第 13 卷 第 7 期 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報 Vol 13 No 7 2022 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr 2022 基金項目 上海市科技興農(nóng)項目 2019 02 08 00 02 F01153 Fund Supported by the Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program 2019 02 08 00 02 F01153 通信作者 葛宇 博士 教授級高級工程師 主要研究方向為食品化妝品檢測及評估 E mail geyu Corresponding author GE Yu Ph D Professor Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research No 381 Cangwu Road Xuhui District Shanghai 200233 China E mail geyu r A M 1 E 余 靜 1 吳 新 2 冷桃花 2 宮 衡 1 葛 宇 1 2 1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 上海 200237 2 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院 國家食品檢驗檢測中心 上海 200233 摘 要 目的 建立高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法測定芝麻菜中蘿卜硫素的分析方法 方法 芝麻菜樣品加入一 定量 pH 6磷酸緩沖溶液 于 50 水浴下振蕩水解 2 h 冷卻至室溫后經(jīng)二氯甲烷萃取 萃取液吹干后用乙腈復(fù)溶 以 0 1 甲酸水溶液 乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫 經(jīng) Zorbax SB C 18 色譜柱 100 mm 2 1 mm 3 5 m 進(jìn)行分離 采用 電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測 multiple response monitoring MRM 模式檢測 外標(biāo)法定量測定新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的 含量 結(jié)果 蘿卜硫素在 10 500 ng mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 r 2 0 999 檢出限為 4 0 g kg 定量限為 13 0 g kg 在低 中 高 3 水平的加標(biāo)回收率為 95 7 104 0 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于 1 000 應(yīng)用本研究建 立的方法對不同生長周期新鮮芝麻菜中蘿卜硫素含量檢測 變化趨勢與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致 蘿卜硫素在生長 過程中逐漸積累 成熟前期達(dá)到最高 到成熟后期由于植物衰老蘿卜硫素含量存在下降趨勢 結(jié)論 本方法滿 足準(zhǔn)確度 精密度及靈敏度等要求 適用于新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的檢測 關(guān)鍵詞 蘿卜硫素 芝麻菜 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry YU Jing 1 WU Xin 2 LENG Tao Hua 2 GONG Heng 1 GE Yu 1 2 1 School of Biological Engineering East China University of Science Technology Shanghai 200237 China 2 Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research National Food Inspection and Testing Center Shanghai 200233 China ABSTRACT Objective To establish a method for the determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Methods The samples were added to pH 6 phosphate buffer solution and hydrolyzed by shaking in 50 water bath for 2 h After cooling to room temperature and extraction by dichloromethane the extract was blown dry and re solubilized with acetonitrile separated on Zorbax SB C 18 column 100 mm 2 1 mm 3 5 m using 0 1 formic acid aqueous solution and acetonitrile as mobile phase glucoerucin in fresh