引文格式 敖靜 李楊 劉曉輝 等 一株黃瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及抑菌作用初探 J 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科 學(xué) 2022 37 3 429 434 DOI 10 12101 j issn 1004 390X n 202109024 一株黃瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定 及抑菌作用初探 敖 靜 李 楊 劉曉輝 高曉梅 孫玉祿 遼寧省微生物科學(xué)研究院 遼寧 朝陽(yáng) 122000 摘要 目的 篩選黃瓜枯萎病的高效拮抗細(xì)菌并研究其抑菌作用 方法 采用平板對(duì)峙法從設(shè)施溫室土壤 樣品中篩選拮抗細(xì)菌 對(duì)其中抑菌率最高的菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)及16S rDNA測(cè)序分析 利用平板倒扣法 凹玻片法以及HPLC等方法對(duì)其抑菌作用進(jìn)行初步研究 結(jié)果 共篩選得到8株拮抗細(xì)菌 XN 1 XN 8 其中抑菌率最高的為XN 3 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的分析比對(duì)結(jié)果顯示 XN 3與解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloli quefaciens 16S rDNA序列的同源相似性最高 99 XN 3能產(chǎn)生有抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì) XN 3可 使病原菌菌絲卷曲 長(zhǎng)度變短 顯微形態(tài)出現(xiàn)菌絲膨大 彎曲不均 分枝菌絲生長(zhǎng)受阻 有厚垣孢子生成 其胞外物質(zhì)使病原菌孢子萌發(fā)率降低89 01 HPLC色譜圖顯示 峰A 2中的成分有明顯的抑菌作用 結(jié)論 分離得到的拮抗細(xì)菌XN 3為解淀粉芽孢桿菌 其對(duì)黃瓜枯萎病病原菌具有較強(qiáng)的抑菌作用 可以通 過(guò)胞外物質(zhì)抑制菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑菌 該結(jié)果為進(jìn)一步研究其生防機(jī)制奠定了基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞 黃瓜枯萎病 解淀粉芽孢桿菌 鑒定 高效液相色譜 抑菌作用 中圖分類(lèi)號(hào) S436 421 13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1004 390X 2022 03 0429 06 Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against Fusarium Wilt of Cucumber and Preliminary Study on Its Antifungal Effect AO Jing LI Yang LIU Xiaohui GAO Xiaomei SUN Yulu Microbial Research Institute of Liaoning Province Chaoyang 122000 China Abstract Purpose To screen high effective antagonistic bacteria of cucumber fusarium wilt and to study its antimicrobial activity Methods The antagonistic bacteria were screened from green house soil samples by plate confrontation method physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing analysis were performed on the strains with the highest bacteriostatic rate the antifungal effects were studied by plate inversion method hollow glass and HPLC Results A total of eight strains of antagonistic bacteria XN 1 XN 8 were screened and XN 3 had the highest inhibitory rate The results of analysis and comparison in NCBI database showed that XN 3 had the highest homo logy similarity with 16S rDNA sequence of Bacillus amyloliquefaciens 99 XN 3 could produce volatile compounds which had antifungal effect XN 3 could make the mycelia curl shorten their 