA為1 0 mg L 1時 達(dá)到最大值 當(dāng) 6 BA濃度超過1 5 mg L 1時呈負(fù)相關(guān) 在此階 段的各實(shí)驗(yàn)組中 雖然原球莖團(tuán)塊均能發(fā)育成幼 芽 但叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)上存在顯著差異 其中 8號的叢芽長勢相對較好 叢芽發(fā)生系數(shù)與 增殖系數(shù)最高 分別為12 34和5 36 在其他組中 幼芽的生長較慢 且叢芽發(fā)生系數(shù)與增殖系數(shù)均 低于8號培養(yǎng)基 因此 最佳的叢芽發(fā)生與增殖 培養(yǎng)基為8號 即MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA 在此培養(yǎng)基中 將1 cm 1 cm大 小原球莖團(tuán)塊轉(zhuǎn)入8號培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后 原球 莖團(tuán)塊表面有白色芽點(diǎn)出現(xiàn) 圖3 A 培養(yǎng)25 d 后 從體視鏡下觀察到原球莖頂端第一片真葉形 成 圖3 B 培養(yǎng)35 d后 伴隨原球莖團(tuán)塊增大 的同時在體視鏡下觀察到錐形叢芽形成 圖3 C 培養(yǎng)50 d后原球莖團(tuán)塊增殖速度逐漸減慢 大量叢芽發(fā)生 圖3 D 從 黃金小神童 的實(shí)際情況來看 培養(yǎng)至此階 段 發(fā)生的叢芽纖細(xì)且瘦弱 若直接進(jìn)行生根培養(yǎng) 移栽成活率較低 故將生長60 d的幼苗再接入8 號培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng) 圖4 A C 連續(xù)培養(yǎng)3 代后 不僅可以解決苗纖細(xì) 瘦弱 成活率低的問 題 而且每代培養(yǎng)均可保持良好的增殖系數(shù) 5864期席銀凱等 大花蕙蘭 黃金小神童 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究 A 剛接入的胚性愈傷組織與原球莖混合物 B 培養(yǎng)15 d后的胚性愈傷組織與原球莖混合物 C 桑葚胚 D 培養(yǎng)70 d后大量 的原球莖 A Mixture of embryonic callus and protocorm just cultured B Mixture of embryonic callus and protocorm cultured for 15 d C Morula D A large number of procorms cultured for 70 d 圖2 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與增殖 Fig 2 Occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm A 布滿白色芽點(diǎn)的原球莖團(tuán)塊 B 原球莖頂部的第一片真葉形成 C 錐形叢芽 D 簇狀叢芽 A Protocorm mass were dotted with white bud points B The first true leaf at the top of the protocorm formed C Conical cluster buds D Cluster buds 圖3 叢芽發(fā)生培養(yǎng) Fig 3 Cluster bud occurrence culture 2 4生根和移栽 NAA和香蕉泥對 黃金小神童 生根影響如表 6所示 對于 黃金小神童 生根誘導(dǎo)來說 在0 5和 1 5 mg L 1 NAA時 同一濃度各組間生根率無顯著 性差異 而隨香蕉泥濃度的增大 生根率有所升高 當(dāng)NAA為1 0 mg L 1 香蕉泥為150 g L 1時 與 其他兩組有顯著性差異 苗的整體生根率較其他處 理組好 因此 本研究認(rèn)為8號為 黃金小神童 的 最佳生根培養(yǎng)基 培養(yǎng)60 d后生根率達(dá)96 5 單 苗轉(zhuǎn)入此培養(yǎng)基15 d后 新芽原基開始出現(xiàn) 圖5 A B 培養(yǎng)30 d后 生根瓶可見白色根尖 圖5 C D 培養(yǎng)45 d后 