中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022 55 9 1781 1789 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2022 09 007 收稿日期 2021 11 06 接受日期 2021 12 10 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 32172650 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2021C02040 聯(lián)系方式 邵淑君 E mail ssjun 通信作者師愷 E mail kaishi 開(kāi)放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識(shí)碼 OSID 亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢抗性的作用及 機(jī)制 邵淑君 胡璋健 師愷 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 杭州 310058 摘要 背景 灰葡萄孢 Botrytis cinerea 引起的灰霉病是危害番茄 Solanum lycopersicum 的重要病害之一 防治 不及時(shí)可造成 30 40 減產(chǎn) 目前生產(chǎn)上多以化學(xué)防治為主 但存在農(nóng)產(chǎn)品安全及環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn) N ?；掖及?NAE 是植物體內(nèi)天然存在的一類(lèi)脂質(zhì)生物活性化合物 其在哺乳動(dòng)物中具有多種免疫功能 但其在植物免疫中的作用和機(jī)制尚不 清楚 目的 探討 N ?；掖及吩谡T導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢防御中的作用 為研發(fā)番茄灰霉病綠色防控技術(shù)提供依據(jù) 方法 將灰葡萄孢分別接種在含有硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亞油酸乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸乙醇胺 NAE 22 5 的培 養(yǎng)基上 觀察灰葡萄孢的生長(zhǎng)情況 在此基礎(chǔ)上 以番茄 Moneymaker 植株為材料 硬脂酰乙醇胺 亞油酸乙醇胺 廿二 碳五烯酸乙醇胺外源處理番茄葉片后接種灰葡萄孢 統(tǒng)計(jì)病情指數(shù) 測(cè)定熒光參數(shù) 采用 qRT PCR 技術(shù)明確亞油酸乙酰胺處 理后番茄葉片灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量 進(jìn)一步測(cè)定番茄葉片中主要抗病基因 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 PYR1a 等的相對(duì)表達(dá)量及茉莉酸 jasmonic acid JA 水楊酸 salicylic acid SA 乙烯 ethylene ETH 脫落酸 abscisic acid ABA 生長(zhǎng)素 indoleacetic acid IAA 含量 并以乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體植株 never ripe nr 及對(duì)照植株 Pearson PB 為材料 在外源亞油酸乙酰胺處理后接種灰葡萄孢 測(cè)定番茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)和灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量 結(jié)果 體外培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明灰葡萄孢生長(zhǎng)并不受外源 N 酰基乙醇胺的影響 外源施用 N ?；掖及纺茱@著提高番茄植 株對(duì)灰霉病的抗性 緩解由灰葡萄孢侵染導(dǎo)致的番茄葉片光系統(tǒng) II 實(shí)際光化學(xué)效率 PSII 的下降 3 種 N ?；掖及分?亞油酸乙醇胺施用后番茄葉片灰霉病病情指數(shù)下降最為明顯 灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量下調(diào) 60 其誘導(dǎo)灰霉病抗性效 果最佳 番茄植株接種灰葡萄孢后抗性基因 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 的表達(dá)水平均有不同程度上調(diào) 外源亞油酸乙醇 胺處理使得番茄響應(yīng)灰葡萄孢接種后 PI I Nr ACO1 的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng) 其中乙烯合成基因 ACO1 的表達(dá)水平最高 番茄植 株接種灰葡萄孢后葉片水楊酸 茉莉酸 生長(zhǎng)素和乙烯含量增加 但外源亞油酸乙醇胺處理并接種灰葡萄孢后只有乙烯含量 顯著增加 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) 番茄乙烯突變體 nr 植株中 外源亞油酸乙醇胺對(duì)灰葡萄孢的抗性誘導(dǎo)作用顯著受到抑制 結(jié) 論 外源施用亞油酸乙醇胺能夠提高番茄內(nèi)源光合效率和抗病基因的表達(dá)及內(nèi)源激素乙烯的含量 