Eruca sativa Mill was detected by electrospray positive ion and multiple response monitoring MRM mode and quantified by external standard method Results The linear range of sulforaphane was 10 500 ng mL r 2 0 999 the limit of detection was 4 0 g kg and the limit of quantification was 13 0 g kg The spiked recoveries ranged from 95 7 to 104 0 at the low medium and high levels and the relative standard deviations were less than 1 0 The method established in this study was applied to determine the content of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill of different growth cycles and the change of trend were basically consistent with the literature reports Sulforaphane DOI 10 19812 ki jfsq11 5956 ts 2022 07 047 第 7 期 余 靜 等 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法測定芝麻菜中蘿卜硫素 2247 accumulated gradually accumulated during the growth and reached a maximum at the early maturity However the sulforaphane content had a decreasing trend at the late maturity due to plant senescence Conclusion This method meets the requirements of accuracy precision and sensitivity and can be used for the determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill KEY WORDS sulforaphane Eruca sativa Mill high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 0 引 言 芝麻菜 Eruca sativa Mill 是源于地中海營養(yǎng)豐富 的綠葉蔬菜之一 主要因其辛辣的香氣和味道而變得流 行 1 2 芝麻菜可提供各種植物營養(yǎng)素 如硫代葡萄糖苷 酚類化合物和維生素 C 等 3 已有研究報道在各種芝麻 菜組織中發(fā)現(xiàn)了相對較高濃度的芝麻菜苷 glucoerucin GER 和蘿卜硫苷 glucoraphanin GRA 4 5 芝麻菜苷和蘿 卜硫苷經(jīng)植物內(nèi)源性黑芥子酶 myrosinase enzyme 水解 可得到一類脂肪族異硫氰酸酯 芝麻菜素 erucin 和蘿卜 硫素 sulforaphane SFN 別稱萊菔硫烷 6 芝麻菜素在 一定條件下也可以和蘿卜硫素相互轉(zhuǎn)化 7 蘿卜硫素是蔬 菜中天然抗癌效果最顯著的植物活性物質(zhì)之一 可以通 過誘導(dǎo) 期酶和抑制 期酶來抑制或阻止腫瘤生長 8 10 具 有很強(qiáng)的抗氧化活性 11 12 抗炎抗菌性 13 14 和神經(jīng)保護(hù)功 能 15 16 等 目前關(guān)于蘿卜硫素的檢測方法包括氣相色譜 質(zhì)譜 法 17 高效液相色譜法 18 19 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 等 由于蘿卜硫素遇熱不穩(wěn)定 氣相色譜法檢測容易導(dǎo)致 數(shù)據(jù)偏低 高效液相色譜法則分離時間較長 基質(zhì)干擾太 大 而高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度和特異 性等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為目前使用最為廣泛的方法 有關(guān)蘿卜硫 素的研究多集中在十字花科蕓薹屬 包括西蘭花 花椰菜 等 植物 20 21 蜂蜜 花粉中蘿卜硫素的分析也有少量報 道 22 23 但幾乎沒有關(guān)于新鮮蔬菜中蘿卜硫素直接測定 的研究 通常 針對蔬菜中蘿卜硫素的研究基本以冷凍干 燥或烘干后的蔬菜粉末為對象 然而 已有研究表明 新 鮮西蘭花中蘿卜硫素的提取率要明顯高于干燥西蘭花 24 猜測可能與內(nèi)源性黑芥子酶活性有關(guān) 研究表明 蔬菜中 硫代葡萄糖苷的水解會受到 pH 和 Fe 2 等因素影響 形成 多種降解產(chǎn)物 包括異硫氰酸酯 腈類等化合物 25 往往 會造成蘿卜硫素產(chǎn)量降低 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在 2020 年也發(fā) 布了 NY T 3674 2020 油菜薹中萊菔硫烷含量的測定 液 