DOI 10 19675 ki 1006 687x 2020 08050 收稿日期 Received 2020 08 31 接受日期 Accepted 2020 10 10 國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系毛木耳和藥用菌栽培崗位 CARS 20 和四川食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 SCCXTD 2020 07 資助 Supported by the Projects of China Agriculture Research System CARS 20 and Mushroom Innovation Team of Sichuan SCCXTD 2020 07 通信作者 Corresponding author E mail kerrylee tw 毛 木 耳代 料 栽 培 適 宜 碳 氮 比 及 菌 棒 中 固 碳 固 氮 細(xì) 菌 群 落 結(jié) 構(gòu) 葉 雷 1 2 譚 偉 1 2 張偉偉 3 戴懷斌 3 張 波 1 2 李小林 1 2 1 四川省食用菌研究所 成都 610066 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站 成都 610066 3 什邡市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 什邡 618400 摘 要 為解析毛木耳代料栽培基質(zhì)碳氮比 C N 組 成 對其生育的影響以及在最 適 C N的菌棒 菌絲和基料混合物 中參與卡爾文循環(huán)的固碳基因和固氮基因多樣性 以毛木耳 上海1號 為 供 試 菌 株 設(shè) 計(jì) 5個不同C N基 質(zhì) 在 同 一 條 件下進(jìn)行出耳試驗(yàn) 測定相關(guān)農(nóng)藝性狀指標(biāo)并采用高通量測序技術(shù)分析最佳C N處理組菌棒中固碳和固氮基因多樣 性 結(jié) 果 顯 示 1 在 C N約60 1時生長最佳 菌絲長速最快 為4 43 mm d 發(fā)菌期料袋污染率最低 為4 27 菌 絲 長勢好 第一潮鮮耳單簇表面積達(dá)3 624 09 cm 2 簇 干耳邊緣厚達(dá)0 71 mm 單 袋 干 耳 單 產(chǎn) 達(dá) 164 79 g 袋 轉(zhuǎn) 化 率 達(dá) 14 98 生長情況其次C N 45 1和75 1 2 菌 絲 滿 袋 期 C N 60 1時菌棒含cbbL固碳基因主要分布在Proteobacteria 和Actinobacteria 相 對 豐 度 分 別 為 90 8 和0 2 且 以 Proteobacteria為 主 主 要 歸 屬 于 Cupriavidus 41 7 Rubrivivax 33 6 Methylococcus 6 5 而 含 cbbM基因的固碳細(xì)菌未檢測出 3 norB固氮基因主要分布 在Firmicutes 3 2 和 Proteobacteria 0 4 主 要 優(yōu) 勢 菌 屬 為 Geobacillus 2 1 Macrococcus 0 9 Pseudomonas 0 2 Staphylococcus 0 1 和 Bacillus 0 1 等 本研究篩選獲得了毛木耳代料栽培較佳基質(zhì) C N為60 1 并解析了菌絲滿袋期參與固碳和固氮基因細(xì)菌群落 為實(shí)現(xiàn)毛木耳精準(zhǔn)化栽培和研究參與基質(zhì)碳 氮素物 質(zhì)轉(zhuǎn)化功能微生物菌群奠定了基礎(chǔ) 圖5 表5 參38 關(guān)鍵 詞 碳氮比 毛木耳 代料栽培 農(nóng)藝性狀 cbbL基因 norB基因 The suitable carbon nitrogen ratio on Auricularia cornea substitute cultivation and the community structure of carbon and nitrogen assimilating bacteria YE Lei 1 2 TAN Wei 1 2 ZHANG Weiwei 3 DAI Huaibin 3 ZHANG Bo 1 2 the surface areas reached up to 3 624 09 cm 2 tuft the fresh fruiting body of the first harvested ones and edge thickness of 0 71 mm the dry fruiting body of the first harvested ones a yield of 164 79 g bag weight of dry fruiting bodies harvested three times from one bag and a converted efficiency of 14 98 2 The cbbM gene was not detected in C3 samples whereas