增強(qiáng)番茄植株對(duì)灰霉病的 抗性 推測(cè)其誘導(dǎo)抗性作用可能與乙烯信號(hào)路徑相關(guān) 關(guān)鍵詞 番茄 N 酰基乙醇胺 亞油酸乙醇胺 灰霉病 灰葡萄孢 乙烯 The Role and Mechanism of Linoleyl Ethanolamide in Plant Resistance Against Botrytis cinerea in Tomato SHAO ShuJun HU ZhangJian SHI Kai College of Agriculture and Biotechnology Zhejiang University Hangzhou 310058 1782 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 Abstract Background Gray mold caused by Botrytis cinerea is one of the important diseases of tomato and causes significant yield losses up to 30 40 Nowadays chemical pesticide is usually used in tomato production which is effective but increases the risk of food safety and results in environmental pollution N acylethanolamines NAEs are a kind of naturally lipid bioactive compounds in plants which have been identified to have a variety of immune functions in mammals however its function and the underlying mechanism in plant immunity are still unclear Objective The objective of this study is to investigate the effects of NAEs on tomato plant defense against B cinerea infection and to provide a basis for the development of green control technology of tomato gray mold Method The B cinerea was cultured in medium containing NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 respectively to evaluate their effects on B cinerea growth Tomato Moneymaker plants were infected by B cinerea with or without exogenous NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 and disease index and fluorescence parameters of tomato leaves were measured qRT PCR was used to analyze the relative gene expression of B cinerea Actin in tomato leaves that infected by B cinerea with or without NAE 18 2 treatment Transcript abundance of defense related genes e g PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 PYR1a and contents of plant hormones e g JA SA ETH ABA IAA were measured Fluorescence parameters of tomato leaves and the relative gene expression of B cinerea Actin were analyzed in ethylene insensitive mutant infected by B cinerea with NAE 18 2 Result The growth of B cinerea was not affected by exogenous NAEs treatment during in vitro culture Exogenous application of NAEs could significantly improve the resistance of tomato plants to B cinerea and alleviate the decrease of photosystem II photochemical efficiency PSII caused by B cinerea infection NAE 18 2 had the best effect on tomato plant defense against B cinerea among the NAEs which obviously reduced the disease index and the Actin transcript level of B cinerea by 60 The expression levels of PI I PR 1 NPR1 Nr and ACO1 could