可以明顯看到其莖增粗 根伸長 圖5 E F 培養(yǎng)65 d后根系發(fā)達(dá) 圖5 G 將試 管苗煉苗后移栽至消毒的碎松樹皮和山基土 3 2 中 圖5 H 60 d后 成活率在85 以上 3 討論與結(jié)論 3 1 黃金小神童 人工快繁中的增殖途徑 蘭科植物由于自身的生物學(xué)特性 自然繁殖 系數(shù)極低 利用組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得大量種苗的 有效途徑 Arditti 2009 原球莖的誘導(dǎo)與增殖 則是蘭科植物人工快繁的關(guān)鍵 也是這一特殊植 物類群從有性生殖向無性生殖特征轉(zhuǎn)變的必要步 驟 Chen Chang 2001 蘭科植物通過原球莖 繁殖有3種途徑 1 外植體 原球莖 叢芽 生 根 2 外植體 原球莖 次生原球莖 叢芽 生根 3 外植體 愈傷組織 原球莖 叢芽 生根 Mahendran Bai 2012 Zeng et al 2013 在 這3種方式中 大多按 1 和 2 形成特有的原球 686廣 西 植 物42卷 A 剛接入培養(yǎng)基的幼苗 B 培養(yǎng)15 d后的幼苗 C 培養(yǎng)30 d后的幼苗 A Seedlings just cultured in the medium B Seedlings cultured for 15 d C Seedlings cultured for 30 d 圖4 復(fù)壯培養(yǎng) Fig 4 Rejuvenation culture A B 培養(yǎng)15 d后新芽原基出現(xiàn) C D 培養(yǎng)30 d后根尖出現(xiàn) E F 生根培養(yǎng)45 d G 生根培養(yǎng)65 d H 移栽苗 A B New bud primordium appeared after 15 d culture C D Root tip appeared after 30 d culture E F Rooting cultured for 45 d G Rooting cultured for 65 d H Transplanting plantlets 圖5 瓶內(nèi)苗生根培養(yǎng)及移栽 Fig 5 Rooting culture and transplanting of test tube plantlets 莖 類原球莖或肉質(zhì)根狀莖 極少產(chǎn)生愈傷組織或 胚性愈傷組織 陳繼敏等 2008 丁蘭等 2014 Sajise Sagawa 1991 報道了蝴蝶蘭胚性愈傷組 織的形成 但沒有詳細(xì)描述愈傷組織誘導(dǎo)的方法 此外 Kobayashi等 1993 利用愈傷組織作為原生 質(zhì)體的來源 成功地從蘭科植物原生質(zhì)體中獲得 植株再生 但關(guān)于愈傷組織形成的詳細(xì)信息尚不 清楚 而 黃金小神童 側(cè)芽莖尖一旦誘導(dǎo)出愈傷 組織 隨即出現(xiàn)原球莖 愈傷組織增殖并不十分明 顯 隨著原球莖的增殖 其結(jié)構(gòu)上的兩極性逐漸 顯現(xiàn) 頂端形成的葉原基處分化形成芽 基部擬根 狀結(jié)構(gòu)發(fā)育為根 最后形成幼苗 由于原球莖數(shù)量 較多 培養(yǎng)物在形態(tài)上呈現(xiàn)出叢芽的狀態(tài) 這可能 是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的不同所致 從這一現(xiàn)象來看 黃 金小神童 原球莖繁殖介于上述 2 和 3 之間 在兜蘭 Paphiopedilum maudiae 中也有過類似現(xiàn) 7864期席銀凱等 大花蕙蘭 黃金小神童 胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究 表2 不同處理對胚性愈傷組織和 原球莖的發(fā)生與增殖的影響 Table 2 Effects of different treatments on occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 處理 Treatment 因素 Factor A 6 BA mg L 1 B 椰汁 Coconut juice mL L 1 C 蔗糖 Sucrose g L 1 D 誤差 Error 增殖系數(shù) Proliferation coefficient 