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科學(xué) 2022 37 3 429 434 Journal of Yunnan Agricultural University Natural Science E mail ynauzkxb 收稿日期 2021 09 18 修回日期 2022 03 11 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期 2022 04 26 基金項(xiàng)目 遼寧省農(nóng)科院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目 2020QN2413 遼寧省農(nóng)科院土壤微生態(tài)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 2019DD154522 遼寧省 興遼英才計(jì)劃 項(xiàng)目 XLYC2002048 作者簡(jiǎn)介 敖靜 1986 女 遼寧朝陽(yáng)人 碩士 助理研究員 主要從事土壤微生態(tài)研究 E mail aojing07 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址 length and the microscopic morphology of mycelia expand and bend unevenly the growth of branch ing mycelia was blocked and chlamydospore was generated its extracellular substance reduced the spore germination rate by 89 01 HPLC chromatogram showed that the components in peak A 2 had obvious antifungal effect Conclusion The isolated antagonistic bacterium XN 3 was Bacillus amyloliticus which had a strong antifungal effect on Fusarium oxysporum It could inhibit mycelial growth and spore germination by extracellular substances laying a foundation for further study on its biocontrol mechanism Keywords cucumber fusarium wilt Bacillus amyloliticus identification high performance liquid chromatography HPLC antimicrobial activity 黃瓜枯萎病是主要由尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 侵染引起的土傳真菌病害 可侵染多 種植物寄主 病菌通過(guò)分泌降解酶和菌毒素等 侵染作物的維管束系統(tǒng) 導(dǎo)致作物出現(xiàn)萎蔫和腐 爛等癥狀 1 2 可引起作物和花卉枯萎病 嚴(yán)重時(shí) 造成植株死亡 從而使作物大量減產(chǎn) 影響農(nóng)業(yè) 發(fā)展 3 5 尖孢鐮刀菌的菌絲和孢子可存留在土壤 或作物種子上越冬 在土壤和空氣中能存活 10年以上 6 目前 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要通過(guò)化學(xué)藥 劑防治尖孢鐮刀菌 如利用唑類(lèi) 甲酯類(lèi)和酰胺 類(lèi)等藥物對(duì)種子進(jìn)行消毒 或?qū)ψ魑镏仓赀M(jìn)行灌 根等處理以抑制病原菌生長(zhǎng) 7 8 但長(zhǎng)期大量施用 化學(xué)藥品不僅會(huì)污染作物 土壤和水系 產(chǎn)生病 原菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn) 還會(huì)直接影響人類(lèi)健康 9 10 目前 生物防治是應(yīng)用前景廣 成本較低且綠色 無(wú)污染的技術(shù) 11 本研究以尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化 型為研究對(duì)象 通過(guò)從設(shè)施溫室土壤中篩選出高 效拮抗菌株并研究其抑菌作用 旨在為進(jìn)一步探 究拮抗菌的生防作用機(jī)制提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料 病原菌 尖孢鐮刀菌 F oxysporum 黃瓜轉(zhuǎn) 化型 由遼寧省微生物科學(xué)研究院分離 1 2 拮抗菌的篩選和鑒定 1 2 1 拮抗菌篩選 于遼寧省朝陽(yáng)市喀左縣六官營(yíng)子鄉(xiāng)東前溝村 N41 16 E119 68 種植黃瓜的設(shè)施溫室中采集 土壤樣品 將其混勻后稱(chēng)取1 0 g放至99 mL 無(wú)菌水中 振蕩約30 min 梯度稀釋至10 5倍 吸 取100 L均勻涂布于含病原菌的平皿中 28 培養(yǎng)24 h 將能產(chǎn)生抑菌圈的菌株分離純化 即 得到初篩菌株 利用平板對(duì)峙法 12 測(cè)定抑菌率 篩選出抑菌率較高的拮抗菌株 抑菌率 對(duì)照 