相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 然而不同類型的樣品其水解條件方 面均存在差異 26 28 因此本研究選用新鮮芝麻菜 通過優(yōu) 化樣品前處理方法 建立新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的高效液 相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 為新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的定量檢 測提供技術(shù)支撐 1 材料與方法 1 1 材料 試劑與儀器 新鮮芝麻菜由上海百蒂凱蔬果種植專業(yè)合作社提供 支持 清洗勻漿處理置于 20 保存 蘿卜硫素 CAS 4478 93 7 純度 98 0 加拿大 TRC 公司 黑芥子硫苷酸鉀 sinigrin CAS 3952 98 5 純 度 95 德國 PhytoLab 公司 磷酸氫二鉀 磷酸 乙二 胺四乙酸 分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 二氯甲 烷 色譜純 西格瑪奧德里奇 上海 貿(mào)易有限公司 乙腈 色譜純 美國 Fisher 公司 甲酸 色譜純 美國 ACS 色譜 試劑公司 二硫蘇糖醇 5 甘油 上海麥克林生化科技有 限公司 實(shí)驗用水均為超純水 ACQUITY UPLC H Class 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美 國 Waters 公司 Vortex Genie 2 2T 渦旋振蕩器 美國 SI 公 司 FE20 實(shí)驗室 pH 計 MSZO 204S 型電子天平 220 g 0 1 mg 瑞士 Mettler Toleo 公司 JulaboSW22 恒溫振蕩水 浴搖床 德國 Julabo 公司 H24R1 高速冷凍離心機(jī) 長沙湘 智離心機(jī)儀器有限公司 N1 28 全自動氮吹濃縮儀 上海屹 堯儀器科技發(fā)展有限公司 SK5210HP 超聲波清洗儀 上海 科導(dǎo)超聲儀器有限公司 Zorbax SB C 18 100 mm 2 1 mm 3 5 m 美國安捷倫 Agilent 公司 1 2 實(shí)驗方法 1 2 1 樣品前處理 取充分破碎的新鮮芝麻菜樣品 2 5 g 左右 置于 50 mL 離心管 加入 pH 6 磷酸緩沖溶液 20 mL 渦旋混勻 50 恒溫振蕩水浴鍋中水浴 2 h 待冷卻至室溫后加入 20 mL 二氯甲烷萃取 9000 r min 條件下離心 5 min 收集二氯甲 烷層 重復(fù)萃取 2 次 合并二氯甲烷層定容至 100 mL 取 10 mL萃取液于 45 氮?dú)鈼l件下吹干 加入 10 mL乙腈復(fù) 溶 經(jīng) 0 22 m 膜過濾 供上機(jī)測定分析 1 2 2 儀器條件 色譜柱 Zorbax SB C 18 100 mm 2 1 mm 3 5 m 流動 相 A 0 1 甲酸水溶液 B 乙腈 柱溫 30 進(jìn)樣量 5 L 流速 0 3 mL min 流動相梯度 0 1 min 95 A 1 6 min 95 20 A 6 8 min 20 A 8 10 min 20 95 A 電噴霧離子源模式 正離子模式 毛細(xì)管電壓 2 00 kV 2248 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報 第 13 卷 錐孔電壓 20 kV 脫溶劑氣溫度 600 脫溶劑氣流速 1000 L Hr 碰撞氣流速 0 15 mL min 離子源溫度 150 蘿卜硫素 178 114 定性離子 碰撞能 10 V 178 72 定量離子 碰撞能 25 V 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖 1 1 2 3 黑芥子酶活性測定 參考張蕾等 29 方法并加以改良 稱取新鮮芝麻菜樣品 150 mg 加入 1 mL 含 1 mmol L 乙二胺四乙酸 3 mmol L 二 硫蘇糖醇 5 甘油的 10 mmol L pH 7 2 磷酸鹽緩沖液 離心取 上清液作為酶液 取 3 mL含 0 2 mmol L黑芥子硫苷酸鉀的 33 3 mmol L pH 6 5 磷酸鹽緩沖液 加入 150 L 酶液 在 50 條件 下反應(yīng) 20 min 冷卻至室溫后于 227 nm 處測量吸光度 圖 1 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖 50 g L Fig 1 Standard chromatograms of sulforaphane 50 g L 1 2 4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用 GraphPad Prism 9 0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 2 結(jié)果與分析 2 1 前處理條件優(yōu)化 2 1 1 磷酸鹽緩沖溶液 pH 對蘿卜硫素提取量的影響 BELL等 30 研究表明 蘿卜硫苷在中性 pH 5 8 條件下 水解過程中間體糖苷配基會發(fā)生分子內(nèi)重排反應(yīng) 生成產(chǎn) 物為蘿卜硫素 在酸性條件 pH 2 5 并且 Fe 2 和 ESP 蛋白 并存的條件下 最終產(chǎn)物主要為腈類等化合物 圖 2 左 本 研究探討了 pH 為 2 3 4 5 6 7 8 9 10 的磷酸鹽 