1 0 1 50 20 1 6 28 2 0 1 100 30 2 6 12 3 0 1 150 40 3 6 30 4 1 0 50 30 3 7 03 5 1 0 100 40 1 7 15 6 1 0 150 20 2 7 36 7 2 0 50 40 2 7 38 8 2 0 100 20 3 7 97 9 2 0 150 30 1 8 01 K1 6 233 6 897 7 203 7 147 K2 7 180 7 080 7 053 6 953 K3 7 787 7 223 6 943 7 100 R 1 554 0 326 0 260 0 194 表3 胚性愈傷組織和原球莖的發(fā)生與 增殖的方差分析結(jié)果 Table 3 Analysis of variance of occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 源 Source 型 平方和 Sum of square 自由度 df 均方 Mean square F值 F value 顯著性 Significance A 6 BA 3 677 2 1 839 34 033 P0 05 C蔗糖 Sucrose 0 102 2 0 051 0 079 P 0 05 D誤差 Error 0 061 2 0 031 0 046 P 0 05 象的報道 周慧君 2016 黃金小神童 原球莖 發(fā)育為幼苗后 其基部愈傷組織和原球莖混合物 的生長明顯受到抑制 推測為自身產(chǎn)生的生長素 與外源激素產(chǎn)生拮抗作用 導(dǎo)致愈傷組織增殖受 阻 而轉(zhuǎn)變?yōu)橐?芽繁芽 即形成叢生芽的方式來 進(jìn)行增殖 本研究結(jié)果表明 在 黃金小神童 人 工快繁早期 應(yīng)以愈傷組織和原球莖混合物為主 要增殖對象 該混合物亦是人工快繁和遺傳轉(zhuǎn)化 的最佳材料 原球莖大量發(fā)育為幼苗時 則以 芽 繁芽 方式為主 因此可以達(dá)到最有效的增殖目的 表4 6 BA 3水平Duncan檢驗(yàn) Table 4 Duncan s test in three levels of 6 BA 水平Level均值Mean 0 05水平0 05 level 3 2 0 mg L 1 7 787 a 2 1 0 mg L 1 7 180 b 1 0 1 mg L 1 6 233 c 注 同列不同小寫字母表示差異性顯著 P 0 05 下同 Note Different lowercase letters in the same column indicate significant differences P 0 05 The same below 表5 不同植物激素配比對叢芽發(fā)生與增殖的影響 Table 5 Effects of different plant hormone ratios on cluster bud occurrence and proliferation 處理 Treatment 6 BA mg L 1 NAA mg L 1 叢芽發(fā)生 系數(shù) Cluster bud occurrence coefficient 叢芽增殖 系數(shù) Cluster bud proliferation coefficient CK 0 0 6 69 0 15e 4 40 0 11e 1 0 5 0 1 10 62 0 09cd 4 95 0 23bcd 2 1 0 0 1 11 27 0 14b 5 16 0 15ab 3 1 5 0 1 11 26 0 10b 5 10 0 17bc 4 0 5 0 5 10 62 0 17cd 4 77 0 18d 5 1 0 0 5 11 29 0 20b 5 18 0 25ab 6 1 5 0 5 10 54 0 08b 4 99 0 09bcd 7 0 5 1 0 10 72 0 13c 4 92 0 16cd 8 1 0 1 0 12 34 0 16a 5 36 0 12a 9 1 5 1 0 11 26 0 19b 5 18 0 20ab 注 叢芽增殖系數(shù)為增殖復(fù)壯培養(yǎng)中3代的平均增殖系數(shù) Note Cluster bud proliferation coefficient is the average proliferation coefficient of three generations in the cluster bud