2022年4月 陜西理工大學學報 自然科學版 Apr 2022 第38卷第2期 Journal of Shaanxi University of Technology Natural Science Edition Vol 38 No 2 引用格式 張娜 曹小勇 胡選萍 等 3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗比較 J 陜西理工大學學報 自然科學版 2022 38 2 66 71 3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗比較 張 娜1 曹小勇1 2 胡選萍1 2 秦公偉1 2 王思蘄1 趙 垚1 1 陜西理工大學生物科學與工程學院 陜西漢中723000 2 陜西省資源生物重點實驗室 陜西漢中723000 摘 要 以白及 杜鵑蘭 建蘭種子為離體培養(yǎng)材料 比較三者非共生萌發(fā)及成苗過程 結果 表明 3種蘭科植物成苗過程存在明顯差異 白及種胚膨大成原球莖后上端形成葉片 隨后形 成根直接成苗 杜鵑蘭的原球莖先形成根狀莖 頂端分化出葉芽 葉基部長出根發(fā)育成苗 建蘭 萌發(fā)形成根狀莖后持續(xù)增殖 需改變培養(yǎng)基激素 才可分化成苗 建蘭根狀莖與杜鵑蘭的明顯 不同 具有向地性 且杜鵑蘭的根狀莖僅能進行有限分支并形成休眠芽 結論 蘭科植物種子 非共生萌發(fā)成苗可區(qū)分為3種模式 白及是絕大多數(shù)蘭科種子非共生萌發(fā)成苗的模式 關鍵詞 蘭科植物 種子 非共生萌發(fā) 原球莖 根狀莖 成苗 中圖分類號 Q945 文獻標識碼 A 文章編號 2096 3998 2022 02 0066 06 收稿日期 2021 07 07 修回日期 2021 10 11 基金項目 陜西省教育廳重點實驗室科研計劃項目 18JS017 通信作者 曹小勇 1964 男 陜西涇陽人 教授 主要研究方向為植物生物技術 蘭科植物自古以來便被賦予了不同的寓意和象征 擁有著高貴的品質 散發(fā)著自然之美和人文之 美 1 作為種類最多 分布最廣的有花植物之一 蘭科植物的生態(tài)類型豐富 且多為珍稀瀕危植物 藥 用 觀賞價值較高 2 蘭科植物資源再生及合理開發(fā)利用多采用種子共生萌發(fā)與非共生萌發(fā) 其中 非共生萌發(fā)應用更為 廣泛 2 白及 Bletilla striata 3 的非共生萌發(fā)研究表明 白及種胚膨大至突破種皮后形成原球莖 原球 莖的頂端分化葉芽 基部生根形成幼苗 4 千代蘭 Ascocenda Fuchs Gold 5 西藏虎頭蘭 Cymbidi um tracyanum 6 蝴蝶蘭 Phalaenopsis aphrodite 7 等植物種子非共生萌發(fā)的過程與白及相同 對建蘭 C ensifolium 3 的非共生萌發(fā)研究中發(fā)現(xiàn) 其種胚形成原球莖后進行伸長生長 至根狀莖階段可持續(xù) 增殖 根狀莖繼代培養(yǎng)形成芽后成苗 8 墨蘭 C sinense 9 春蘭 C goeringii 10 寒蘭 C kan ran 11 大花蕙蘭 C hybrid 12 等蘭科植物種子非共生萌發(fā)的過程與建蘭的相同 蘭科植物種子非 共生萌發(fā)除白及和建蘭的萌發(fā)成苗模式外 是否還存在與上述二者差異的形式 目前尚未見報道 本課題組在對杜鵑蘭 Cremastra appendiculata 種子非共生萌發(fā)研究中 發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)過程與白及 建 蘭不同 本文通過對白及 杜鵑蘭 建蘭3種蘭科植物非共生萌發(fā)成苗過程比較觀察 展示3種蘭科植 物種子非共生萌發(fā)成苗的差異 為蘭科植物非共生萌發(fā)研究提供參考 1 試驗 1 1 材料 非共生萌發(fā)培養(yǎng)材料 采集白及 建蘭 杜鵑蘭成熟未開裂蒴果分別置于廣口瓶內 自來水沖洗3 4次后 置SW CJ 2D雙人單面垂直凈化工作臺上使用體積分數(shù)75 酒精和質量分數(shù)10 次氯酸鈉溶 66 液對蒴果消毒 無菌水沖洗3 4次 取出置于無菌培養(yǎng)皿內切除蒴果兩端 劃開側面 用鑷子夾取蒴果 將種子抖入無菌玻璃瓶內 