be induced by B cinerea infection but not by NAE 18 2 treament The expression levels of PI I Nr and ACO1 were up regulated when plants were pre treated by NAE 18 2 before B cinerea infection and the expression level of ACO1 was the highest Compared to the control the contents of SA JA IAA and ETH in the leaves were increased significantly after B cinerea infection while only the contents of ETH were further increased when pre treated by NAE 18 2 Moreover exogenous NAE 18 2 pre treatment could not improve the defense against B cinerea in the ETH insensitive mutant nr Conclusion Exogenous NAE18 2 treatment can increase leaf photosynthesis transcript abundance of defense related genes and the content of plant hormone ETH It induce the resistance of tomato plants to gray mold which may depend on the ETH signaling pathway Key words tomato N acylethanolamines NAE linoleyl ethanolamide NAE 18 2 gray mold Botrytis cinerea ethylene ETH 0 引言 研究意義 番茄 Solanum lycopersicum 是世 界性栽培蔬菜 作為模式作物 被廣泛用于生長(zhǎng)發(fā)育 果實(shí)品質(zhì) 逆境響應(yīng)等研究 1 番茄產(chǎn)量和品質(zhì)很大 程度上受栽培期間病蟲(chóng)害的影響 2 其中由灰葡萄孢 Botrytis cinerea 引起的灰霉病是番茄生產(chǎn)中的重要 病害 在我國(guó)各番茄種植地均有發(fā)生 感病后的番茄 產(chǎn)量會(huì)降低 30 40 N ?；掖及?NAE 作為 一種天然的活性物質(zhì) 深入研究其在誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉 病抗性中的作用及內(nèi)在機(jī)制 對(duì)于植物源生物農(nóng)藥的 開(kāi)發(fā)具有重要意義 前人研究進(jìn)展 20 世紀(jì) 50 年 代 人們最早在大豆卵磷脂和花生粕的成分中發(fā)現(xiàn)了 N 酰基乙醇胺 3 后續(xù)在其他植物中也發(fā)現(xiàn) N ?；?醇胺的存在 4 N 酰基乙醇胺是一類(lèi)功能多樣的脂類(lèi) 信號(hào)物質(zhì) 由一個(gè)酰胺鍵連接到乙醇胺的脂肪酸組成 根據(jù)其?；湹奶紨?shù) C12 C18 和不飽和雙鍵數(shù)目 0 3 進(jìn)行分類(lèi) 5 6 N ?；掖及菲毡榇嬖谟谥参?中 其種類(lèi)及含量因植株器官 植物種類(lèi)和生理?xiàng)l件 而異 長(zhǎng)鏈 N ?；掖及?C16 C18 是植物中主 要的 N ?；掖及奉?lèi)型 主要由亞油酰乙醇胺 NAE 18 2 NAE 18 1 和 NAE 16 0 組成 其中亞油酰 乙醇胺含量最多 在植株的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要 作用 5 7 8 N ?；掖及凡粌H參與種子萌發(fā) 9 11 幼 苗 生長(zhǎng) 12 花器官衰老 13 也可能參與植物細(xì)胞防御信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 8 1998 年 研究人員發(fā)現(xiàn)用真菌誘導(dǎo)子 木聚糖處理 會(huì)引起煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中 N ?；?醇胺含量積累 14 之后 N ?；掖及费芯恐械囊粋€(gè)重 大突破是成功在擬南芥植株中克隆到一種 N ?；?醇胺的水解酶 脂肪酸酰胺水解酶 FAAH 過(guò) 表達(dá) FAAH 擬南芥植株中的病害防御基因 激素合成 及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)量均低于野生型植株 降低了 對(duì)細(xì)菌性病原體的抗性 15 N ?；呓z氨酸內(nèi)酯 AHL 是革蘭氏陰性菌群信號(hào)感應(yīng)家族中的一員 是 N ?；掖及奉?lèi)似物 研究發(fā)現(xiàn) AHL 能夠增強(qiáng)植 株對(duì)生物與非生物逆境的抗性 16 其中 N 癸?；呓z 氨酸內(nèi)酯 DHL 作為 AHL 的一員 能夠誘導(dǎo)番茄 植株的免疫系統(tǒng)來(lái)保護(hù)植物免受灰葡萄孢的侵染 17 9 期 邵淑君等 亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢抗性的作用及機(jī)制 1783 本研究切入點(diǎn) 越來(lái)越多的研究證明環(huán)境友好型物 質(zhì) N ?