the cbbL gene was found The cbbL containing genetic communities were dominated by Proteobacteria and Actinobacteria with relative abundances of 90 8 and 0 2 respectively of which Proteobacteria were more dominant attributable mainly to Cupriavidus 41 7 Rubivivax 33 6 葉雷 譚偉 張偉偉 戴懷斌 張波 李小林 毛木耳代料栽培適宜碳氮比及菌棒中固碳 固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) J 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào) 2022 28 1 97 103 Ye L Tan W Zhang WW Dai HB Zhang B Li XL The suitable carbon nitrogen ratio on Auricularia cornea substitute cultivation and the community structure of carbon and nitrogen assimilating bacteria J Chin J Appl Environ Biol 2022 28 1 97 103葉 雷 等 28 卷 第1 期 2022 年2 月 98 毛木耳Auricularia cornea Ehrenb 是木耳屬Auricularia 的一種好氧性異養(yǎng)木腐真菌 包括黃背毛木耳和白背毛木 耳 1 2 據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì) 2018年全國毛木耳產(chǎn)量 1 898 483 23 t 其中四川省毛木耳產(chǎn)量最高 為971 285 t 占 全國毛木耳總量的51 16 3 碳氮比是指栽培料中總碳 C 與總氮 N 的 含 量 比 一 般 用 C N 表示 4 鄭林用等介紹 了食用菌C N計(jì)算方法 5 劉佳寧等介紹了代料栽培黑木耳的 C N計(jì)算方法 6 目前我國毛木耳生產(chǎn)均采用熟料袋栽 栽培 配方多以木屑 玉米芯 高粱殼 棉籽殼和甘蔗渣等為碳源 麥麩 豆粕 蠶沙和玉米粉等為氮源 并輔以石膏和石灰等以 調(diào)節(jié)pH和提供微量元素配制而成 1 且 多元 化 的 栽 培 配 方 的 獲得是配方各組分C N組 成 相 協(xié) 調(diào) 的 結(jié) 果 然 而 關(guān) 于 栽 培 基 質(zhì) C N組成對毛木耳生育的影響研究卻鮮見報(bào)道 在毛木耳菌棒 菌絲和基料的混合物 中異養(yǎng)真菌以木 耳屬為絕對優(yōu)勢 分解消耗栽培料的各種碳水化合物 此外 菌棒中還廣泛分布著各種細(xì)菌 7 它們的營養(yǎng)生活可能影響 著毛木耳菌絲的生長 8 其中碳素和氮素是最重要的 卡爾 文循環(huán)是光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型細(xì)菌固定碳的重要途徑 其中核酮糖 1 5 二磷酸羧化 加氧酶 即 RubisCO酶 是該過 程關(guān)鍵酶 催化CO 2 的固定 9 該 酶 分 為 I型RubisCO和II型 RubisCO 分別對應(yīng)功能基因cbbL和cbbM 一氧化氮還原酶 基 因 norB 是控制地球生態(tài)系統(tǒng)氮素生物轉(zhuǎn)化途徑重要過程 的酶編碼基因之一 10 起 反 硝 化 作 用 主 要 參 與 NO轉(zhuǎn)化為N 2 O 過程 可用cbbL cbbM和norB作 為 標(biāo) 記 基 因 對 其 保 守 區(qū) 序 列進(jìn)行擴(kuò)增 比對和后續(xù)分析等 來檢測環(huán)境中固碳和固氮微 生物群落 11 12 本 研 究 以 闊 葉 樹 木 屑 和 玉 米 芯 為 碳 源 麥 麩 為 氮 源 研 究 栽 培 基 質(zhì) C N對毛木耳生長的影響 測定相關(guān)農(nóng)藝 性 狀 指 標(biāo) 并 采 用 高 通 量 測 序 技 術(shù) 分 析 最 佳 C N處理組菌棒中 固碳和固氮基因多樣性 以期獲得毛木耳代料栽培基質(zhì)適宜 C N 并為揭示參與菌棒碳 氮素循環(huán)的微生物奠定研究基礎(chǔ) 1 材 料 與 方法 1 1 供 試 菌 株與 材 料 1 1 1 供 試 菌 株 毛 木 耳 上海 1號 菌 株 來 源 于 四 川 省 食 用菌研究所菌種保藏中心 1 1 2 主 要 材 料 栽培種配方 質(zhì)量比 棉籽殼50份 米 糠20份 玉 米 芯 15份 木 屑 15份 石 灰 3份 玉 米 粉 3份 石 膏 1 份 白 糖 1份 試 驗(yàn) 基 礎(chǔ) 配 方 質(zhì) 量 比 木 屑 50份 玉 米 芯 50 份 石 灰 4份 