晾干后存儲于4 冰箱備用 1 2 方法 1 2 1 培養(yǎng)方法 白及種子 2021年1月播種 2021年2月成苗 培養(yǎng)50 d 1 2MS固體培養(yǎng)基 杜鵑蘭種子 2020 年10月播種 2021年4月成苗 培養(yǎng)6個月 1 2MS 2 g L水解酪蛋白 0 5 mg L NAA液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)至多數(shù)產(chǎn)生分支后移入配制相同的固體培養(yǎng)基內 建蘭種子 2019年10月播種 2021年5月成苗 培養(yǎng)19個月 種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1 2MS固體培養(yǎng)基 根狀莖分化培養(yǎng)基為1 2MS 2 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA固體培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 25 2 光照時間12 h d 靜置培養(yǎng) 白及光照培養(yǎng) 光照2500 3000 lx 杜鵑蘭弱光 培養(yǎng) 光照500 1000 lx 建蘭種子萌發(fā)前暗培養(yǎng) 萌發(fā)后 140 d 移至光下培養(yǎng) 光照2500 3000 lx 1 2 2 觀察記錄 Nikon SMZ800體視顯微鏡定期觀察白及 杜鵑蘭 建蘭種子的非共生萌發(fā)生長情況 觀察白及時 未形成原球莖前可隔瓶身觀察 形成原球莖后 需每次選20個樣本挑出至培養(yǎng)皿后 在體視顯微鏡下觀 察 杜鵑蘭與建蘭在形成根狀莖后 不同生長階段各選20個樣本挑出觀察 圖像采集使用Leica M205C 體視顯微鏡 2 結果觀察 2 1 白及非共生萌發(fā)成苗 培養(yǎng)7 d 大多數(shù)種子種胚膨大 變綠 種胚突破種皮 形成原球莖 圖1 A 原球莖呈卵圓形 綠色 均勻 培養(yǎng)15 d 原球莖頂端生長出葉片 圖1 B 基部形成簇狀假根 均勻分布 培養(yǎng)約30 d 原球莖 基部分化出不定根 圖1 C 培養(yǎng)50 d 形成三葉兩根幼苗 圖1 D 圖1 白及非共生萌發(fā)成苗過程 2 2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗 培養(yǎng)約20 d 種胚膨大至突破種皮 圖2 A 培養(yǎng)30 d 形成原球莖 出現(xiàn)假根 培養(yǎng)約60 d 形成 根狀莖 圖2 B 少數(shù)根狀莖形成分支 一些呈綠色 頂端鱗片無色 根狀莖生長過程中會彎曲 形成背 腹面 假根在背面較多 腹面較少 培養(yǎng)約90 d 出現(xiàn)褐變 根狀莖產(chǎn)生多級分支 次級分支頂端形成休 眠芽 圖2 C 上面箭頭 培養(yǎng)約130 d 根狀莖頂端產(chǎn)生葉片 培養(yǎng)180 d 著生葉片的部位分化出根 76 第2期 張娜 曹小勇 胡選萍 等 3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗比較 形成幼苗 圖2 D 培養(yǎng)240 d 形成假鱗莖 杜鵑蘭根狀莖大多為水平生長 不伸入培養(yǎng)基內部 根 狀莖也存在不產(chǎn)生分支的情況 根狀莖伸長 產(chǎn)生多枚鱗片后 頂端出現(xiàn)葉片分化成苗 圖2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗過程 杜鵑蘭種子非共生萌發(fā)過程與白及不同 白及非共生萌發(fā)成苗過程為種胚膨大至突破種皮 形成 原球莖 原球莖上端形成葉片 隨后形成根直接成苗 杜鵑蘭原球莖形成后 伸長生長形成根狀莖 頂端 分化出葉芽 葉基部長出根發(fā)育成苗 白及非共生萌發(fā)各階段整齊度高 杜鵑蘭整齊度較低 2 3 建蘭非共生萌發(fā)成苗 種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約140 d 種胚膨大突破種皮 形成無色的原球莖 圖3 A 培養(yǎng)約250 