；掖及吩谥仓晟L(zhǎng)發(fā)育及抗病性中發(fā)揮著 重要作用 但外源施用 N 酰基乙醇胺是否能夠有效提 高番茄植株對(duì)灰霉病的抗性及機(jī)制尚不清楚 擬解 決的關(guān)鍵問(wèn)題 通過(guò)對(duì)灰葡萄孢接種植株表型及光合 特性的測(cè)定 探究 N ?；掖及穼?duì)番茄灰霉病抗性的 影響 進(jìn)一步利用 qRT PCR 以及 HPLC 技術(shù)分析外 源施用亞油酰乙醇胺對(duì)番茄植株內(nèi)源抗病基因表達(dá) 激素含量的影響 并結(jié)合激素突變體植株外源施用亞 油酰乙醇胺對(duì)其灰霉病抗性的影響 探討亞油酰乙醇 胺提高灰霉病抗性的內(nèi)在機(jī)制 為番茄作物病害綠色 防控提供參考 1 材料與方法 試驗(yàn)于 2018 2020 年在浙江大學(xué)蔬菜研究所植 物生長(zhǎng)室及實(shí)驗(yàn)室完成 1 1 試驗(yàn)材料及 N 酰基乙醇胺處理 1 1 1 試驗(yàn)材料 供試番茄材料為野生型植株 Moneymaker 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體植株 never ripe nr 及野生型植株 Pearson PB 利用這 3 種番茄材料 分別開(kāi)展兩組試驗(yàn) 第 1 組利用不同 N ?；掖及诽?理野生型植株 Moneymaker 后接種灰葡萄孢 第 2 組 用亞油酰乙醇胺處理 nr 和 PB 植株后接種灰葡萄孢 以上 3 種番茄材料均在種子溫湯浸種后 播種在含有 基質(zhì) 草炭 蛭石和珍珠巖比例為 6 3 1 的栽培 缽中 并置于浙江大學(xué)蔬菜研究所植物生長(zhǎng)室中生長(zhǎng) 其生長(zhǎng)條件為晝夜溫度 24 21 相對(duì)濕度 70 80 光周期 12 h 12 h 平均光強(qiáng) 600 mol m 2 s 1 1 1 2 N ?；掖及诽幚?硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亞油酰乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸 乙醇胺 NAE 22 5 均購(gòu)自 SIGMA 公司 原藥在配 置過(guò)程中直接用 ddH 2 O 稀釋至 80 mol L 1 待番茄長(zhǎng) 至五葉一心時(shí) 選取大小 長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行 N ?；掖及啡陣娛┨幚?處理組分別用上述 3 種 N ?；掖及?80 mol L 1 噴施兩次 間隔 24 h 對(duì) 照組用 ddH 2 O 處理 不同 N ?；掖及?ddH 2 O 處 理 48 h 后接種濃度為 2 10 5 孢子 mL 灰葡萄孢 接種 采用噴施法 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 灰葡萄孢孢子培養(yǎng)及接種 灰葡萄孢培養(yǎng)用 V8培養(yǎng)基 36 V8果汁 Campbell Soup Co Camden NJ USA 0 2 g L 1 CaCO 3 15 g L 1 瓊脂 PDA 培養(yǎng)基 4 g L 1 馬鈴薯淀粉 20 g L 1 葡萄糖 15 g L 1 瓊脂 和對(duì)照培養(yǎng)基 ddH 2 O 15 g L 1 瓊脂 在 25 避光條件下培養(yǎng) 15 d 左右 待培養(yǎng)皿內(nèi)長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲后 將菌絲塊放入重懸液 2 胰蛋白胨 4 麥芽糖 分 離過(guò)濾得到孢子 并稀釋濃度至 2 10 5 孢子 mL 18 將孢子懸浮液均勻噴施在整株葉片上 以噴施重懸液 作為空白對(duì)照 接種后的番茄植株置于相對(duì)濕度 100 光周期 12 h 12 h 光強(qiáng) 600 mol m 2 s 1 溫度 25 的環(huán)境下 3 4 d 后觀察發(fā)病情況 1 2 2 番茄植株病情調(diào)查方法 番茄葉片接種灰葡 萄孢 3 d 后 觀察不同處理下番茄植株灰霉病的病情 病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照蔡銀杰等 19 的方法 根據(jù)病斑面積 占葉面積百分比分為 5 級(jí) 0 級(jí) 0 1 級(jí) 0 1 10 2 級(jí) 10 1 30 3 級(jí) 30 1 70 4 級(jí) 70 病情指數(shù)計(jì)算公式 病情指數(shù) 各級(jí)葉數(shù) 該級(jí) 指數(shù) 調(diào)查總?cè)~數(shù) 最高級(jí)別數(shù) 100 1 2 3 葉綠素?zé)晒獬上穹治?葉綠素?zé)晒馐褂?Imaging PAM調(diào)制熒光成像系統(tǒng) IMAG MAXI Heinz Walz Germany 進(jìn)行測(cè)定 植株暗適應(yīng) 20 min 后 光化光強(qiáng)度和飽和光強(qiáng)度分別設(shè)為 280 和 4 000 mol m 2 s 1 光系統(tǒng) 實(shí)際光化學(xué)效率計(jì)算公式為 PSII Fm F Fm 20 1 2 4 植物葉片總 RNA 提取和 qRT PCR 檢測(cè) 使用 RNA 提取試劑盒 Tiangen China 提取接種灰葡萄 孢后 24 h 的葉片總 RNA 使用 Fermentas RevertAid TM first Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA 第一鏈 使 用 iCycler iQ Multicolor 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)系統(tǒng)儀器 LightCycler 480 II SwissConfederation 完成 qRT PCR 參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作 PCR 反應(yīng)體系 10 L iQ TM SYBR Green Supermix 2 L cDNA 0 4 L 前 后引物 10 mol L 1 7 2 L ddH 2 O PCR 反應(yīng)程序 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 15 s 58 退火 45 s 40 個(gè)循環(huán) 使用 Primer 5 0 根據(jù) SGN 上的番茄基因序列設(shè)計(jì)引物 表 1 數(shù)據(jù)采用 2 CT 法進(jìn)行分析 21 1 2 5 植物內(nèi)源激素含量測(cè)定 茉莉酸 jasmonic acid JA 水楊酸 salicylic acid SA 脫落酸 abscisic acid ABA 和生長(zhǎng)素 indoleacetic acid IAA 定量 測(cè)定參照 WU 等 22 的方法 采用液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)系 統(tǒng)進(jìn)行分析 Agilent 6460 Agilent Technologies USA 在葉片提取過(guò)程中 樣品加入 D5 JA D4 SA D6 ABA 和 D6 IAA OlChemlm Czechia 作為內(nèi)參 乙烯 ethylene ETH 含量測(cè)定方法 每個(gè)處理 取 4棵長(zhǎng)勢(shì)一致植株的葉片密封在 1 L橡膠平頂燒瓶中 1784 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 表 1 qRT PCR 特異性引物 Table 1 Specific primers designed for qRT PCR 基因 Gene 前引物 Forward primer 5 3 后引物 Reverse primer 5 3 Actin TGGTCGGAATGGGACAGAAG CTCAGTCAGGAGAACAGGGT B c Actin ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCA AATGTTACCATACAAATCCTTACGGA PI I GAAGTAATTAAGCAGCCACAATATG GCCCCCCTTATTTTTTCC PR 1 ATCTCATTGTTACTCACTTGTC AACGAGCCCGACCA NPR1 GGGAAAGATAGCAGCACG GTCCACACAAACACACACATC PYR1a GAGAACACCGGTTGAGGAAT TGTGACTCGCATCACGACTA Nr TTTGCGTGTCCAGGTTAGAG GGAGGCATAGGTAGCAGAGG ETR2 CTAGTGCATCTAGGGTGCGA TCCATCCATTCCAACTCTCA ACO1 GCGCCACTCTATTGTGGTTA TGCATCACTTCCTGGATTGT 室溫放置 1 h后用注射器從每個(gè)燒瓶中抽取出 1 mL頂部 氣體 使用配備 1 5 m 4 mm 的氧化鋁玻璃柱的氣相 色譜儀 Philips UNICAM pro GC 測(cè)定 進(jìn)樣器 檢測(cè)器和過(guò)柱溫度分別設(shè)定為 130 130 和 200 1 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)結(jié)果均為 3 次重復(fù)的平均值 利用 Microsoft Excel 2016 整理數(shù)據(jù) 運(yùn)用 SAS 9 1 Tukey 法進(jìn)行差異 顯著性分析 運(yùn)用 Origin 2018 進(jìn)行圖形繪制 2 結(jié)果 2 1 N ?；掖及穼?duì)體外培養(yǎng)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的 影響 將相同大小的灰葡萄孢菌絲塊分別接種在含有 80 mol L 1 硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亞油酰乙醇 胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸乙醇胺 NAE 22 5 的 V8 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基上 于 25 避光培養(yǎng) 15 d 結(jié)果表明 在避光條件下培養(yǎng) 9 d 添 加 3 種 N ?；掖及凡⑽磳?duì) V8 培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基 上的灰葡萄孢生長(zhǎng)有明顯的影響 在 V8 培養(yǎng)基上培 養(yǎng)的菌落緊致均一 而在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落整 體表現(xiàn)疏松 分塊不均一 圖 1 因此 N ?；?醇胺本身并不影響灰葡萄孢的生長(zhǎng) 且 V8 培養(yǎng)基最 適宜灰葡萄孢生長(zhǎng) 2 2 外源施用 N ?