石 膏 1份 并在此配方上添加不同質(zhì)量的麥麩以 形成系列試驗(yàn)處理 Power Soil DNA Isolation Kit MoBio USA 擴(kuò) 增聚合酶Q5 High Fidelity DNA Polymerase NEB M0 491L 熒 光 定 量 染 料 Quant iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P7589 瓊 脂 糖 凝 膠 試 劑 Agarose Invitrogen 75510 019 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 緩 沖 液 TAE Invitrogen AM9870 NanoDrop 2000分光光度計(jì) Thermo Scientific公 司 電 泳 儀 DYY 6C型 北 京六 一 儀器 廠 Illumina MiSeq PE250 1 2 試 驗(yàn) 方法 1 2 1 試驗(yàn)時間 與 地點(diǎn) 毛木耳栽培試驗(yàn)于2018年1月 8月 在四川省德陽市什邡市湔氐鎮(zhèn)桐林村毛木耳生產(chǎn)基地進(jìn)行 9 月在上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行基質(zhì)固氮和固碳 基因的細(xì)菌群落測定 1 2 2 栽 培 基質(zhì)C N 設(shè) 計(jì)與 樣 品 采 集 根據(jù)栽培原料組分 C N組成情況 在以木屑和玉米芯為碳源 麥麩為氮源 石膏 和石灰調(diào)節(jié)pH和 提 供 無 機(jī) 鹽 的 試 驗(yàn) 基 礎(chǔ) 配 方 質(zhì) 量 比 上 以麥麩添加量為單一變量 調(diào)節(jié)基質(zhì)C N組成 設(shè)計(jì)成不同 C N處理共5個 即 90 1 C1 75 1 C2 60 1 C3 45 1 C4 和 30 1 C5 各 處 理 3次重復(fù) 100袋 重復(fù) 高通量測定樣品采集 各處理組菌絲滿袋時的菌棒 在超 凈工作臺上按照無菌操作流程進(jìn)行采樣 各處理隨機(jī)選取5個 菌棒 取菌棒內(nèi)部菌絲體和基質(zhì)的混合物混勻成1個 樣 品 每 組3次重復(fù) 采樣后立即放置在液氮中30 s 然 后 迅 速 放 在 80 超低溫保藏箱中備用 1 2 3 栽 培 方 法 采用袋式熟料栽培蔭棚出耳模式 栽培袋 規(guī) 格 折 徑 長度 厚度 20 cm 48 cm 0 003 cm 為 透 明 聚乙烯料袋 按照毛木耳代料生產(chǎn)常規(guī)方法進(jìn)行拌料 裝袋 滅菌 接種 發(fā)菌和出耳管理等 13 控制栽培基質(zhì)含水量60 菌 棒 松 緊 度 菌 種菌 齡 接 種 時 間 接 種 量 750 mL玻璃瓶固 體菌種均勻接種8袋栽培袋 發(fā)菌環(huán)境和出耳環(huán)境等一致 1 2 4 觀測記載項(xiàng) 目 及方法 總 碳 測 定 重 鉻 酸 鉀 硫 酸 氧化法 14 總 氮 測 定 依 照 標(biāo) 準(zhǔn) NY T 2419 2013 15 菌絲生 長 速 度 轉(zhuǎn) 化 率 測 定 按 張 金 霞等 介 紹 的 方 法 4 進(jìn)行 污染率計(jì) 算 菌袋接種培養(yǎng)雜菌污染袋數(shù)占制袋接種總數(shù)的比例 耳片 感病率計(jì)算 在一定期間內(nèi)一定耳片中某病害發(fā)生的病例出現(xiàn) 的頻率 耳片大小測定方法 采用 排水法 來間接地測定耳 片腹面和背面的表面積 以此來衡量耳片的大小 第 一 步 隨 機(jī)代表性抽取鮮耳片 將耳片切成長寬4 cm 4 cm的方塊10 片 腹面和背面的表面積32 cm 2 片 分 10次 每 次 1片 逐片放 入量筒之中 并借助移液管測定每次排水體積 依據(jù)這10個排 水體積數(shù)量 方塊耳片數(shù)及其表面積制作出方塊耳片表面積 和排水量相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 第二步 通過排水法測定各處理耳 簇的排水體積 取每個處理的6個 重 復(fù) 12簇耳 中的單簇耳 用于排水體積測定 第三步 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和各處理單簇耳排 水體積計(jì)算該處理下各簇耳的表面積 數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總 差異顯著性分析采用 SPSS軟件進(jìn)行 P 0 05 1 2 5 DNA提取 PCR擴(kuò)增和MISeq測序 采用土壤 DNA提取試 劑盒 Power Soil DNA Isolation Kit MoBio USA 提取總 DNA 用 0 8 瓊脂糖凝膠和NanoDrop and Methylococcus 6 5 3 norB containing genetic communities were dominated