d 形成基部為綠色根狀莖 圖3 B 根狀莖持續(xù)分支 呈現(xiàn)明顯向地性 頂端沒有芽的分化 培養(yǎng)450 d 形成大量鮮綠色分支 圖3 C 根狀莖頂端呈錐狀 具鱗片 下側是大量簇狀假根 圖3 D 當根狀莖 轉移到分化培養(yǎng)基 培養(yǎng)60 d 根狀莖頂端膨大 形成由數(shù)枚光滑覆瓦狀鱗片包裹的芽 圖3 E 培養(yǎng) 約120 d形成具有葉和根的幼苗 圖3 F 圖3 E中箭頭指示部位表示根狀莖分化 圖3 F中箭頭指示 根的位置 杜鵑蘭原球莖形成根狀莖后僅進行有限分支即可分化成苗 分支期間會形成休眠芽且大多水平分 布于培養(yǎng)基表面 建蘭原球莖形成根狀莖后 持續(xù)產(chǎn)生分支增殖 改變培養(yǎng)基激素后才可進入分化階 段 且其根狀莖有明顯向地性 3 分析與討論 大多數(shù)蘭科植物的非共生萌發(fā)培養(yǎng)過程與白及相同 如千代蘭 Ascocenda Fuchs Gold 5 西藏 虎頭蘭 C tracyanum 6 扇形文心蘭 Psygmorchis pusilla 13 蝴蝶蘭 Phalaenopsis aphrodite 7 鐵皮 石斛 Dendrobium officinale 14 小葉兜蘭 Paphiopedilum barbigerum 3 卡特蘭 Cattleya hybrida 3 大 花君子蘭 Clivia miniata 3 金邊龍舌蘭 Agave americana Variegata Nichols 15 樹蘭 Epidendreae Humb 16 鶴望蘭 Strelitzia reginae 17 等 3種成苗模式的蘭科植物如圖4所示 扇形文心蘭種子非共生萌發(fā)種胚一端產(chǎn)生芽 隨后產(chǎn)生多枚葉片 形成根 圖4 A 13 蝴蝶蘭原 球莖頂端存在生長點 根由原球莖下部分化產(chǎn)生 且其原球莖增殖產(chǎn)生大量原球莖 或直接分化成苗 圖4 B 7 18 故白及是絕大多數(shù)蘭科植物種子萌發(fā)成苗的模式 與建蘭非共生萌發(fā)過程相同的蘭科植物有墨蘭 C sinense 9 春蘭 C goeringii 10 寒蘭 C kanran 11 大花蕙蘭 C hybrid 12 蕙蘭 C faberi 19 蓮瓣蘭 C tortisepalum 20 等 墨蘭根狀莖 持續(xù)增殖最合適的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基 圖4 C 9 寒蘭根狀莖在分化培養(yǎng)基中頂端分生組織分 86 陜西理工大學學報 自然科學版 第38卷 圖3 建蘭非共生萌發(fā)成苗過程 圖4 3種成苗模式的蘭科植物 化出芽 圖4 D 11 建蘭類的成苗模式中存在根狀莖持續(xù)增殖階段 需改變培養(yǎng)基激素才能分化成 苗 與杜鵑蘭相同的蘭科植物有黃花火燒蘭 Epipactis flava 21 多花指甲蘭 Aerides rosea 22 巨蘭 Grammatophyllum speciosum 23 山蘭 Oreorchis patens 24 地寶蘭 Geodorum densiflorum 25 等 E flava的體外繁殖研究中展示了其成苗模式圖 與杜鵑蘭的相似 存在休眠芽 呈現(xiàn)顯著頂端優(yōu)勢 圖4 E 21 地寶蘭根狀莖水平生長 只進行有限分支后便可成苗 圖4 F 25 杜鵑蘭根狀莖大多水平分布 在培養(yǎng)基表面 但當培養(yǎng)基中萘乙酸濃度呈倍數(shù)高于6 BA濃度時 其根狀莖也存在伸入培養(yǎng)基內部的 情況 故激素可能會影響植物的形態(tài)發(fā)生 建蘭持續(xù)增殖根狀莖與分化根狀莖 杜鵑蘭根狀莖上的休眠 芽與繼續(xù)生長的分支 除外部形態(tài)存在差別外 內部結構也可能存在差異 可制作石蠟切片觀察 96 第2期 張娜 曹小勇 胡選萍 等 3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗比較 蘭科作為被子植物第三大科 2 種子萌發(fā)過程可能存在更多類型 現(xiàn)有資料中還存在兩種特別的 類型 鬼蘭 Dendrophylax lindenii 種子發(fā)育成個體的過程沒有葉的分化 