；掖及穼?duì)番茄灰霉病抗性的影響 為了探究 N 酰基乙醇胺在誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病抗 性中的作用 進(jìn)行了 N ?；掖及奉A(yù)處理番茄植株葉 V8培養(yǎng)基 V8 medium PDA培養(yǎng)基 PDA medium 對(duì)照培養(yǎng)基 CK medium ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 圖 1 外源 N ?；掖及诽幚韺?duì)體外培養(yǎng)中灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的影響 Fig 1 Effects of N acylethanolamines treatment on in vitro B cinerea hyphal growth 9 期 邵淑君等 亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢抗性的作用及機(jī)制 1785 片后接種病原菌試驗(yàn) 一般情況下 植株遭到病原 菌侵染會(huì)對(duì)其光合系統(tǒng)造成不可逆的損害 因此通 過(guò)測(cè)定葉片 PSII 來(lái)評(píng)估病害的嚴(yán)重程度 23 由圖 2 可以看出 接種灰葡萄孢的葉片 PSII 值降低 而外 源施用 N 酰基乙醇胺能夠明顯緩解因病原菌侵染導(dǎo) 致的 PSII 下降 這與灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量 一致 同時(shí)外源施用 N ?；掖及泛?植株病情指 數(shù)降低至 1 2 3 因此 在硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亞油酰乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯 酸乙醇胺 NAE 22 5 處理下 番茄植株對(duì)灰霉病 的抗性增強(qiáng) 尤以亞油酰乙醇胺處理對(duì)番茄灰霉病 的抗性最強(qiáng) 灰葡萄孢 B cinerea ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 Mock 0 1 0 20 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 B C 0 0 5 1 0 1 5 ddH 2 O NAE 18 2 0 0 2 0 4 0 6 灰葡萄孢 B cinereaMock ddH 2 O NAE 22 5 A ddH2O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 d a c a b a c a b a b a 0 2 4 6 D NAE 18 0 b NAE 18 2 c A 番茄葉片光系統(tǒng) II 實(shí)際光化學(xué)效率 Photosystem II photochemical efficiency PSII B 番茄葉片灰葡萄孢 Actin 表達(dá)量 B cinerea Actin relative expression of tomato leaves C 病情指數(shù) Disease index D PSII 成像圖 Imaging of PSII 圖 2 外源施用 N 酰基乙醇胺對(duì)番茄灰霉病抗性的影響 Fig 2 Effects of exogenous N acylethanolamines on defense to tomato gray mold 2 3 外源施用亞油酰乙醇胺對(duì)番茄葉片中抗性相關(guān) 基因表達(dá)及激素含量的影響 為了探究亞油酰乙醇胺誘導(dǎo)的抗病性是否與內(nèi) 源激素信號(hào)路徑有關(guān) 檢測(cè)了接種灰葡萄孢 24 h 后 番茄植株中主要抗病信號(hào)路徑茉莉酸信號(hào)相關(guān)基因 PI I 水楊酸信號(hào)相關(guān)基因 PR 1 和 NPR1 脫落酸信 號(hào)路徑相關(guān)基因 PYR1a 乙烯信號(hào)路徑相關(guān)基因 Nr 和 ACO1 的表達(dá)量 結(jié)果表明 植株接種灰葡萄孢 24 h 后 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 相對(duì)表達(dá)量表 現(xiàn)不同程度上調(diào) 但在外源亞油酰乙醇胺處理后接種 灰葡萄孢的番茄植株中 PR 1 NPR1 的表達(dá)量與對(duì)照 組相比無(wú)顯著差異 而 PI I Nr 和 ACO1 的表達(dá)量則 有所增強(qiáng) 尤以乙烯合成基因 ACO1 的表達(dá)量增幅最 大 圖 3 A 接種灰葡萄孢 36 h后番茄植株葉片中激素含量測(cè) 定結(jié)果表明 茉莉酸 水楊酸和生長(zhǎng)素的含量均顯著 上升 但在亞油酰乙醇胺處理下茉莉酸 水楊酸 生 長(zhǎng)素的含量反而受到不同程度的抑制 脫落酸含量無(wú) 顯著變化 乙烯含量顯著增加 圖 3 B 3 C 2 4 亞油酸乙醇胺對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體番茄灰霉 病抗性的影響 鑒于亞油酸乙醇胺能提高乙烯途徑基因 ACO1 的 轉(zhuǎn)錄表達(dá)和乙烯含量 進(jìn)一步利用亞油酸乙醇胺預(yù)處 理乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變株 nr 及野生型植株 PB 后接種灰 葡萄孢 接種 24 h 后對(duì)其表型進(jìn)行分析 結(jié)果表明 野生型植株 PB 葉片的發(fā)病情況得到了有效緩解 PSII 