菌落直徑 處理菌落直徑 對(duì)照菌落直徑 100 1 2 2 生理生化鑒定及16S rDNA序列比對(duì) 采用劃線(xiàn)法將所得拮抗菌株接種到LB固 體培養(yǎng)基 13 平皿上 觀(guān)察菌落形態(tài)及其顯微形 態(tài) 并進(jìn)行生理生化試驗(yàn) 16S rDNA擴(kuò)增引物 序列為 F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和R 5 CTACGGCTACCTTGTTACGA 3 反 應(yīng)體系總體積50 0 L 包括 上 下游引物各 1 5 L 細(xì)菌基因組1 0 L 10 Buffer 5 0 L Taq聚合酶1 0 L dNTP 1 0 L ddH2O 39 0 L 反應(yīng)條件為 95 5 min 95 30 s 58 30 s 72 90 s 35個(gè)循環(huán) 72 7 min PCR 產(chǎn)物 經(jīng)1 瓊脂糖凝膠電泳后送至上海派森諾生物技 術(shù)有限公司完成測(cè)序 將16S rDNA序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析 利 用MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)及構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 1 3 抑菌作用研究 1 3 1 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲的影響 采用平皿倒扣法 一個(gè)平皿加入PDA培養(yǎng)基 并于中心接種直徑為5 mm的尖孢鐮刀菌菌塊 另 一個(gè)平皿加入LB固體培養(yǎng)基 將拮抗菌種混懸 液 調(diào)節(jié)密度為108 CFU mL 均勻涂布 2個(gè)平皿倒 扣用封口膜封口 并用保鮮膜密封 以空白LB 固體培養(yǎng)基平皿為對(duì)照 28 培養(yǎng) 觀(guān)察處理組 病原菌生長(zhǎng)情況 每個(gè)處理重復(fù)3次 14 1 3 2 拮抗菌對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 采用平板對(duì)峙法 將直徑為5 mm的尖孢鐮 刀菌菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平皿中心 在距離 中心2 5 cm處接種拮抗菌菌塊 挑取靠近拮抗菌 一側(cè)的病原菌菌絲 在顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)變 化 將靠近拮抗菌一側(cè)的病原菌菌絲轉(zhuǎn)接到新的 PDA培養(yǎng)基上 28 恒溫培養(yǎng) 觀(guān)察其是否有 430云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第 37 卷 再生長(zhǎng)能力 每24 h測(cè)量菌落直徑大小 以未經(jīng) 對(duì)峙處理的病原菌菌絲為對(duì)照 每個(gè)處理組設(shè)置 3個(gè)重復(fù) 15 1 3 3 胞外物質(zhì)對(duì)病原菌及孢子萌發(fā)的影響 將拮抗菌接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中 37 180 r min培養(yǎng)24 h得到種子液 將種子 液按2 的比例接到LB液體培養(yǎng)基中 37 180 r min培養(yǎng)24 h 低溫5 000 r min離心10 min 棄去下沉菌體 再用0 22 m濾膜過(guò)濾 即得到 無(wú)菌發(fā)酵液 將培養(yǎng)5 d的病原菌菌絲用去離 子水洗脫 再用6層紗布過(guò)濾 10 000 r min離心 5 min 棄去上清液 收集孢子 用去離子水制備 孢子混懸液 調(diào)節(jié)其密度為106 個(gè) mL 備用 將1 mL病原菌孢子混懸液與10 mL融化冷 卻至約45 的PDA培養(yǎng)基混合搖勻后倒入平 皿中冷卻 采用牛津杯法 向牛津杯中加入100 L 無(wú)菌發(fā)酵液 以L(fǎng)B液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照 將 平皿置于 28 1 培養(yǎng)24 h 觀(guān)察是否有抑菌 圈出現(xiàn) 并測(cè)量抑菌圈大小 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè) 重復(fù) 16 精確吸取0 50 mL孢子混懸液與同體 積無(wú)菌發(fā)酵液混合 將混合液體滴于凹玻片 然 后放于平皿中 加蓋保濕培養(yǎng) 恒溫箱設(shè)置28 分別于2 4 6 8和10 h檢測(cè)孢子萌發(fā)數(shù) 以 無(wú)菌水為對(duì)照 每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù) 17 1 4 HPLC分析條件 采用Agilent 1260高效液相色譜分析儀和V enusil XBP C18色譜柱 4 6 mm 250 mm 5 m 進(jìn) 行HPLC分析 流動(dòng)相由色譜純乙腈 A 和純化 水 B 組成 梯度洗脫程序見(jiàn)表1 進(jìn)樣量20 L 流速1 0 mL