專利:杜鵑根腐病病原菌的特異性檢測靶標Ppini_05588及應(yīng)用.pdf
19 國家知識產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明 專利申請 10 申請公布號 43 申請公布日 21 申請 號 202210232204 2 22 申請日 2022 03 09 71 申請人 南京林業(yè)大 學 地址 210018 江蘇省南京市玄武區(qū)龍蟠路 159號 申請人 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心 72 發(fā)明人 戴婷 婷 周紫薇 楊靜 錢茱希 吳翠萍 74 專利代理 機構(gòu) 鎮(zhèn)江至睿專利代理事務(wù)所 普通 合 伙 3252 9 專利代理師 劉靜 51 Int Cl C12Q 1 6895 2018 01 C12Q 1 686 2018 01 C12N 15 11 2006 01 C12R 1 645 2006 01 54 發(fā)明名稱 杜鵑根腐病病原菌的特異性檢測靶標 Ppini 05588及應(yīng)用 57 摘要 本發(fā)明公開了一種引起杜鵑根腐病的病原 菌Phytophthora pini的特異性檢測靶標Ppini 05588 該檢測靶標Ppini 05588的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 CDS序列如SEQ ID NO 1所示 蛋白 序列如SEQ ID NO 2所示 同時 還公開了特異性 檢測靶標Ppini 05588的引 物對 其正向引 物序 列如SEQ ID NO 3所示 反向引物序列如SEQ ID NO 4所示 本發(fā)明所發(fā)掘的檢測靶標和其設(shè)計的 引物對用于普通PCR 其特異性強 靈敏度高 為 杜鵑根腐病的病原菌P pini的檢測提供了新的 技 術(shù)方法 權(quán)利要求書1頁 說明書12頁 序列表6頁 附圖2頁 CN 114457186 A 2022 05 10 CN 114457186 A 1 一種引起杜鵑根腐病病原菌P pini的特異性檢測靶標Ppini 05588 其特征在于 所 述檢測標靶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 2 一種檢測杜鵑根腐病病原菌P pini的引物對 其特征在于 所述引物對包括正向引 物和反向引物 所述正向引物Ppi05588 PCR F1序列如SEQ ID NO 3所示 反向引物 Ppi05588 PCR R1序列如SEQ ID NO 4所示 3 權(quán)利要求2所述的引物對在檢測杜鵑根腐病 病原菌P pi ni中的應(yīng)用 4 一種檢測杜鵑根腐病病原菌P pini的試劑盒 其特征在于 至少包括1次用量的含有 權(quán)利要求3所述的引物對的檢測溶 液 其中所述引物組合濃度為20 M 5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒 其特征在于 所述檢測溶液還包括 4種dNTP各2000 M 10 0 L 10 PCR反應(yīng)緩沖液 80mM Mg2 10 0 L 1 BSA 5 0單位Taq酶 6 權(quán)利要求 4 5任一所述的試劑盒在檢測杜鵑根腐病 病原菌P pi ni中的應(yīng)用 7 一種檢測杜鵑根腐病病原菌P pini的方法 其特征在于 包括以下步驟 取1 L檢測 對象的DNA溶液 加入23 L權(quán)利要求5中所述的檢測溶液和1 L滅菌去離子水 總體積為25 L PCR擴增程序為94 變性3分鐘 94 變性30秒鐘 58 退火30秒 72 延伸45秒鐘 33個 循環(huán) 最后72 延伸10分鐘 權(quán) 利 要 求 書 1 1 頁 2 CN 114457186 A 杜鵑根腐病 病原菌的特異性檢測靶標Ppini 05 588及應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明屬于杜鵑根腐病病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域 具體涉及杜鵑根腐病病原菌 Phytophthora pini的特異性檢測靶標Ppi ni 05588及應(yīng)用 背景技術(shù) 0002 Phytophthora pini是一種重要的卵菌植物病原體 P pini能夠引起杜鵑根部的 腐爛以及 枝干潰瘍 目前已發(fā)現(xiàn)P pini能在杜鵑 挪威云杉 楊 樹 歐洲山毛櫸樹 橄欖樹等 植物上致病 目前對該病還沒有有效的防治措施 防止病原菌的傳播擴散是控制該病的最 有效措施 因此為了更有效地檢測該病菌 建立快速檢測方法 