值顯著提高 灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量降低 了 60 而突變體 nr 植株葉片的發(fā)病情況與對(duì)照無(wú)明 1786 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 A 0 8 16 24 400 800 1200 相對(duì)表達(dá)量 R e la ti ve t r an s c ri pt ab un d a nc e a b c d bbba a b c aaaa a a b a b c c a a b b b d P I I PR 1 NP R1 PY R 1 a Nr ET R 2 ACO 1 ddH 2 O Mock ddH 2 O B cinerea NAE 18 2 Mock NAE 18 2 B cinerea d b c a 0 5 10 15 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 乙烯含量 ETH co nten t un i t nL g 1 FW h 1 B b c a b 0 5 10 15 20 生長(zhǎng)素含量 I A A content unit ng g 1 FW c d a b 20 40 60 茉莉酸含量 J A cont ent u nit ng g 1 FW a a a a 200 400 600 800 bc c a b 20 40 60 水楊酸含量 SA con t ent uni t n g g 1 FW 0 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 脫落酸含量 A B A cont ent u nit ng g 1 FW ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea C 圖 3 外源施用亞油酸乙醇胺對(duì)番茄葉片中抗病基因表達(dá) A 和內(nèi)源激素含量 B C 的影響 Fig 3 Effects of exogenous NAE 18 2 on the transcript abundance of defense related genes A and the endogenous hormone content B C under B cinerea infection in tomato plants 顯差異 PSII 值及灰葡萄孢 Actin 的相對(duì)表達(dá)量均無(wú) 明顯變化 圖 4 表明亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)的抗病性 依賴(lài)于乙烯信號(hào)通路 3 討論 3 1 N ?；掖及穼?duì)植株的抗性誘導(dǎo)作用 N ?；掖及返墓δ芤约按x在動(dòng)物中已有大量 的研究 研究最為廣泛的 N 花生四烯乙醇胺 NAE 20 4 能夠與受體結(jié)合 觸發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件 從而調(diào)節(jié)動(dòng)物的痛覺(jué) 能量平衡 恐懼 食欲 記憶 等多種生理和行為過(guò)程 24 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) 這些脂 肪酸酰胺也是植物體的內(nèi)源成分 其積累和代謝在植 株生長(zhǎng)發(fā)育及免疫等方面發(fā)揮著重要的作用 例如 當(dāng)煙草葉片受到真菌激發(fā)子刺激時(shí) N ?；掖及返?水平上升 10 50 倍 暗示其可能在植株免疫中發(fā)揮一 定的調(diào)控作用 15 植物中 N ?；掖及纺軌騾⑴c種子 萌發(fā) 葉綠體發(fā)育等生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控 25 26 但對(duì)病原菌 的響應(yīng)及調(diào)控機(jī)制尚不清楚 本研究發(fā)現(xiàn) 3 種 N 酰 基乙醇胺均能提高番茄植株對(duì)灰霉病的抗性 其中亞油 酸乙醇胺的抗性誘導(dǎo)效果最好 亞油酸乙醇胺處理下 的番茄接種灰葡萄孢后 其灰葡萄孢的生長(zhǎng)量與對(duì)照 組 ddH 2 O 處理相比下降了 60 圖 2 目前生產(chǎn)上 防治灰霉病主要依靠化學(xué)藥劑 已陸續(xù)檢測(cè)到番茄灰 霉病對(duì)腐霉利等藥劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性 防治效 9 期 邵淑君等 亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢抗性的作用及機(jī)制 1787 C PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 1 0 20 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 d ab c a e b e b 0 0 1 0 2 0 3 0 4 a b a c 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 PB nr PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 灰葡萄孢 B cinerea NAE 18 2 B cinerea 光系統(tǒng) II 實(shí)際光化學(xué)效率 PS I I 相對(duì)表達(dá)量 Relati ve trans c ri pt ab und ance AB A 番茄葉片光系統(tǒng) II 