光合作用器官為根 圖5 A 26 天麻 Gastrodia elata 種子萌發(fā)形成個體的過程沒有根和葉的分化 植株只具莖和花 圖5 B 3 圖5 A中箭頭指示為根 26 圖5 B中上側箭頭指示花序 下側箭頭指示塊莖 二者種子萌發(fā)產(chǎn) 生的個體形態(tài)與本文描述的3種模式存在差異 也可據(jù)此作為兩種 成苗 模式 但廣義的成苗過程包 括葉與根的發(fā)生 27 上述二者可能不符合廣義的成苗模式 圖5 兩種蘭科植物 綜上所述 本文將蘭科植物種子離體培養(yǎng)成苗區(qū)分為3種模式 白及 杜鵑蘭 建蘭 白及是絕大 多數(shù)蘭科種子萌發(fā)成苗的模式 在蘭科植物的非共生萌發(fā)研究中 培養(yǎng)早期就可根據(jù)這3種成苗模式 確定該材料后續(xù)培養(yǎng)方案 另外 原球莖或根狀莖的增殖有利于優(yōu)良品種的高效工廠化生產(chǎn)和蘭科植 物快速繁殖技術的發(fā)展 白及模式的原球莖和杜鵑蘭模式的根狀莖增殖與芽分化均可同時進行 建蘭 模式根狀莖的持續(xù)增殖特點可提供大量根狀莖 分瓶轉接至分化培養(yǎng)基上便可大規(guī)模生產(chǎn)幼苗 參 考 文 獻 1 汪文忠 君子筆下的 中國蘭文化 J 林業(yè)與生態(tài) 2020 4 44 45 2 劉思思 陳娟 郭順星 蘭科植物種子萌發(fā)的研究進展 J 種子 2015 34 6 43 50 3 中國科學院 中國植物志 編輯委員會 中國植物志 第18卷 M 北京 科學出版社 1999 4 陳菁瑛 萬學鋒 劉保財 等 白及種子非共生培養(yǎng)高效萌發(fā)體系的研究 J 福建農(nóng)業(yè)學報 2018 33 2 131 135 5 葉一枝 陳春滿 千代蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖 J 植物生理學通訊 2004 5 581 6 王蓮輝 姜運力 余金勇 等 西藏虎頭蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖 J 植物生理學通訊 2009 45 1 51 52 7 呂曉輝 蝴蝶蘭的離體培養(yǎng)研究 D 鄭州 鄭州大學 2007 8 陳春 建蘭 嶺南奇蝶 種子無菌萌發(fā)與離體繁殖技術 J 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究 2016 12 2 125 129 9 許申平 袁秀云 王默霏 等 墨蘭 Cymbiduim sinense 組培快繁技術體系研究 J 熱帶作物學報 2018 39 5 926 930 10 王松太 曾麗婷 方中明 等 蘭屬植物組織培養(yǎng)研究進展 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學 2019 10 144 151 11 朱國兵 楊柏云 敖愛艷 寒蘭的組織培養(yǎng)與試管開花 J 植物生理學通訊 2008 3 513 514 12 周永勝 胡松梅 大花蕙蘭組織培養(yǎng)體系優(yōu)化實驗初探 J 南方農(nóng)業(yè) 2020 14 30 152 153 13 韓一航 扇形文心蘭 Erycina pusilla 離體快繁體系的建立 D 廣州 華南農(nóng)業(yè)大學 2017 14 張盈 李媛媛 陳曉梅 等 鐵皮石斛種子共生萌發(fā)形態(tài)學觀察 J 首都師范大學學報 自然科學版 2019 40 5 35 42 15 楊志堅 溫杭凱 陳選陽 等 金邊龍舌蘭組織培養(yǎng)技術研究 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學 2019 47 5 37 39 16 魏翠華 樹蘭離體培養(yǎng)和植株再生 簡報 J 亞熱帶植物科學 2006 2 64 65 17 何俊彥 胡潔荃 徐衛(wèi)平 鶴望蘭組織培養(yǎng)與工廠化快繁程序的研究 J 西北植物學報 1996 4 407 411 07 陜西理工大學學報 自然科學版 第38卷 18 王曉麗 朱東昌 顧德鋒 等 蝴蝶蘭原球莖組織學研究 J 吉林農(nóng)業(yè)大學學報 2003 