為病害的風險及研究決策提 供依據(jù) 從而 有利于降低該病害的發(fā)生對生態(tài) 環(huán)境的保護起到一定的作用 0003 傳統(tǒng)的卵菌分類鑒定主要是基于形態(tài)學特征 致病性測定 生理生化特征等 傳統(tǒng) 的分離疫腐霉的方法采是用誘捕法從土壤 灌溉水和 植物材料中分離 傳統(tǒng)方法在疫霉菌 的檢測中發(fā)揮了重要作用 但是費時費力而且要求操作者具備專業(yè)的疫霉菌分離 形態(tài)學 鑒定知識和豐富的經(jīng)驗 同時傳統(tǒng)分類鑒定方法耗時長 靈敏度低 易受人為及環(huán)境等諸多 因素 的干擾 不能在病害潛伏期和發(fā)病初期做出診斷 很難對病害發(fā)生進行及時的監(jiān)測和 有效控制 所以為了快速并準確的檢測到病原菌 發(fā)掘特異性好的靶基因是目前所有檢測 技術(shù)的核心 不同的靶標序列檢測的特異性和靈敏度存在一定的差距 因選擇 的目標靶序 列不同 片段大小不同 結(jié)果 都會有很大差別 靶標基因的選擇要確保其在種內(nèi)的不同菌株 間的高度保守 而在種間變異性較高 0004 綜上所述 發(fā)掘高信賴度特異性分子檢測靶標并基于新靶標建立靈敏 準確的檢 測技術(shù)體系對提升對杜鵑根腐病病原菌P pini的快速分子檢測 研究及其檢測時所致病害 早期診斷具有重要作用 發(fā)明內(nèi)容 0005 針對現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)問題 本發(fā)明提供一種杜鵑根腐病病原菌P pi ni的檢測 靶標Ppini 05588及基于新檢測靶標其PCR檢測引物組合物 本發(fā) 明的另一目的是提供上述 杜鵑根腐病 病原菌P pi ni的PCR檢測試劑盒 0006 第一方面 本發(fā)明提供了一種引起杜鵑根腐病病原菌P pini的特異性檢測靶標 Ppini 05588 所述檢測標靶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 0007 第二方面 本發(fā)明提供了一種檢測 杜鵑根腐病病原菌P pini 的引物對 所述引物 對包括正向引物和反向引物 所述正向引物Ppi05588 PCR F1序列如SEQ ID NO 3所示 反 向引物Ppi0 5588 PCR R1序列如SEQ ID NO 4所示 0008 第三方面 本 發(fā)明提供了第二方面所述的引物對在 檢測杜鵑根腐病病原菌P pini 中的應(yīng)用 0009 第四方面 本發(fā)明還提供了一種檢測 杜鵑根腐病病原菌P pini 的試劑盒 至少包 括 1次用量的含有本發(fā)明第二方面所述的引物對的檢測溶液 其中所述引物組合濃度為20 說 明 書 1 12 頁 3 CN 114457186 A M 0010 進一步地 所述檢測溶液還包括 4種dNTP各2000 M 100 L 10 PCR反應(yīng)緩沖液 80mM Mg2 10 0 L 1 BSA 5 0單位Taq酶 0011 第五方面 本發(fā)明還提供了第四方面所述的試劑盒在檢測杜鵑根腐病病原菌 P pini中的應(yīng)用 0012 第六方面 本發(fā)明還提供了一種檢測 杜鵑根腐病病原菌P pini 的方法 包括以下 步驟 取1 L檢測對象 的DNA溶液 加入23 L本發(fā) 明第四方面中所述的檢測溶液和1 L滅菌去 離子水 總體積為25 L PCR擴增程序為94 變性3分鐘 94 變性30秒鐘 58 退火30秒 72 延伸45秒鐘 3 3個 循環(huán) 最后72 延伸10分鐘 0013 相比于現(xiàn)有技 術(shù) 本發(fā)明的優(yōu)點 為 0014 1 本發(fā)明首次公開了高信賴度特異性分子檢測靶標Ppini 05588 并基于該新靶 標建立靈敏 準確P CR檢測技術(shù)體系 對提升對杜鵑根腐病病原菌P pini的快速 分子檢測研 究及其檢測時所致病害早期診斷具有重要作用 0015 2 采用本發(fā)明提供的檢測引物對針對杜鵑根腐病病原菌P pini菌株和其他鐮刀 菌 真菌以及松材線 蟲 病原卵菌等進 行檢測 結(jié)果顯示僅有杜鵑根腐病病原菌P pini的檢 測結(jié)果為陽性 能夠擴增出特異性條帶 條帶大小為247bp 同時 經(jīng)過特異性實驗證明 PCR 法檢測杜鵑根腐病 病原菌P pi ni基因 組DNA的靈敏度為10 0pg L 1 0016 3 本發(fā)明為杜鵑根腐病病原菌P pini 的檢測提供了新 的檢測靶標的發(fā)掘方法和 技術(shù)平臺 在病害侵染初期鑒定出病原物 本發(fā)明可以用于帶菌植株組織中杜鵑根腐病病 原菌P pi ni的快速檢測 能夠?qū)Ω胁悠愤M行 快速檢測 附圖說明 0017 