min 波長(zhǎng)220 nm 收集各峰成分并 進(jìn)行抑菌試驗(yàn) 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗菌篩選結(jié)果 土壤樣品中共分離出細(xì)菌菌株32株 其中 有8株 XN 1 XN 8 對(duì)尖孢鐮刀菌有抑菌作用 由表2可知 XN 3的抑菌率最高 為71 81 故選擇XN 3進(jìn)行下一步試驗(yàn) 2 2 形態(tài)學(xué)及生理生化特征 由圖1可知 XN 3單菌落呈白色 近圓 形 表面半干燥 有隆起褶皺 顯微鏡下菌體呈 桿狀 產(chǎn)橢圓形芽孢 革蘭氏顏色試驗(yàn)呈陽(yáng)性 通過(guò)生理生化試驗(yàn)結(jié)果 表3 并結(jié)合 常見(jiàn)細(xì)菌 表 1 梯度洗脫程序 Tab 1 Gradient elution program 時(shí)間 min time 流動(dòng)相A mobile phase A 流動(dòng)相B mobile phase B 0 01 20 80 5 00 20 80 33 00 80 20 38 00 80 20 40 00 20 80 45 00 20 80 表 2 菌株XN 1 XN 8測(cè)定抑菌率結(jié)果 Tab 2 Results of XN 1 XN 8 antibacterial rate 編號(hào) number 抑菌率 antibacterial rate 編號(hào) number 抑菌率 antibacterial rate XN 1 51 16 0 98 c XN 5 45 28 0 40 d XN 2 46 15 0 22 d XN 6 35 77 0 51 e XN 3 71 81 1 14 a XN 7 55 48 0 74 b XN 4 26 19 0 76 f XN 8 25 23 1 07 f 注 不同字母表示差異顯著 P 0 05 下同 Note Different letters indicate significant difference P 0 05 the same as below 表 3 細(xì)菌XN 3生理生化特征 Tab 3 The physiological and biochemical characteristics of XN 3 檢測(cè)項(xiàng)目 test items 檢測(cè)結(jié)果 detection result 檢測(cè)項(xiàng)目 test items 檢測(cè)結(jié)果 detection result V P反應(yīng) Voges Prokauer reaction 淀粉水解 starch hydrolysis 檸檬酸鹽 citrate utilization 蔗糖水解 sucrose hydrolysis 明膠液化 hydrolysis of gelatin 脲酶水解 urea hydrolysis 蔗糖發(fā)酵 sucrose fermentation 吲哚試驗(yàn) indole test 甘露醇發(fā)酵 mannitol fermentation 接觸酶試驗(yàn) catalase test 注 陽(yáng)性反應(yīng) 陰性反應(yīng) Note positive reaction negative reaction a b 圖 1 XN 3在LB培養(yǎng)基 a 和光學(xué) 顯微鏡下 b 的形態(tài)特征 Fig 1 The morphological characteristics of XN 3 in LB medium a and light microscope b 第 3 期敖 靜 等 一株黃瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及抑菌作用初探431 系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 18 和 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè) 19 將XN 3鑒定為芽孢桿菌屬 2 3 分子生物學(xué)鑒定 將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核 苷酸序列進(jìn)行同源性分析 結(jié)果顯示菌株XN 3與解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 16S rDNA序列的同源相似性最高 為99 由圖2 可知 菌株XN 3與解淀粉芽孢桿菌 位于同一分支 結(jié)合菌體形態(tài)特征及生理生 化鑒定結(jié)果 可確定XN 3為解淀粉芽孢菌 將其核酸序列上傳至Genebank 獲取登錄號(hào) 為 OK465112 2 4 抑菌作用 2 4 1 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲的影響 由圖3可知 對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)較好 菌 絲較長(zhǎng) 且氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛 處理組菌絲卷 曲 長(zhǎng)度變短 說(shuō)明XN 3能夠產(chǎn)生對(duì)病原菌菌 絲生長(zhǎng)有抑制作用的揮發(fā)性氣體 2 4 2 拮抗菌對(duì)病原菌菌絲的影響 由圖4可知 