4 397 399 19 吳正景 高文 馬鑫婷 等 蕙蘭種子根狀莖培養(yǎng)與愈傷組織誘導 J 陜西農(nóng)業(yè)科學 2021 67 5 28 31 20 劉祥 孫東玲 卓素卿 等 雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖和分化技術研究及分子鑒定 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學 2018 46 17 156 160 21 KUNAKHONNURUK B INTHIMA P KONGBANGKERD A In vitro propagation of Epipactis flava Seidenf an endan gered rheophytic orchid a first study on factors affecting asymbiotic seed germination seedling development and green house acclimatization J Plant Cell Tissue 2 Shaanxi Key Laboratory of Bio resource Hanzhong 723000 China Abstract The seeds of Bletilla striata Cremastra appendiculata and Cymbidium ensifolium used as material were cultured in vitro to compare the asymbiotic germination and seedling establishment of the three species The results showed that there are obvious differences in the seedling establishment of the three or chids Seed embryo of B striata swelled into protocorms and leaves formed at the anterior end then the roots and seedlings established directly the protocorms of C appendiculata form rhizomes first the buds differenti ate at the anterior end roots develop at the base of the leaves and seedlings form the rhizomes of C ensifoli um formed after seed germination and proliferated continuously and it can differentiate into seedlings unless hormones changed in the medium the rhizome of C ensifolium is obviously different from that of C appendic ulata the former has geotropism and the latter can only generate limited branches and then form dormant buds Conclusion the asymbiotic germination of orchid seeds and seedling establishment can be divided into three modes The manner of B striata is the mode of most orchid plants Key words orchid seed asymbiotic germination protocorm rhizome seedling establishment 17 第2期 張娜 曹小勇 胡選萍 等 3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗比較