為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案 下面將對具體 實施方式描述中所需要 使用的附圖作簡單地介紹 0018 圖1是基于杜鵑根腐病病原菌P pini新檢測靶標Ppini 05588設(shè)計的特異性引物 Ppi05588PCR F1 Ppi05588PCR R1在疫霉菌種間普通PCR特異性驗證電泳圖 特異性引物上 游引物Ppi05588 PCR F1和下游引物Ppi05588PCR R1只能從供試的杜鵑根腐病病原菌 P pini菌株中特異地擴增出一條247bp的條帶 而其余疫霉未產(chǎn)生目的條帶 其中 從左邊 到右邊 依次為 1 Marker 2 杜鵑根腐病病原菌Phytophthorapini 3 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 4 煙草疫霉Phytophthora nicotianae 5 大豆疫霉Phytophthora sojae 6 柑桔褐腐疫霉Phytopht hora citrophthora 7 荔枝疫霉Phytophthora litchii 8 大雄疫霉Phytopht hora megasperma 9 寄生疫霉Phytopht hora parasitica 10 冬生疫 霉Phytophthora hibernalis 11 丁香疫霉Phytophthora syringae 12 N陰性對照 13 Marker 0019 圖2是基于杜鵑根腐病病原菌P pini新檢測靶標Ppini 05588設(shè)計的特異性引物 在其他卵菌和真菌中的普通PCR特異性驗證電泳圖 特異性引物上游引物Ppi05588 PCR F1 和下游引物Ppi05588 PCR R1只能從供試的杜鵑根腐病病原菌P pini菌株中特異地擴增出 一條247bp的條 帶 而其 余卵菌或真菌未產(chǎn)生目的條 帶 0020 圖3是實施例3基于杜 鵑根腐病病原菌P pini新檢測靶標Ppini 05588設(shè)計的檢測 說 明 書 2 12 頁 4 CN 114457186 A 引物組合的靈敏度驗證電泳圖 結(jié)果顯示該引物的檢測靈敏度僅能達 到10 0pg L 1 0021 圖4是實施例4的實驗接種及檢測 結(jié)果圖 其中圖4A中1為人工接種瓊脂塊杜鵑樣 品 圖4A中2 4為人工接種杜鵑根腐病病原菌P pini的杜鵑 圖4B為人工接種杜鵑根腐病病 原菌P pini的發(fā)病杜鵑的PCR檢測結(jié)果圖 PCR檢測結(jié)果圖中從左邊到右邊分別為Marker 1000bp 杜鵑根腐病病原 菌Phytopht hora pini 人工接種杜鵑根腐病病原 菌P pini的杜 鵑 RhododendronsimsiiPlanch 提取的DNA 重復人工接種杜鵑根腐病病原菌P pini的杜 鵑 Rhododendron simsiiPlanch 提取的DNA 重復人工接種杜鵑根腐病病原菌P pini的杜 鵑 Rhododendron simsiiPlanch 提取的DNA 人工接種瓊脂塊的杜鵑 Rhododendron simsii Planch 提取的DNA NC 陰性對照 Marker 10 00bp 具體實施方式 0022 下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案的實施例進行詳細的描述 以下實施例僅用于 更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案 因此只是作為示例 而不能以此來限制 本發(fā)明的保護 范圍 需要注意的是 除非另有說明 本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學術(shù)語應(yīng)當為本發(fā)明所 屬領(lǐng)域 技 術(shù)人員所理解的通常意 義 0023 實施例1 0024 本研究通過Blast序列搜索 序列提取 比對與分析 挖掘大規(guī)模的基因組數(shù)據(jù)庫 從而發(fā)掘 疫霉菌的檢測靶標 通過全基因組比對 共計獲得P pini特異性檢測靶標1000個 以上 隨機從P pini 1000多個特異 性基因中挑選出部分基因作為候選基因 設(shè)計了并篩選 特異 性引物 表1列出其中6個靶標基因 表1 采用P CR技術(shù)對設(shè)計的特異性引物進 行驗證 特異性評價選擇與P pini不同種 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 煙草疫霉 Phytophthora nicotianae 大豆疫霉 Phytophthora sojae 柑桔褐腐疫霉 Phytophthora citrophthora 