緩沖溶液對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 實(shí)驗結(jié)果 表明 隨著磷酸鹽緩沖溶液 pH 由強(qiáng)酸性到中性 新鮮芝麻 菜中蘿卜硫素的含量逐漸升高 至 pH 6 的弱酸性環(huán)境時達(dá) 到最高 而隨著 pH 繼續(xù)增大 此時的環(huán)境已經(jīng)不適宜蘿卜 硫素的水解生成 蘿卜硫素的提取量則逐漸下降 圖 2 右 因此本研究選擇 pH 6 的磷酸緩沖溶液為提取溶劑 2 1 2 水解溫度對蘿卜硫素提取量的影響 考慮到蘿卜硫素的提取與內(nèi)源性黑芥子酶的活性相 關(guān) 而內(nèi)源性黑芥子酶的活性與溫度相關(guān) 本研究首先探 討了水解溫度為 30 40 50 60 70 時新鮮芝麻菜中黑 芥子酶活性變化 如圖 3 所示 在水解溫度為 50 時 黑 芥子酶活性達(dá)到最強(qiáng) 隨后 研究比較了相同溫度梯度變 化對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 實(shí)驗結(jié)果表明 蘿卜硫素提取量也在 50 達(dá)到最高 與內(nèi)源性黑芥子酶 活性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系 圖 3 且結(jié)果與文獻(xiàn) 31 報道一致 內(nèi)源黑芥子酶隨著溫度的升高 活性逐漸增大 導(dǎo)致蘿卜 注 表硫特異性蛋白 epithiospecifier protein ESP 硫氰酸鹽形成蛋白 thiocyanate forming protein TFP 表硫特異性改性劑 epithiospecifier modifier ESM 腈特異性蛋白 nitrile specifier protein NSP 圖 2 蘿卜硫苷水解過程 左 及 pH 對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 右 n 3 Fig 2 Hydrolysis process of glucoraphanin left and effects of pH on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill right n 3 第 7 期 余 靜 等 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法測定芝麻菜中蘿卜硫素 2249 硫苷水解加劇 進(jìn)而促使蘿卜硫素含量逐漸上升 當(dāng)溫度 大于 50 后 新鮮芝麻菜內(nèi)黑芥子酶活性逐漸降低亦或 是在高溫下被滅活 蘿卜硫苷水解進(jìn)一步得到緩解 蘿卜 硫素含量也相應(yīng)大幅度下降 因此本研究選擇 50 為最 佳水解溫度 圖 3 水解溫度對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量及黑芥子酶活性 的影響 n 3 Fig 3 Effects of hydrolysis temperatures on extraction of sulforaphane and the activities of myrosinase enzyme in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 1 3 水解時間對蘿卜硫素提取量的影響 鑒于蘿卜硫苷在黑芥子酶作用下水解過程需要一定 的時間 因此恒溫條件下水解時間對蘿卜硫素的提取量也 有一定的影響 本研究比較了水解時間為 0 5 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 10 0 12 0 h 時新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的提 取量 結(jié)果顯示 隨著水解時間的增加 蘿卜硫素提取量 逐漸增大 至 2 0 h 時達(dá)到最大 之后 隨著水解時間的持 續(xù)增加 蘿卜硫素含量略微下降 最終趨于平穩(wěn) 圖 4 這 可能是由于水解產(chǎn)生的蘿卜硫素長期在水溶液中不穩(wěn)定 發(fā)生降解導(dǎo)致其含量降低 32 因此本研究選擇 2 0 h 為最 佳水解時間 圖 4 水解時間對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 n 3 Fig 4 Effects of hydrolysis times on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 1 4 萃取次數(shù)對蘿卜硫素提取量的影響 萃取次數(shù)對萃取效率存在一定的影響 本研究比較 了不同萃取次數(shù)對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 結(jié)果表明 蘿卜硫素提取量隨萃取次數(shù)的增加而提高 至 萃取 3 次后趨于平緩 持續(xù)增加萃取次數(shù) 蘿卜硫素提取 量幾乎沒有增加 說明萃取 3 次已達(dá)到蘿卜硫素最大提取 量 圖 5 綜合考慮萃取效率 能耗等因素 本研究最終選 擇重復(fù)萃取 3 次為最佳提取次數(shù) 圖 5 萃取次數(shù)對新鮮芝麻菜中蘿卜硫素提取量的影響 n 3 Fig 5 Effects of extraction times on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 2 線性范圍 