對(duì)照組菌絲粗細(xì)均勻 表面光 滑 有彈性 菌絲內(nèi)原生質(zhì)均勻分布 有少量孢 子產(chǎn)生 處理組菌絲膨大 變彎變短 粗細(xì)不均 勻 菌絲分節(jié)現(xiàn)象明顯 頂端出現(xiàn)不規(guī)則分支 分枝菌絲生長(zhǎng)受阻 有厚垣孢子生成 由圖5可知 在72 h內(nèi) 處理組菌落直徑分 別為10 06 21 00和35 00 mm 均小于對(duì)照組 說(shuō)明處理組菌絲生長(zhǎng)初期受限 但并未完全失去 生長(zhǎng)能力 隨著菌絲生長(zhǎng) 96 h后對(duì)照組和處理 NZ CP053376 1 9815 11241 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome NZ CP053376 1 97405 98831 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome XN3 NZ LSAZ01000028 1 142 1568 Bacillus nakamurai strain NRRL B 41091 Bacillus sp B 41091 contig 34 whole genome shotgun sequence NZ PELK01000474 1 1 1255 Methylobacterium frigidaeris strain IER25 16 C23285 whole genome shotgun sequence NZ QFRW01000020 1 127 1552 Glycomyces dulcitolivorans strain SJ 25 scaffold 20 whole genome shotgun sequence NZ CP011150 1 591164 592589 Bacillus altitudinis strain W3 chromosome complete genome NZ LJJC01000004 1 78639 80066 Bacillus shackletonii strain LMG 18435 super 11 whole genome shotgun sequence NZ CP015506 1 33083 34509 Bacillus oceanisediminis 2691 chromosome complete genome NZ QXIR01000081 1 1 1384 Bacillus salacetis strain SKP7 4 whole genome shotgun sequence NZ CP031443 1 287015 288443 Bacillus mobilis strain ML A2C4 chromosome complete genome NZ RCHJ01000063 1 72 1499 Piscinibacter defluvii strain SH 1 contig 063 whole genome shotgun sequence NZ CP053376 1 2980530 2981956 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome NC 006270 3 3121828 3123255 Bacillus licheniformis DSM 13 ATCC 14580 complete sequence100 89 97 47 49 76 76 99 0 1 圖 2 XN 3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) Fig 2 The 16S rDNA phylogenetic evolution tree of XN 3 a b 圖 3 對(duì)照組 a 和處理組 b 的菌絲形態(tài)比較 Fig 3 Comparison of mycelium morphology of control group a and treatment group b a b 圖 4 光學(xué)顯微鏡下對(duì)照組 a 和 處理組 b 的菌絲形態(tài)比較 Fig 4 Comparison of mycelium morphology of control group a and treatment group b under light microscope 0 10 20 30 40 50 60 70 80 24 48 72 96 120 144 對(duì)照組 control group 處理組 treatment group 菌落直徑 mm colony diameter 時(shí)間 h time 圖 5 菌絲生長(zhǎng)情況比較 Fig 5 Comparison of mycelial growth 432云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第 37 卷 組菌落直徑基本一致 2 4 3 胞外物質(zhì)對(duì)病原菌及孢子萌發(fā)的影響 由表4可知 無(wú)菌發(fā)酵液可對(duì)病原菌產(chǎn)生抑 菌作用 抑菌圈直徑為18 23 mm 說(shuō)明XN 3胞 外物質(zhì)對(duì)病原菌有抑制作用 同時(shí) 處理組孢子 萌發(fā)率明顯降低 對(duì)照組孢子完全萌發(fā)時(shí) 處理 組孢子萌發(fā)率僅為10 23 說(shuō)明XN 3無(wú)菌發(fā)酵 液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用 