荔枝疫霉 Phytophthora litchii 大雄疫霉 Phytophthora megasperma 寄生疫霉 Phytophthoraparasitica 冬生疫霉 Phytophthora hibernalis 丁香疫霉 Phytophthora syringae 等 和不同屬的菌 Phytopythium litorale Phytopythium helicoides 松脂潰瘍菌 Fusarium circinatum 藤倉鐮刀菌 Fusariumfujikuroi 葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea 松材線蟲 Bursaphelenchusxylophillus Diaporthepescicole Lasiodiplodiaparva 蘋果炭疽 Colletotrichum aenigma 等 的DNA作為模板 進行PCR特 異性和靈敏度驗證 最終獲得1個杜鵑根腐病病原菌P pini的檢測新靶標基因Ppini 05588 0025 表1杜鵑根腐病 病原菌 6個特異性基因序列表 說 明 書 3 12 頁 5 CN 114457186 A 0026 說 明 書 4 12 頁 6 CN 114457186 A 0027 說 明 書 5 12 頁 7 CN 114457186 A 0028 說 明 書 6 12 頁 8 CN 114457186 A 0029 說 明 書 7 12 頁 9 CN 114457186 A 0030 0031 新靶標基因Ppini 05588其DNA序列如SEQ ID NO 1所示 CDS序列如S EQ ID NO 1 其蛋白序列如SEQ ID NO 2所示 并基于該新靶標建立靈敏 準確的PCR檢測技 術(shù)體系 0032 該檢測技術(shù)體系所使用的PCR檢測引物組合物 由上游引物Ppi05588PCR F1和下 游引物Ppi0 5588 PCR R1 各引物序列具體如下 0033 Ppi05588PCR F1 CGACGATATG GCAAGATATC 0034 Ppi05588PCR R1 GT TCGCAAAC CTCTCTCGTA 0035 提取待檢微生物的DNA 取1 L DNA溶液 加入23 L試劑盒中的檢測溶液和1 L滅菌 去離子水 總體積為25 L PCR擴增程序為94 變性3分鐘 94 變性30秒鐘 58 退火30秒 72 延伸45秒鐘 33個循環(huán) 最后72 延伸10分鐘 其中 所述 mL所述的檢測溶液包括 4種 dNTP各2000 M 100 L 10 PCR反應(yīng)緩沖液 80mM Mg2 100 L 1 B SA 50單位Taq酶 TaKaRa 特異引物Ppi05588 PCR F1和 Ppi05588PCR R120 M引物 加入超純水制備成1mL 檢測溶 液 0036 反應(yīng)結(jié)束后取7 L擴增產(chǎn)物于1 5 瓊脂糖凝膠中電泳30min 100V 在凝膠成像 系統(tǒng)上檢測并拍照 每 個實驗至少重復3次 0037 實施例2 說 明 書 8 12 頁 10 CN 114457186 A 0038 為了驗證杜鵑根腐病病原菌P pini 的特異性引物序列 本實施例以3株杜鵑根腐 病病原菌P pini菌株和病原卵菌以及其它真菌為供試材料 表2 采用CTAB法提取發(fā)病組 織中杜鵑根腐病病原菌P pini的DNA 具體方法如下 取少量菌絲粉 加900 L 2 CTAB提取 液和90 L 10 SDS 漩渦混勻 于60 水浴1h 中間每10min上下顛倒幾次 12000rpm離心 10min 取上清加等體積酚 氯仿 異戊醇 2 5 24 1 顛倒混勻 2 000rpm離心10min 將上清 轉(zhuǎn)移至新管 加等體積氯仿 輕輕顛倒混勻 12000rpm離心5min 上清轉(zhuǎn)移至新管中 加2倍 體積的無水乙醇和1 10體積的3M NaAc pH 5 2 20 沉淀 1h 12 000rpm離心10min 傾 去上清 沉淀用70 乙醇洗滌兩次 室溫晾干 加適量滅菌超純水或TE pH 8 0 溶解沉淀 含20 g mL RNase 37 處 理1h后 20 保存?zhèn)溆?0039 表 2用于杜鵑根腐病 病原菌P pi ni PCR檢測的卵菌和真菌 菌株 說 明 書 9 12 頁 11 CN 114457186 A 0040 0041 PCR檢測結(jié)果如圖1 圖2所示 杜鵑根腐病病原菌Phytophthora pini菌株均可特 異 地擴增出一條247b p的條帶 其余病原卵菌以及真菌瓊脂糖凝膠電泳沒有 出現(xiàn)擴增條帶 選 擇與杜鵑根腐病病原 菌Phytopht hora pini不同種 辣椒疫霉 Phytopht hora capsici 說 明 書 