by Firmicutes 3 2 and Proteobacteria 0 4 mainly including Geobacillus 2 1 Macrococcus 0 9 Pseudomonas 0 2 Staphylococcus 0 1 and Bacillus 0 1 In this study we obtained the best C N that is 60 1 for the substitute cultivation of A cornea The bacterial community that participates in carbon nitrogen assimilation was analyzed for the first time when the bag was full of hyphae and thus laying a foundation for accurate cultivation and research on the functional microbial flora involved in the conversion of carbon nitrogen in the A cornea substrate Keywords carbon nitrogen ratio Auricularia cornea substitute cultivation agronomic character cbbL gene norB gene毛 木 耳 代 料 栽 培 適 宜碳 氮 比及 菌棒中 固碳 固氮 細(xì) 菌群 落 結(jié) 構(gòu) 99 Vol 28 No 1 Feb 2022 超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA檢測 cbbL擴(kuò)增前引物序 列 5 ACCAYCAAGCCSAAGCTSGG 3 后引物序列 5 GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC 3 16 cbbM擴(kuò)增引 物序列為cbbM F 5 TTCTGGCTGGGBGGHGAYTTYA TYAARAAYGACGA 3 cbbM R 5 CCGTGRCC RGCVCGRTGGTARTG 3 16 17 norB擴(kuò)增引物序列為 cnorB 2F 5 GACAAGNNNTACTGGTGGT 3 cnorB 6R 5 GAANCCCCANACNCCNGC 3 擴(kuò) 增 體系 25 L 5 反應(yīng)緩沖液5 L 5 GC緩沖液5 L dNTP 2 5 mmol L 2 L 正 向 引 物 10 mol L 1 L 反 向 引 物 10 mol L 1 L DNA 模板2 L 超 純 水 8 75 L Q5超保真DNA聚合酶0 25 L PCR擴(kuò)增條件同蘇鑫等方法 12 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測 并對目標(biāo)片段采用AXYGEN公司 的凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收 后續(xù)使用Microplate reader BioTek FLx800 進(jìn)行熒光定量 DNA樣品在Illumina MiSeqPE250平臺進(jìn)行高通量測序等 1 2 6 數(shù) 據(jù) 處 理 與分析 MiSeqPE250下機(jī)原始數(shù)據(jù)按照 葉雷等介紹的方法 18 進(jìn)行數(shù) 據(jù)整 理 過 濾 及 質(zhì)量 評 估處 理 和 分 析 等 并 基 于 97 的序列相似度進(jìn)行OTU operational taxonomic unit 劃分和分類地位鑒定以及各分類水平的分類 學(xué)組成分析等 2 結(jié)果與 分 析 2 1 栽培料C N對 毛 木 耳 農(nóng) 藝性 狀的影響 2 1 1 栽 培 基 質(zhì) 組 分 總 碳 總 氮 測 定 對供試 木屑 玉 米 芯 和麥麩樣品進(jìn)行總碳和總氮測定 結(jié)果見表1 根據(jù)表1栽培原料總碳和總氮組成情況 取其平均值進(jìn)行 換算 并根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)C N要 求 明 確 各 處 理 栽 培 組 分 情 況 見表2 2 1 2 菌 絲 生長 情 況 栽 培 料 袋 接 種 后 前 20 d放置在室溫 25 84 2 的 無 光 環(huán) 境 搶 溫 發(fā) 菌 然 后 在 溫 度 17 63 4 的環(huán)境中繼續(xù)發(fā)菌 直到菌絲滿袋 表3 由表3可知 各處理料袋裝料平均干重存在顯著差異 且 隨著麥麩的增加 單袋干重也在增加 供試5個處理菌絲長速 為2 4 5 72 mm d 其 中 C1最慢為2 4 mm d C5最快為5 72 mm d 料袋發(fā)菌期的雜菌平均污染率為4 3 10 3 其 中 C3 最低為4 3 C1最高為10 3 