proliferation and rejuvenation culture 3 2外源性因素對 黃金小神童 體外快繁的影響 外源激素種類及濃度在 黃金小神童 體外快 繁中起著重要作用 在胚性愈傷組織和原球莖發(fā) 生與增殖過程中 6 BA起主要作用 對胚性愈傷組 織和原球莖發(fā)生與增殖具有促進(jìn)作用 在叢芽發(fā) 生與增殖復(fù)壯過程中 6 BA單獨(dú)使用效果明顯優(yōu) 于空白對照 而遠(yuǎn)不如與NAA組合使用的效果 推測 黃金小神童 在上述培養(yǎng)過程中強(qiáng)烈依賴于 6 BA 而NAA對6 BA則有明顯的協(xié)同作用 NAA 和6 BA這種需求的差異可能反映了植物生長時 內(nèi)源性物質(zhì)含量的差異 王育選等 2016 研究了 886廣 西 植 物42卷 表6 不同質(zhì)量濃度的NAA和香蕉泥對生根培養(yǎng)的影響 Table 6 Effects of NAA and banana puree at different concentrations on rooting culture 處理 Treatment NAA mg L 1 香蕉泥 Banana puree g L 1 生根率 Rooting rate CK 0 0 46 3 0 1f 1 0 5 50 94 5 0 2d 2 1 0 50 95 4 0 1bc 3 1 5 50 92 6 0 1e 4 0 5 100 94 7 0 2d 5 1 0 100 95 9 0 1b 6 1 5 100 92 9 0 2e 7 0 5 150 95 0 0 1cd 8 1 0 150 96 5 0 2a 9 1 5 150 93 1 0 2e 不同激素與NAA的組合 最后認(rèn)為6 BA與NAA 組合 可實(shí)現(xiàn)大花蕙蘭叢芽的高效增殖 Rodrigues等 2015 證明了生長素與細(xì)胞分裂素的 比值對桑葚胚的體外繁殖有一定影響 在不添加 或添加NAA的情況下 培養(yǎng)基中只要存在6 BA 都可促使桑葚胚發(fā)育成芽 而在 黃金小神童 的 預(yù)生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中 本課題組曾添加較低濃度的 6 BA與NAA組合使用 結(jié)果顯示試管苗發(fā)育的根 長度較短甚至出現(xiàn)生根困難現(xiàn)象 導(dǎo)致移栽苗很 難成活 推測可能是由于在胚性愈傷組織和原球 莖發(fā)生 增殖與叢芽發(fā)生與增殖過程中 長時間培 養(yǎng)于存在6 BA的培養(yǎng)基中 導(dǎo)致大量細(xì)胞分裂素 積累 與外源6 BA產(chǎn)生拮抗作用 因此 在 黃金 小神童 的生根培養(yǎng)中 由于其具較高水平內(nèi)源性 細(xì)胞分裂素 所以單獨(dú)使用外源生長素即可獲得 較好的生根效果 這與低濃度的NAA有利于大 花蕙蘭生根的觀點(diǎn)一致 胡琳 2013 此外 糖類和AC在 黃金小神童 體外快繁中 也具有不可忽視的作用 據(jù)現(xiàn)有報道 有些植物 在啟動培養(yǎng)中 通過調(diào)節(jié)蔗糖代謝酶可以提高產(chǎn) 量 Kaur et al 2005 該實(shí)驗(yàn)蔗糖的加入可能打 破胚性愈傷組織與原球莖發(fā)生過程中各種糖類代 謝的平衡 從而促進(jìn)了胚性愈傷組織與原球莖的 發(fā)生與增殖 在生根培養(yǎng)中 還加入了AC AC有 較強(qiáng)的吸附作用 可吸附培養(yǎng)基中的酚 醌等有害 物質(zhì) 根莖具有避光生長的特性 使用AC可創(chuàng)造 根系生長所需的環(huán)境 此外 AC的存在可能提高 了培養(yǎng)物體內(nèi)可溶性蛋白和總糖的含量 從而促 進(jìn)根的發(fā)育 孫占育等 2010 3 3天然附加產(chǎn)物在 黃金小神童 體外快繁中的作用 近幾十年來 在植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常加入天然 附加產(chǎn)物 它們大多含有糖 氨基酸 酶 植物激素 維生素等物質(zhì) 對細(xì)胞和組織的增殖有明顯的促進(jìn) 作用 在蘭科植物的人工快繁中 不同天然附加產(chǎn) 物對誘導(dǎo) 增殖和分化 生根和壯苗等不同培養(yǎng)階 段有十分積極的作用 Arditti 2009 Arditti 1966