10 12 頁 12 CN 114457186 A 煙草疫霉 Phytophthora nicotianae 大豆疫霉 Phytophthora sojae 柑桔褐腐疫霉 Phytophthora citrophthora 荔枝疫霉 Phytophthora litchii 大雄疫霉 Phytophthora megasperma 寄生疫霉 Phytophthora parasitica 冬生疫霉 Phytophthora hibernalis 丁香疫霉 Phytophthora syringae 等 和不同屬的菌 Phytopythium litorale Phytopythium helicoides 松脂潰瘍菌 Fusarium circinatum 藤倉鐮刀菌 Fusarium fujikuroi 葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea 松材線蟲 Bursaphelenchus xylophillus Diaporthe pescicole Lasiodiplodia parva 蘋果炭疽 Colletotrichum aenigma 等 的DNA作為模板 取1 L DNA溶液 加入23 L試劑盒檢測溶液和1 L滅菌去離子水 總 體積為25 L PCR擴增程序為94 變性3分鐘 94 變性30秒鐘 58 退火30秒 72 延伸45秒鐘 33個循環(huán) 最后72 延伸 10分鐘 0042 證明所設(shè)計 的特異性引物上游引物和下游引 物PCR特異性引物具有種的特異性 Ppini 05588是一個特異性較強的新檢測 靶標 這說明該引物組可被用于生產(chǎn) 實踐中發(fā)病 組織中杜 鵑根腐病病原菌的快速可靠的檢測鑒定 當用于發(fā)病組織中存在杜 鵑根腐病病原 菌時 采用NaOH快速裂解法提取杜鵑根腐病病原菌的DNA 具體過程如下 取一段發(fā)病的植 株組織 每毫克組織加入10 L 0 5M NaOH 在研缽中充分研磨后轉(zhuǎn)移至1 5mL的EP管中 12000rpm離心5min 取5 L上清液加入495 L 0 1mM Tris pH 8 0 混勻后取1 L直接用于 PCR反應(yīng) 每 個反應(yīng)至少重復三次 同時為確定植株中無PCR抑制物存在 0043 實施例3 0044 用杜鵑根腐病病原菌Phytophthora pini的菌株的不同濃度的基因組DNA作為擴 增模板 進行PCR擴增反應(yīng) 使用Nanodro 2000微量分光光度計測出實施例1提取DNA的濃度 為100ng L 1 將其依次稀釋為10ng L 1 1ng L 1 100pg L 1 10pg L 1 1pg L 1 100fg L 1 10fg L 1 1fg L 1 100ag L 1 根據(jù)實施例1 2采用的引物 反應(yīng)體系 和反應(yīng)條件 對不同濃度的DNA進行PCR檢測 結(jié)果如圖3所示 25 L的反應(yīng)體系中分別含有 100ng L 1 10ng L 1 1ng L 1 100pg L 1P pini DNA的出 現(xiàn)247bp特異性陽性條帶 呈陽性反應(yīng) 25 L的反應(yīng)體系中分別含有10pg L 1 1pg L 1 100fg L 1 10fg L 1 1fg L 1 100ag L 1P pini DNA的未出現(xiàn)特異性條帶呈陰性反應(yīng) 結(jié)果表 明PCR檢測的 靈敏度達 到10 0pg L 1 圖3 0045 實施例4活體組織中杜鵑根腐病 病原菌Phytophthora pini的普通PCR檢測 0046 采用NaOH堿裂解法提取接種丁香疫霉菌的發(fā)病柑橘組織 的DNA 將其作為模板用 于PCR擴增 取1uL DNA溶液 按實施例2的方法 進行PCR反應(yīng) 結(jié)果如圖4所示 其中圖 A 1 為人工接種瓊脂塊的杜鵑葉片 圖4A 2 3 為人工接種P pini的感病杜鵑葉片 圖4B為人工 接種P pini的發(fā)病杜鵑葉片的PCR檢測結(jié)果 PCR檢測結(jié)果圖中從左邊到右邊分別為Marker 1000bp P pini 人工接種P pini的杜鵑葉片提取的DNA 重復人工接種P pini的杜鵑葉 片提取的DNA 重復人工接種P pini的杜鵑葉片提取的DNA及人工接種瓊脂塊的杜鵑葉片提 取的DNA NC 陰性對照 Marker 1000bp 結(jié)果顯示 P pini菌株及人工接種P pini的杜鵑 葉片提取的DNA均可特異 地擴增出一條2 47bp的條帶 而 人工接種瓊脂塊的杜鵑葉片提取的 DNA及陰性對照沒有出現(xiàn)擴增條 帶 0047 除非另外具體說明 否則在這些實施例中闡述的數(shù)值并不限制本發(fā)明的范圍 