在0 05水平下 C5菌絲生長速 度顯著高于C3 約29 12 C2和C4無顯著差異且顯著高于 C1 各處理間料袋發(fā)菌期污染率均存在顯著差異 且C1顯著 高于其他處理 C3顯著低于其他處理 表明高C N C1 會降 低菌絲長速 長勢和提高料袋發(fā)菌期污染率 相對較低 C5 C N會促進(jìn)菌絲生長 但也會提高料袋發(fā)菌期污染率 綜合分 析認(rèn)為 C3處理?xiàng)l件下發(fā)菌良好 2 1 3 耳 片農(nóng) 藝 性 狀 依據(jù) 排水法 測定耳片表面積大小 標(biāo)準(zhǔn)曲線所用耳片厚度1 31 0 23 mm 與各處理間差異不 顯著 P 0 05 以 耳 片 面 積 為 橫 坐 標(biāo) X 單簇耳排水體 積 Y 為 縱 坐 標(biāo) 得 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 Y 0 100756X 0 2667 R 2 0 999 最終得到第一潮鮮耳腹面和背面表面積 表4 供試處理第一潮鮮耳單簇表面積為1 771 44 3 624 09 cm 2 簇 其 中 C5最 小 為 1 771 44 cm 2 簇 C3最 大 為 3 624 09 cm 2 簇 C2和C3的鮮耳和干耳厚度均最大 0 05水 平時 C3處理單簇耳表面積顯著大于其他4個 處 理 表 面 積 大 35 25 104 58 C5 C4和C1耳片表面積小并無差異顯著 性 C2 C3和C4的第一潮鮮耳較厚且無顯著差異 C1 C2和 C3干 耳 較 厚 且 無 顯 著 差 異 但 C4和C5耳片較薄 供試處理前3潮干耳產(chǎn)量為75 03 164 79 g 袋 圖 1和圖 2 由 低 至 高 順 序 依 次 為 C5 75 03 1 28 g 袋 C1 78 18 2 39 g 袋 C4 95 99 0 80 g 袋 C2 96 27 1 39 g 袋 C3 164 79 3 14 g 袋 第一潮鮮耳和干耳均以C3最 高 干耳單產(chǎn)較其他處理高37 18 81 36 前 3潮干耳較其 他處理高71 17 119 63 且 轉(zhuǎn) 化 率 達(dá) 14 98 其次C2和 C4無差異顯著性 C1和C5出耳單產(chǎn)最低且差異不顯著 P 表2 栽 培 料 組分 情況 Table 2 Composition of cultivated materials 處理 Number 木屑 Sawdust m kg 玉米芯 Corncob m kg 麥麩 Bran m kg 石灰 Lime m kg 石膏 Gypsum m kg 總碳含量 Total carbon m g 總氮含量 Total nitrogen m g C N C1 50 50 0 4 1 38762 0000 440 0000 88 10 C2 50 50 3 2 4 1 39791 2160 530 4640 75 01 C3 50 50 9 0 4 1 41656 6700 694 4300 59 98 C4 50 50 20 0 4 1 45194 6000 1005 4000 44 95 C5 50 50 48 5 4 1 54361 0550 1811 0950 30 46 表3 菌 絲 生長 情 況 Table 3 Growth vigor of mycelium 處理 Number 每袋平均干重 Average dry weight per bag m kg 菌絲平均生長速度 Average growth rate of mycelium v mm d 1 菌絲長勢 Growth vigor of mycelium 料袋發(fā)菌污染率 Contamination rate r C1 0 91 2 40 0 15d 10 34 0 05a C2 0 98 2 72 0 11c 7 67 0 12c C3 1 10 4 43 0 40b 4 27 0 15e C4 1 15 2 88 0 22c 7 20 0 20d C5 1 23 5 72 0 30a 8 16 0 06b 干重為基質(zhì)自然晾干后每3袋的平均重量 和 分 別 表 示 稀 疏 密 較 密 和 濃 密 同列數(shù)據(jù)后有不同小寫字母表示在0 05水平下差異顯著 The dry weight is the weight average of each 3 bags dried naturally represent sparse dense more dense and thick mycelia respectively Different lowercase letters in the same column represente significant difference at the 0 05 level 表1 栽 培 原 料 總 碳 和 總氮 測 定 值 Table 1 Results of total carbon and nitrogen in cultivation materials 材料名稱 Material name 總碳 Total carbon TC g kg 1 總氮 Total