2 5 HPLC分析結(jié)果 由圖6可知 無(wú)菌發(fā)酵液共分離出2個(gè)峰 保留時(shí)間分別為29 728 A 1 和35 858 min A 2 峰面積分別為116 444和198 887 收集出峰成分 進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn) 結(jié)果 圖7 顯示 峰A 2中 成分有抑菌圈出現(xiàn) 具有較明顯抑菌作用 3 討論 尖孢鐮刀菌是土傳病原真菌 且分布廣泛 在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中很難防治 現(xiàn)已成為植物病理 中的第三大土傳病原真菌 6 長(zhǎng)期以來(lái) 過(guò)度的 化學(xué)防治已造成嚴(yán)重的環(huán)境污染甚至影響人類(lèi)健 康 因此 應(yīng)用綠色生物防治技術(shù) 篩選尖孢鐮 刀菌高效拮抗菌株 明顯其抑菌成分 探究其作 用機(jī)理并研究其田間防治效果具有重要的理論和 實(shí)踐意義 本研究以尖孢鐮刀菌引起的黃瓜 枯萎病為靶標(biāo)進(jìn)行高效拮抗菌的篩選 得到1株 抑菌率高達(dá)71 81 的細(xì)菌菌株XN 3 經(jīng)鑒定 為解淀粉芽孢桿菌 而解淀粉芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮 刀菌具有明顯的抑菌作用 這與張美君等 20 的研 究結(jié)論一致 此外 解淀粉芽孢桿菌是一種具有 廣泛抑菌作用的生防菌 有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)橡膠樹(shù) 褐根病菌 Phellinus noxius 橡膠疫霉 Phytoph thora heveae 小孢擬盤(pán)多毛 Pestalotiopsis mi crospora 和尖孢炭疽病菌 Colletotrichum acut atum 等多種病原真菌具有較好的抑菌效果 21 因此 對(duì)XN 3的研究具有更廣闊的應(yīng)用價(jià)值 這也是本研究的重要意義所在 本研究表明 XN 3能夠產(chǎn)生有抑菌作用的 揮發(fā)性物質(zhì) 有研究顯示 解淀粉芽孢桿菌能夠 產(chǎn)生抑制青霉菌的羥基丁酮以及2 癸酮等11種 揮發(fā)性有機(jī)物 VOCs 這些有機(jī)物都可以有效 抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā) 22 23 郝 象瑢等 24 利用GC MS研究解淀粉芽孢桿菌 LJ02產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)多種果類(lèi)致病菌的作 用 特別是對(duì)黑腐皮殼菌 Valsa mali 草莓灰霉 病菌 Botrytis cinerea 和棗漿胞病菌 Alternaria spp 有顯著抑制效果 抑菌率均大于50 本研 究顯示 XN 3可使病原菌菌絲卷曲 長(zhǎng)度變 短 顯微形態(tài)出現(xiàn)菌絲膨大和彎曲不均 分枝菌 絲生長(zhǎng)受阻 這些病原菌菌絲形態(tài)的變化可能是 由于XN 3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)破壞了病原菌菌絲細(xì) 胞 利用HPLC分析技術(shù) 通過(guò)收集分離出的各 峰組分 在峰A 2中發(fā)現(xiàn)對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯 表 4 XN 3無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響 Tab 4 Effect of XN 3 aseptic fermentation broth on spore germination of pathogenic bacteria 處理 treatments 孢子萌發(fā)率 spore germination rate平均抑菌圈直徑 mm antibacterial circle diameter2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 對(duì)照組 control group 12 56 1 06 e 53 23 1 57 d 87 32 2 49 c 98 65 0 92 b 99 26 0 83 a 處理組 treatment group 3 20 0 12 e 5 36 0 14 d 7 02 0 54 c 8 35 0 15 b 10 23 0 47 a 18 23 0 36 a 注 未產(chǎn)生抑菌圈 Note no inhibition zone produced 2 5 0 0 10 20 30 29 728 35 858 40 保留時(shí)間 min retention time 2 5 5 0 通道電壓 mV channel voltage 圖 6 無(wú)菌發(fā)酵液HPLC色譜圖 Fig 6 HPLC chromatogram of sterile fermentation liquid a b 圖 7 峰A 1 a 與峰A 2 b 成分的抑菌作用 Fig 7 Fungicidal activity of the components of peak A 1 a and peak A 2 b 第 3 期敖 靜 等 