在 說 明 書 11 12 頁 13 CN 114457186 A 這里示出和描述的所有示例中 除非另有規(guī)定 任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的 而 不是作為限制 因此 示例性實施例的其 他 示例可以具有不同的值 說 明 書 12 12 頁 14 CN 114457186 A 序列表 南京林業(yè)大 學 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心 杜鵑根腐病 病原菌的特異性檢測靶標Ppi ni 05588及應(yīng)用 202203 19 SIPOSequenceListing 1 0 1 774 DNA 人工序列 ar tificial sequence 1 atggttgctc tctttcaccc attccgccgg ccagaagact tcgatgacga tattcgaaac 60 ggcggccagg ttggttacga gcgatggtgg cgcgatcacg cacctaccgg agctcgtgag 120 tttctgaaat tttctaaaga ttataacatt tcccgagaga tcgcccgcca acggatagac 180 gacgatatgg caagatatcg gggttacatc gagtgctcat cggatgaaga ggcagatggt 240 tctagcatcc tagaaggatc gtcgggtgag gaggaggata tggcatggga cgataactcg 300 tctcaagcag atacggcttt ggtgaagtcc atgacagaac atactcttaa attccagtgg 360 ggtcgtgaag cggttcaatt gtcggctgcg tcaagcgatg taccgttacg agagaggttt 420 gcgaacgttt ctgttccggt agatgacaga gataaagata tcgcagctac tgagagacta 480 cttgccgagc gtgaaactaa gcccgtggcg aatgggacca tgaatctgcc agaagcggaa 540 acaaaagtca tattgctgcg gggcgctatc gcaaactgtg atatttggat ggatccaact 600 ctgattccaa atacctcgag gcccgaattg gggcagcaat catcgctaca agaaatatct 660 caacatttca gtctgaatga aaagcagcac aaagcgtttg tgcgctttgg aaagccattt 720 gtgcgatccc atgcaagcct tggcggggtc ctgggaatct gccgatgccc ttaa 774 2 257 PRT Phytophthora pini 2 Met Val Ala Leu Phe His Pro Phe Arg Arg Pro Glu Asp Phe Asp Asp 1 5 10 15 Asp Ile Arg Asn Gly Gly Gln Val Gly Tyr Glu Arg Trp Trp Arg Asp 20 25 30 His Ala Pro Thr Gly Ala Arg Glu Phe Leu Lys Phe Ser Lys Asp Tyr 35 40 45 Asn Ile Ser Arg Glu Ile Ala Arg Gln Arg Ile Asp Asp Asp Met Ala 50 55 60 Arg Tyr Arg Gly Tyr Ile Glu Cys Ser Ser Asp Glu Glu Ala Asp Gly 序 列 表 1 6 頁 15 CN 114457186 A 65 70 75 80 Ser Ser Ile Leu Glu Gly Ser Ser Gly Glu Glu Glu Asp Met Ala Trp 85 90 95 Asp Asp Asn Ser Ser Gln Ala Asp Thr Ala Leu Val Lys Ser Met Thr 100 105 110 Glu His Thr Leu Lys Phe Gln Trp Gly Arg Glu Ala Val Gln Leu Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Ser Asp Val Pro Leu Arg Glu Arg Phe Ala Asn Val Ser 130 135 140 Val Pro Val Asp Asp Arg Asp Lys Asp Ile Ala Ala Thr Glu Arg Leu 145 