檢出限和加標(biāo)回收率 配制質(zhì)量濃度為 10 500 ng mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 在優(yōu) 化的條件下考察方法的線性范圍 蘿卜硫素在 10 500 ng mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 r 2 0 999 線性方程為 Y 74 6251X 55 7259 在取樣量為 2 5 g 定容體積為 100 mL 下 以 3倍基線噪聲比測定新鮮芝麻菜樣品中蘿卜硫素的檢 出限為 4 0 g kg 定量限為 13 0 g kg 依據(jù)實(shí)驗時間段新鮮芝麻菜樣品平均本底值 100 g g 分別向同一批次的芝麻菜樣品中分別加入 50 100 200 g g 3 個不同水平的蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液 各平行處理 3 個樣品 新鮮芝麻菜中蘿卜硫素加標(biāo)回收率結(jié)果如表 1 在 50 100 200 g g 添加水平下的加標(biāo)回收率為 95 7 104 0 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 relative standard deviations RSDs 低于 1 000 滿足檢測的要求 2 3 實(shí)際樣品測定 應(yīng)用本方法對夏季不同生長周期的芝麻菜中蘿卜硫 素含量進(jìn)行分析 選用播種出苗第 5 12 19 及 27 d 4 個 生長時間段進(jìn)行采樣 其蘿卜硫素的含量如表 2 所示 隨 著芝麻菜的不斷生長 蘿卜硫素的含量逐漸升高 至出苗 第 19 d 達(dá)到最高 相比于出苗第 5 d 蘿卜硫素含量提升將 近 6 倍 隨著生長葉片的快速增大 蘿卜硫素的含量開始 2250 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報 第 13 卷 呈下降趨勢 與文獻(xiàn)報道基本一致 5 33 均在植物成熟期 含量有所降低 符合植物生長趨勢 表 1 加標(biāo)回收率實(shí)驗結(jié)果 n 3 Table 1 Results of standard addition recoveries experiment n 3 本底值 g g 加入量 g g 回收率 平均回收率 RSDs 100 50 104 104 0 0 458103 104 100 95 2 95 7 0 55095 7 96 3 200 98 2 97 3 0 89796 5 97 2 表 2 新鮮芝麻菜不同生長周期蘿卜硫素含量變化 n 3 Table 2 Changes of sulforaphane content in fresh Eruca sativa Mill at different growth cycles n 3 出苗第 5 d 出苗第 12 d 出苗第 19 d 出苗第 27 d 蘿卜硫素 g g 13 6 18 7 77 3 54 3 13 3 21 5 76 4 54 8 13 6 20 4 78 9 57 8 RSDs 1 28 6 98 1 63 3 40 3 結(jié)論與討論 本研究建立了新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的高效液相色 譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 主要針對新鮮芝麻菜前處理水解條件進(jìn) 行了優(yōu)化 確定 pH 6 磷酸緩沖溶液為水解體系 于 50 水浴下振蕩水解 2 h 經(jīng)二氯甲烷萃取 3 次后 此時蘿卜硫 素萃取效果最好 同時以 0 1 甲酸水溶液 乙腈為流動相 經(jīng) C 18 色譜柱 100 mm 2 1 mm 3 5 m 進(jìn)行分離 蘿卜硫 素在 10 500 ng mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 在 50 100 200 g g 添加水平的加標(biāo)回收率為 95 7 104 0 相對標(biāo) 準(zhǔn)偏差低于 1 0 應(yīng)用本方法對不同生長周期的新鮮芝麻 菜中蘿卜硫素進(jìn)行測定分析 其含量及變化趨勢與文獻(xiàn)報 道基本一致 本方法樣品前處理提取效率高且穩(wěn)定 重復(fù) 性及回收率好 適用于新鮮芝麻菜中蘿卜硫素的定性定量 分析 參考文獻(xiàn) 1 SULTAN K ZAKIR M KHAN H et al Biofunctional properties of Eruca sativa Miller rocket salad hydroalcoholic extract J Nat Prod Res 2016 30 10 1202 1204 2 BELL L METHVEN L WAGSTAFF C et al The influence of phytochemical composition and resulting sensory attributes on preference for salad rocket Eruca sativa accessions by consumers of varying TAS2R38 diplotype J Food Chem 2017 222 6 17 3 BELL L WAGSTAFF C 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