一株黃瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及抑菌作用初探433 抑菌作用的成分 權(quán)春善等 25 和王軍華等 26 研究 發(fā)現(xiàn) 解淀粉芽孢桿菌對(duì)病原菌菌絲細(xì)胞有強(qiáng)烈 的破壞作用 ARREBOLA等 22 研究發(fā)現(xiàn) 解淀 粉芽孢桿菌PPCB004對(duì)青霉屬真菌的菌絲延伸 有強(qiáng)烈的抑制作用 能抑制其生長(zhǎng)速度 劉超 等 27 研究發(fā)現(xiàn) 解淀粉芽孢桿菌BA 26發(fā)酵液組 分中的抗菌物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢 Botrytis cinerea 孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng) 這些研究均驗(yàn)證了解淀 粉芽孢桿菌的廣譜抑菌作用 同時(shí)也說(shuō)明解淀粉 芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌成分是可被分離的 為微生物發(fā)酵生物農(nóng)藥的研發(fā)提供可能性 但在 本研究中XN 3抑菌物質(zhì)的含量 種類(lèi)及具體的 抑菌機(jī)理尚不明確 有待進(jìn)一步探索和研究 本研究篩選出1株抑菌率較高的解淀粉芽孢 桿菌XN 3 可為今后植物病害綠色防治提供菌 種種質(zhì)資源 通過(guò)對(duì)其抑菌作用的初探 為進(jìn)一步 研究生防機(jī)制奠定基礎(chǔ) 為針對(duì)尖孢鐮刀菌引發(fā) 的植物病害研發(fā)綠色生物農(nóng)藥提供依據(jù)和方向 4 結(jié)論 本研究在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中分離篩選出8株黃 瓜枯萎病的高效拮抗菌菌株 其中 抑菌率最高 的菌株XN 3鑒定為解淀粉芽孢桿菌 B amyloliti cus XN 3能夠產(chǎn)生有抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì) 能夠抑制病原菌菌絲生長(zhǎng) 且胞外物質(zhì)能夠有效 地抑制病原菌孢子萌發(fā) 其發(fā)酵液組分A 2中有 明顯抑菌作用的成分 參考文獻(xiàn) KING B C WAXMAN K D NENNI N V et al Arsen al of plant cell wall degrading enzymes reflects host pref erence among plant pathogenic fungi J Biotechnology for Biofuels 2011 4 4 DOI 10 1186 1754 6834 4 4 1 BANI M RISPAIL N EVIDENTE A et al Identifi cation of the main toxins isolated from Fusarium oxy sporum f sp pisi race 2 and their relation with isolates pathogenicity J Journal of Agricultural and Food Chem istry 2014 62 12 2574 DOI 10 1021 jf405530g 2 李敏慧 苑曼琳 姜子德 等 香蕉枯萎病菌致病機(jī)理研 究進(jìn)展 J 果樹(shù)學(xué)報(bào) 2019 36 6 803 DOI 10 13925 ki gsxb 20180523 3 梁銀 張谷月 王辰等 一株拮抗放線(xiàn)菌的鑒定及其對(duì) 黃瓜枯萎病的生防效應(yīng)研究 J 土壤學(xué)報(bào) 2013 50 4 810 DOI 10 11766 trxb201208010308 4 蔡文涌 王肖肖 方香玲 不同尖孢鐮刀菌菌株對(duì)紫花 苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響 J 草地學(xué)報(bào) 2020 28 5 1233 DOI 10 11733 j issn 1007 0435 2020 05 007 5 文增葉 李定華 代夢(mèng)瑤 等 尖孢鐮刀菌全基因組測(cè)序 及其致病相關(guān)基因分析 J 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué) 2020 39 3 1106 DOI 10 13417 j gab 039 001105 6 田倍齊 龔曉麗 溫蕓蕓 等 隆德縣大田辣椒枯萎病氣 7 象條件分析 J 農(nóng)業(yè)科技與信息 2020 13 31 DOI 10 15979 62 1057 s 2020 13 012 王麗波 崔玥晗 岳玲 等 百合枯萎病的研究進(jìn)展 J 園藝與種苗 2018 38 12 51 DOI 10 16530 ki cn21 1574 s 2018 12 018 8 何歡 王占武 胡棟 等 根系分泌物與根際微生物互作 的研究進(jìn)展 J 河北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011 3 70 DOI 10 16318 ki hbnykx 2011 03 029 9 翟爭(zhēng)光 黃松青 栗廣增 等 植物根系分泌物研究進(jìn) 展 