150 155 160 Leu Ala Glu Arg Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Gly Thr Met Asn Leu 165 170 175 Pro Glu Ala Glu Thr Lys Val Ile Leu Leu Arg Gly Ala Ile Ala Asn 180 185 190 Cys Asp Ile Trp Met Asp Pro Thr Leu Ile Pro Asn Thr Ser Arg Pro 195 200 205 Glu Leu Gly Gln Gln Ser Ser Leu Gln Glu Ile Ser Gln His Phe Ser 210 215 220 Leu Asn Glu Lys Gln His Lys Ala Phe Val Arg Phe Gly Lys Pro Phe 225 230 235 240 Val Arg Ser His Ala Ser Leu Gly Gly Val Leu Gly Ile Cys Arg Cys 245 250 255 Pro 3 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 3 cgacgatatg gcaagatatc 20 4 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 4 gttcgcaaac ctctctcgta 20 5 669 DNA 序 列 表 2 6 頁 16 CN 114457186 A Phytophthora pini 5 atgaacgagg agtatggtga ccgctttaaa acgcgctcgg attcagtaga cagcgatgag 60 ctgacgcaag tgctgacaga gctgggcgtc gccatggaca aggaagacac cagttcgagt 120 tcgagctacg aggatgacaa ggtcgctgct tccggtggca cgtcttcgca gcgtattgcc 180 aagcccacta gttccccgag ggaggctcca cacctgaccg aaagtacccc caaggaagag 240 cggaaactga ccgaaactac cccgaaggtg gaccaaaagc agccgaacgt tcaaccgaag 300 aaggacctaa cggttgccca cgtgctatct ccagctcctg ccaccgtttc tgtggatgac 360 tccgcactgg cagaggtgat gacgcagttg gatgaggaag atgagttggc ttcgcatggc 420 gacacggaca tgagctacgt agacgaatcc gtgtccgaca atttggagac cgatgacatg 480 gagtccgagg gcatgaatgc tgggcgttcg tctgcaaaga agagtattac tcgtcgtctc 540 atcgagagca ccagtgaaga caccgaagaa gaacctgatt tgcaccgaac caagacaaaa 600 cagaaaccaa ttcgacacaa gaaactcacc aaagacccca ggaatcttgt ggaagctgtc 660 ccggagtag 669 6 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 6 tcggattcag tagacagcga 20 7 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 7 gtcagtttcc gctcttcctt 20 8 609 DNA Phytophthora pini 8 atgcctatgc cgatcgaggt gcttggtgag cgggcggctc agttctttgt agcgtattcg 60 cgcgagcctc gcccatataa gaaggacgaa atgctgatgc ccgtcctgca cgcaatagcg 120 aaaaatggct gtgggaagtt tactctggac gatgcgaaac gcgagctgca ccgcgtggtg 180 tcttgcggtc ggtgcgaaac ctcggggcac cagtaccgtg gcgccaaaga gaagtaccac 240 acttgggatt ccaagtcttg tcaaattctc gtaacctggc tagctcgcaa ttacatacac 300 taccagcacc acaggggcaa actcagaacg