實(shí)際光化學(xué)效率 Photosystem II photochemical efficiency PSII B 番茄葉片灰葡萄孢 Actin 表達(dá)量 B cinerea Actin relative expression of tomato leaves C 番茄葉片 PSII 成像圖 Imaging of PSII 圖 4 外源施用亞油酸乙醇胺對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體番茄灰霉病抗性的影響 Fig 4 Effects of exogenous NAE 18 2 on nr tomato plant defense to gray mold 果顯著下降 27 因此 尋找化學(xué)合成農(nóng)藥的新替代 品已經(jīng)成為科學(xué)研究的一個(gè)重要方向 本研究發(fā)現(xiàn) 亞油酸乙醇胺對(duì)番茄灰霉病誘導(dǎo)抗性效果最佳 其 類(lèi)似物 DHL 已被證實(shí)能夠誘導(dǎo)番茄植株的系統(tǒng)抗 性來(lái)保護(hù)植物免受灰葡萄孢的侵染 17 這些活性物 質(zhì)的發(fā)現(xiàn)以及未來(lái)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用將有助于病害的綠色 防控 3 2 N 酰基乙醇胺誘導(dǎo)植株抗性與激素途徑的關(guān)系 植物免疫調(diào)控離不開(kāi)植物激素 灰葡萄孢的侵染 提高了植物體內(nèi)乙烯 茉莉酸 水楊酸 脫落酸含量 保持激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在平衡是植株免疫的關(guān)鍵 28 本研究中 番茄植株受灰葡萄孢侵染后 其乙烯 茉 莉酸 水楊酸含量均有一定程度提高 與前人研究結(jié) 果一致 但在亞油酸乙醇胺處理下 番茄葉片中乙烯 含量顯著升高 茉莉酸 水楊酸 生長(zhǎng)素的含量反而 受到了不同程度的抑制 而脫落酸含量無(wú)顯著差異 圖 3 有研究報(bào)道 植株提高對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌抗性 主要依賴(lài)于茉莉酸和乙烯信號(hào)路徑 29 30 水楊酸和脫 落酸在植物對(duì)灰霉病的抗性中作用復(fù)雜 其可能和植 物的種類(lèi) 灰葡萄孢侵染的階段 受侵染的組織等相 關(guān) 31 大量研究已證明 乙烯合成途徑關(guān)鍵酶 ACO 基因表達(dá)量提高是乙烯產(chǎn)生增加的重要指標(biāo) 32 33 植株遭受病原菌侵染后 乙烯合成途徑被激活 產(chǎn)生 大量乙烯 34 35 隨著乙烯水平的上升 下游抗性相關(guān) 基因的表達(dá)也增強(qiáng) 36 37 本研究中番茄植株在外源施 用亞油酸乙醇胺并接種病原菌后 乙烯信號(hào)路徑相關(guān) 基因 ACO1 大量表達(dá) 圖 3 A 與已經(jīng)報(bào)道的免疫 反應(yīng)模式一致 已有研究表明擬南芥乙烯不敏感 ein2 ein3 和乙烯受體 etr1 突變體因改變了乙 烯信號(hào)而導(dǎo)致其對(duì)灰葡萄孢的敏感性 過(guò)表達(dá) ERF1 則增強(qiáng)了擬南芥植株對(duì)灰葡萄孢的抗性 38 番茄蛋白 激酶 TPK1b 介導(dǎo)了乙烯信號(hào)路徑參與的防御作用 39 這些結(jié)果均表明 乙烯信號(hào)通路在植株對(duì)灰霉病的防 御中發(fā)揮著重要作用 本研究發(fā)現(xiàn) 在番茄乙烯信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體植株 nr 上外源施用亞油酸乙醇胺后再接 種病原菌 削弱了亞油酸乙醇胺對(duì)灰葡萄孢的抗性作 用 圖 4 推測(cè)亞油酸乙醇胺誘導(dǎo)的抗病性依賴(lài)于 乙烯信號(hào)通路 研究表明 乙烯和茉莉酸信號(hào)通路在灰霉病抗性 中具有協(xié)同作用 乙烯和茉莉酸信號(hào)通路是相互關(guān)聯(lián) 1788 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 的 茉莉酸甲酯 MeJA 能夠誘導(dǎo) ACO 的表達(dá) 導(dǎo) 致乙烯生成增加 28 本試驗(yàn)中番茄植株在外源施用亞 油酸乙醇胺后接種灰葡萄孢 葉片中乙烯含量顯著增 加 茉莉酸含量反而受到了一定程度的抑制 但較未 接種灰葡萄孢的對(duì)照組相比 乙烯 茉莉酸含量均顯 著升高 且茉莉酸信號(hào)通路基因 PI I 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào) 圖 3 可能也是乙烯 茉莉酸協(xié)同防御的一種表現(xiàn) 因此 在未來(lái)的研究中 還需要對(duì)茉莉酸信號(hào)通路及 兩者的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開(kāi)進(jìn)一步研究 4 結(jié)論 外源施用亞油酸乙醇胺能夠顯著提高番茄光合作 用和抗病基因的表達(dá)及內(nèi)源激素乙烯的含量 有效誘 導(dǎo)番茄植株對(duì)灰霉病的抗性 參考文獻(xiàn) References 1 PANTHEE D R CHEN F Genomics of fungal disease resistance in tomato Current Genomics 2010 11 1 30 39 2 SINGH V K SINGH A K KUMAR A Disease management of tomato through PGPB Curre