nitrogen TN g kg 1 平均C N Average of C N 木屑 Sawdust 399 77 0 31 1 87 0 06 213 78 玉米芯 Corncob 375 47 0 21 6 93 0 06 54 18 麥麩 Bran 321 63 0 60 28 27 0 06 11 37 石灰和石膏不作測定 6 Lime and gypsum are not determined 6 葉 雷 等 28 卷 第1 期 2022 年2 月 100 0 05 可見C3是較理想的C N 有 利 于 產(chǎn) 量 的 形 成 2 1 4 出耳 期 感 病 率 供試5個處理均能出耳 第1潮耳幾乎 無 感 病 情 況 第 2潮耳時 氣溫回升 病蟲基數(shù)大 有感病耳片 出 現(xiàn) 第 3潮耳產(chǎn)量驟減無統(tǒng)計(jì)價值 第2潮耳感病情況見表5 供試處理第二潮耳期間的感病率范圍為13 89 50 56 在0 05水平 C1和C5感病率顯著高于其他處理 C3感病率顯著低于其他處理 C N會引起毛木耳菌棒出現(xiàn)不 同程度的污染 C1處 理 在 第 二 潮 耳 采 收 后 菌 棒 污 染 率 高 達(dá) 95 96 C4最低為1 79 C3和C4處理菌棒相對雜菌污染率 較 低 說 明 栽 培 基 質(zhì) C N不協(xié)調(diào)可引起出耳產(chǎn)量降低 出耳期 菌棒雜菌易污染的情況 C N還 直 觀 地 對菌棒 色 澤 表 現(xiàn)有顯著影 響 圖 3 隨著 C N的下降 菌棒顏色呈現(xiàn)深褐色 褐色 黃白色 灰褐色的 過渡趨勢 菌絲長勢在不同處理間發(fā)生了劇烈的變化 綜上分析表明 C3處 理 菌 絲 長 速 適 中 出 耳 單 產(chǎn) 高 耳 片 厚 出 耳 感 病 率 低 即 C N約在60 1較適宜毛木耳菌絲生長和 出耳產(chǎn)量形成 2 2 菌絲 滿 袋 期C3處 理固碳和固氮 細(xì)菌群落 多 樣性 2 2 1 含cbbL基因的固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 除了栽培基質(zhì)自 身C N組成會對毛木耳菌絲生長產(chǎn)生影響 基質(zhì)微生物組成 也在一定程度上產(chǎn)生作用 為進(jìn)一步研究C3栽培基質(zhì)中細(xì) 菌群落對基質(zhì)碳循環(huán)和氮循環(huán)的響應(yīng)和反饋 對C3菌絲滿袋 無光環(huán)境控溫發(fā)菌培養(yǎng)54 d 時菌棒進(jìn)行功能基因cbbL和 cbbM的測定 對cbbL和cbbM基 因 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 結(jié) 果 cbbL基因 PCR擴(kuò)增達(dá)到要求 在Illumina Miseq PE250平臺進(jìn)行了高通 量測序 全 部樣品16S rRNA基因序列原始數(shù)據(jù)提交到NCBI 的SRA數(shù) 據(jù) 庫 登 錄 號 PRJNA656319 但 cbbM基因多次擴(kuò) 增結(jié)果均為陰性 故未進(jìn)行后續(xù)測定 采用Illumina MiSeq平 臺 高 通 量 測 序 對 C3處理菌絲滿 袋期菌棒細(xì)菌進(jìn)行碳循環(huán)基因cbbL的 測 定 結(jié) 果 得 到 39 687 條 有 效 序 列 并 根 據(jù) OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果 獲得 6個門 7個綱 14個目 19個科 24個屬 在門分類 水平 圖 4a 變 形 菌 門 Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria 為 優(yōu) 勢 菌 門 且 相 對 豐 度 分 別 為 90 8 和0 2 Others為 8 9 在屬分類 水平 圖 4b 含 cbbL基 因固 碳 細(xì) 菌 相 對豐 度排名前10 主 要 歸 屬于貪銅菌屬Cupriavidus 41 7 變形菌門 紅長命菌屬Rubrivivax 33 6 變 形菌門 甲基球菌屬M(fèi)ethylococcus 6 5 變形菌門 貪噬菌屬 Methylococcus 3 3 變形菌門 硫桿菌屬Thiobacillus 1 4 變形菌門 慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium 0 9 變形菌門 伯克氏菌屬Bradyrhizobium 0 7 變形菌門 嗜酸菌屬Acidiphilium 0 5 變 形菌門 根瘤菌屬Rhizobium 0 4 變 形菌門 和 Methylibium 0 3 變形菌門 其中貪銅菌屬和紅長命菌屬為豐度最 大的兩個屬 占所有菌群的75 3 2 2 2 含norB基因的固氮 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 與用于cbbL基因 測定樣品同期采樣 norB基因進(jìn)行PCR擴(kuò) 