ctggagagag aagtcgttcc agtactggcg 360 agagctggac gccgcttcaa tcagtacaag gtgcaggcgc agattagata cctgcaaagg 420 atgtacgaca agcacatggc gaccggagga agcctgccag tgtgcttcga gcggttcgaa 480 序 列 表 3 6 頁 17 CN 114457186 A ggagcctacg aagtgttccg gagccacgat ttacaccacc aaaagaagcg tcgcggtgcg 540 gaaggctgtt tattccacgc caatcttgac gcagaagcgc ttgctgctgc tgatctgatt 600 ggaatttag 609 9 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 9 gagcctcgcc catataagaa 20 10 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 10 tgcgagctag ccaggttacg 20 11 687 DNA Phytophthora pini 11 atgcgtgcag acgaagtggc agacgaagtg gcagacgaag tggcagacga agtggcagac 60 gaagtggcaa gaacccagga agagatgccg attgtttctc ctgtgcggaa gaaggcacgg 120 atgcagcaag acaagacctg cgcatcaagt tcgcgcctgt tgacaagcga gcaattgagt 180 ttgctggttc agctgaatga ttcatactcg agctatgggc gggctggacg taagtgggca 240 acgatccaaa cccaaatgcg cacgtcctac gctgaactgg atgtgaaacg gagcagtttg 300 agggacatct gcacccgagt gaagaagcag cgcgaaattc gagagctgac gaggtgcagg 360 gagcagcacg agcagtgcag cacgacgatc gatcgtctgg aagaagtagt tcgtcgagag 420 aaggaagata aagaggttct tactgtcgtg tcagaggagt ggagagtgaa gtcggagaag 480 ctcatggagg aggtgcagtt actcaaaaaa gagaaggctg aagcggaaaa gagagccaag 540 aagcagtcga agcaggtcgc caagtccatg gaggatctgg agacgcaggt gaagaactgg 600 aaacacaaga ctgaaatcgc gaacgcgttg ttgaagacgg agaaggggac gagcgagttc 660 ctccgtgaaa ccctgaacaa ggagtaa 687 12 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 12 gaagtggcaa gaacccagga 20 13 序 列 表 4 6 頁 18 CN 114457186 A 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 13 catccagttc agcgtaggac 20 14 765 DNA Phytophthora pini 14 atgggctaca gattacttgg agaaacggct agactctact tgcgcaatga tgaaatcgcg 60 gagactgcta tttcgatcga caaaaatatg attcagaggg caacatttac tcgagtcgac 120 gctattcaag aagaagttat cgctgccgca tgggttattg attcgatgtt agagctgcga 180 tcgctggagc ggcgcaatgc tggcgcgacg ctgattcaca tcatacaagg acaacttgca 240 ggctgcctat acaggttcaa ctaccgtcgt gaggcggccg acacagcgga caatggatta 300 attttggaat tggcgaatgc tcaaaatctt cgtcatgaat tttacgtgga catgctgact 360 ggaatcctcg gcgcatcgtg tcgtcaaact cggacgattg gtccagcagt gaacacgaga 420 acacggacac