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2012 24 12 28 DOI 10 19386 ki jxnyxb 2012 12 009 10 王敏 土傳黃瓜枯萎病治病生理機(jī)制及其與氮素營(yíng)養(yǎng) 關(guān)系研究 D 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013 11 方中達(dá) 植病研究方法 M 北京 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 1998 12 楊革 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程 M 4版 北京 科學(xué)出版社 2010 13 祝久香 黃瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選 發(fā)酵及生防機(jī) 制研究 D 長(zhǎng)沙 中南林業(yè)科技大學(xué) 2019 14 李曉紅 解淀粉芽孢桿菌抑菌作用機(jī)理的探究 D 沈 陽(yáng) 沈陽(yáng)師范大學(xué) 2016 15 秦楠 解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白鑒定及抑菌 機(jī)理研究 D 晉中 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015 16 NY Y 1156 1 2006 農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺菌 劑 第1部分 抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn) 凹玻片法 S 17 東秀珠 蔡妙英 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) M 北京 科 學(xué)出版社 2001 18 BUCHANAN R E GIBBONS N E 伯杰細(xì)菌鑒定手 冊(cè) M 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 譯 8版 北京 科學(xué) 出版社 1984 19 張美君 吳慶 尹翠等 尖鐮孢黃瓜專(zhuān)化型枯萎病菌拮 抗菌的篩選 鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化 J 生物技術(shù)通報(bào) 2020 36 9 125 DOI 10 13560 ki biotech bull 1985 2020 0578 20 賀海濱 蘇峻 冬滕凱 等 解淀粉芽孢桿菌研究進(jìn) 展 J 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2021 2 101 DOI 10 3969 j issn 1007 5739 2021 02 043 21 ARREBOLA E JACOBS R KORSTEN L et al Iturin A is the principal inhibitor in the biocontrol activity of Bacillusamy loliquefaciens PPCB004 against posthar vest fungal pathogens J Journal of Applied Microbio logy 2010 108 2 386 DOI 10 1111 j 1365 2672 2009 04438 x 22 樊麗娟 郭海 楊成德 等 內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌 262AG6抑菌物質(zhì)的初步探究 J 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 29 6 912 DOI 10 7606 j issn 1004 1389 2020 06 012 23 郝象瑢 盧志軍 王婧 等 解淀粉芽孢桿菌LJ02抑菌氣 體分析 J 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 2016 23 3 23 DOI 10 3969 j issn 1008 5394 2016 03 006 24 權(quán)春善 王軍華 徐洪濤 等 一株抗真菌解淀粉芽孢桿 菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究 J 微生物學(xué) 報(bào) 2006 46 1 7 DOI 10 13343 ki wsxb 2006 01 003 25 王軍華 權(quán)春善 徐洪濤 等 解淀粉芽孢桿菌Q 12抗 真菌特性的研究 J 食品與發(fā)酵工業(yè) 2006 32 6 47 DOI 10 3321 j issn 0253 990X 2006 06 013 26 劉超 劉宏偉 汪步清 等 解淀粉芽孢桿菌BA 26抗菌 物質(zhì)分離及對(duì)灰葡萄孢抑菌作用研究 J 生物技術(shù)通 報(bào) 2019 35 7 83 DOI 10 13560 ki biotech bull 1985 2019 0055 27 責(zé)任編輯 何謦成 434云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第 37 卷