增 等后 在 Illumina MiSeq PE250平臺進(jìn)行功能基因的測定 結(jié)果獲得49 123條 有 效 序 列 并 根 據(jù) OTU劃分和分類地位鑒定獲得4個門 7個 綱 12個目 16個科 19個屬 在門分類 水平 圖 5a 厚 壁 菌 門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria為 優(yōu) 勢 菌 門 相 對 豐 度分別是3 2 和0 4 Others達(dá)96 4 在屬分類 水平 圖 5b 含 norB基因細(xì)菌主要?dú)w屬于土芽孢桿菌Geobacillus 2 1 厚 壁 菌 門 巨 球 菌 屬 Macrococcus 0 9 厚 壁 菌 門 假 單 胞 菌 屬 Pseudomonas 0 2 變 形 菌 門 葡 萄球菌屬Staphylococcus 0 1 厚 壁 菌 門 和 芽 孢 桿 菌 屬 Bacillus 0 1 厚 壁 菌 門 等 3 結(jié) 論與 討 論 本研究證明栽培料C N組成對毛木耳菌絲長速 菌絲長 圖2 各 處 理 第一 潮 鮮 耳 C1 C5表示C N分別為90 1 75 1 60 1 45 1和30 1 Fig 2 Fresh fruiting bodies at the first harvest C1 C5 represent 90 1 75 1 60 1 45 1 and 30 1 respectively C1 C2 C3 C4 C5 Number Weight of fresh fruiting bodies at the first harvest g bag Weight of dry fruiting bodies at the first harvest g bag Weight of dry fruiting bodies harvested three times g bag Converted efficiency 700 600 500 400 300 200 100 0 16 14 12 10 8 6 4 2 0 m g r 圖1 每 袋 產(chǎn) 量 m 和 轉(zhuǎn) 化 率 r 分 析 C1 C5表示C N 分別為90 1 75 1 60 1 45 1和30 1 Fig 1 Analysis of yield m per bag and converted efficiency r C1 C5 represent 90 1 75 1 60 1 45 1 and 30 1 respectively 表4 第 一潮耳表 面積 大 小 和厚度 Table 4 The surface area and thickness of the first harvest fruiting bodies 處理 Number 單簇耳表面積大小 Surface area per tuft of fruiting body A cm 2 鮮耳片厚度 Thickness of fresh fruiting body mm 干耳片厚度 Thickness of dry fruiting body mm C1 1872 34 785 33c 1 28 0 21b 0 69 0 19a C2 2679 57 543 68b 1 51 0 11a 0 70 0 20a C3 3624 09 478 80a 1 43 0 28ab 0 71 0 22a C4 2318 14 852 47bc 1 38 0 12ab 0 54 0 10b C5 1771 44 403 93c 1 29 0 16b 0 49 0 10b 同列數(shù)據(jù)后有不同小寫字母表示在0 05水平下差異顯著 Different lowercase letters in the same column represent significant difference at the 0 05 level 毛 木 耳 代 料 栽 培 適 宜碳 氮 比及 菌棒中 固碳 固氮 細(xì) 菌群 落 結(jié) 構(gòu) 101 Vol 28 No 1 Feb 2022 勢 發(fā)菌 期 污 染 率 耳片 大小 耳片厚 度 耳片感 病 率 出耳 期菌棒雜菌污染率和出耳單產(chǎn)等均有顯著影響 在以木屑 和玉米芯為碳源 麥麩為氮源時 栽培料基質(zhì)C N組成在C3 60 1 左 右 菌 絲 長 速 快 4 43 mm d 發(fā)菌期料袋污染率 低 4 27 菌 絲 長 勢 好 單 簇 耳 表 面 積 達(dá) 3 624 09 cm 2 簇 第一潮干耳厚 達(dá) 0 71 mm 出 耳 單 產(chǎn) 達(dá) 164 79 g 袋 從 生 產(chǎn) 栽 培 角 度 認(rèn) 為 在 C N為C3 即60 1 左 右 時 利 于 毛 木 耳 產(chǎn) 量的形成 林新堅(jiān)等以甘蔗渣為碳源 硫酸銨為氮源設(shè)計(jì)了 不同C N培 養(yǎng) 基 進(jìn) 行 試 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示 C N為80 100 1時 利 于 781 菌株子實(shí)體的形成 且認(rèn)為80 1時 最 理 想 其 后 依 次 是100 1和60 1 且 認(rèn) 為 40 1時原基不會形成 19 本研究表明 上海 1號 菌株在碳氮比為 60 1時是較理想的 其次是45 1和 75 1 在 30 1時 也 能 形 成 子 實(shí) 體 第 一 潮 干 耳 達(dá) 69 g 袋 但 是 第二潮后不再形成原基 這可能與菌株差異有關(guān) 賀新生等設(shè) 計(jì)了16個栽培基質(zhì)配方栽培毛木耳 上海3號 菌 株 結(jié) 果 顯 示采用60 100 1的高C N和0 4 0 8 低含氮量的配方栽培 毛 木 耳 時 干 耳 生 物 學(xué) 效 率 達(dá) 到 了 20 24 20 陳文良等采 用不同基質(zhì)配方栽培北京大木耳 Au 1 得 出 C N為25 59 1 的配方利于木耳菌絲生長 21 但 沒 有 進(jìn) 一 步 作 出 耳 產(chǎn) 量 統(tǒng) 計(jì) 柯麗娜等在白背毛木耳栽培基質(zhì)中添加不同量的豆粕以調(diào)整 基質(zhì)C N組成 從而得出了豆粕的最適宜添加比例 22 張波等 在毛木耳基礎(chǔ)配方 木屑35 玉 米 芯 30 米 糠 20 棉 籽 殼10 石 灰 4 和石膏1 中以麥麩和玉米粉分別作為氮源 以替代木屑百分含量 結(jié)果表明 在基礎(chǔ)配方中以2 麥麩或 6 玉米粉替代木屑作為氮源時能獲得較高栽培效益 23 但 未給出栽培料具體的碳氮比組成 湯春燕以不同培養(yǎng)料栽培 毛 木 耳 黃耳 10號 菌 株 發(fā) 現(xiàn) 木 屑 67 玉 米 芯 20 麥 麩 10 石 灰 2 和石膏1 的配方表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn) 24 根 據(jù) 文 章 碳氮比數(shù)據(jù)換算該配方碳氮比為120 1 張曉宇表明短毛木耳 Auricularia villosula Malysheva菌絲營養(yǎng)生長最適碳氮比為 20 1 25 但 生 殖 生 長 階 段 出 耳 基 質(zhì) 碳 氮 比 未 深 入 研 究 姜 建新等介紹 玉木耳栽培要求基質(zhì)碳氮比為30 40 1 26 張介 馳等以木屑和麥麩為碳 氮源袋栽黑木耳 結(jié)果表明碳氮比為 114 3 1的 木 屑 配 方 菌 絲 潔 白 吃 料 速 度 最 快 菌 袋 彈 性 好 單 產(chǎn) 高 品 質(zhì) 優(yōu) 27 可見基質(zhì)C N對食用菌生殖生長意義重大 肖生美對雙孢蘑菇和秀珍菇栽培過程中碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化及 CO 2 排放規(guī)律進(jìn)行的研究表明 在子實(shí)體生長階段基質(zhì)干物 質(zhì)量顯著減少 呼吸耗能強(qiáng)度大 雙孢蘑菇和秀珍菇培養(yǎng)料 中碳素分別僅有5 29 7 45 和5 36 6 34 轉(zhuǎn)移到子實(shí)體 中去 其余大部分的碳量以呼吸形式消耗掉 28 但 沒 有 探 討 栽 培體系碳 氮循環(huán)還可能與哪些功能細(xì)菌菌群有關(guān) 本研究中 含cbbL基因的固碳細(xì)菌主要包括 變形菌門中一些化能自養(yǎng) 微 生 物 如 Rubrivivax和Variovorax等固碳微生物 變形菌 門中主要包括一些典型的非共生固氮的細(xì)菌 如Rhizobium和 Bradyrhizobium等 變形菌門僅有Methylococcus 石巖首 次發(fā)現(xiàn)Cupriavidus菌株 自生固氮菌 具有木質(zhì)素降解能力 且在pH為7 溫 度 為 30 最適宜 29 楊穎等表明Cupriavidus sp SHE的細(xì)胞上清液 全細(xì)胞以及胞內(nèi)提取物均具有合成 表5 第二 潮 耳 感 病 情況 及其差異性比 較 Table 5 The infection rate of fruiting bodies at the second harvest 處理 Number 耳片感病率 Infection rate r 菌棒雜菌污染率 Contamination rate of artificial bed log r 主要雜菌污染 表觀情況 Main contamination type C1 50 56 2 55a 95 96 菌棒變黑變黃 綠霉 黃曲霉 細(xì)菌污染 The artificial bed log turns black and yellow with Trichoderma Aspergillus and bacterial contamination C2 35 00 1 67b 20 19 菌棒變黑變黃 綠霉 細(xì)菌污染 The artificial bed log turns black and yellow with Trichoderma and bacterial contamination C3 13 8