查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用.pdf
中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022 55 6 1139 1148 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2022 06 007 收稿日期 2021 09 23 接受日期 2021 12 14 基金項目 國家自然科學(xué)基金 31860493 廣西重點研發(fā)計劃 桂科 AB21076001 廣西八桂青年學(xué)者 專項 廣西農(nóng)科院基本科研業(yè)務(wù)專項 2021JM97 2018JZ18 聯(lián)系方式 郭澤西 E mail 1162410925 通信作者尹玲 E mail 779335723 開放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識碼 OSID 查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的 作用 郭澤西 孫大運 曲俊杰 潘鳳英 劉露露 尹玲 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室 南寧 530007 摘要 目的 克隆不同抗性葡 萄品種中查爾酮合成酶 c halcone synthase 基因 CHS1 明確該基因在葡萄灰霉病菌 Botrytis cinerea 和葡萄霜霉病菌 Plasmopara viticola 侵染下的表達模式 并對 CHS1 進行亞細(xì)胞定位和功能 驗證 為探究 CHS1 的廣譜抗病作用機理提供依據(jù) 方法 分別以毛葡萄 Vitis quinquangularis 野釀二號 歐 亞種 Vitis vinifera 無核白 和山葡萄 Vitis amurensis 雙紅 葉片 cDNA 為模板 克隆 CHS1 分析不同品種 中 CHS1 的序列差異 并對 CHS1 蛋白的理化性質(zhì)進行生物信息學(xué)分析 利用 qRT PCR 檢測不同葡萄品種受到灰霉病菌和 霜霉病菌侵染后 CHS1 的表達模式 構(gòu)建表達載體 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達技術(shù) 分別在煙草和 無核白 組培苗 葉片中進行亞細(xì)胞定位和抗病功能驗證 結(jié)果 CHS1 在不同葡萄品種中高度保守 ORF 全長均為 1 182 bp 編碼 393 個氨基酸 預(yù)測編碼的蛋白分子量為 42 92 kD 為穩(wěn)定的親水蛋白 受灰霉病菌侵染后 毛葡萄 VqCHS1 和歐亞種 VvCHS1 的表達模式變化類似 但灰霉病抗性品種 野釀二號 中 VqCHS1 的表達水平整體顯著偏高 受霜霉病菌侵染后 山葡 萄 VaCHS1 和歐亞種 VvCHS1 表現(xiàn)出不同的表達模式變化 霜霉病抗性品種 雙紅 中 VaCHS1 的表達量不斷增加 而 VvCHS1 的表達量逐漸下降 亞細(xì)胞定位結(jié)果表明 CHS1 蛋白在細(xì)胞膜質(zhì) 細(xì)胞核中都有分布 但以細(xì)胞核定位為主 人工接 種灰霉病菌和霜霉病菌后 與陰性對照相比 過表達 VaCHS1 的 無核白 葉片具有更強的灰霉病和霜霉病抗性 結(jié) 論 抗性品種中查爾酮合成酶基因 CHS1 的表達量比感病品種高 過表達 CHS1 能夠提高感病葡萄品種對灰霉病和霜霉 病的抗性 關(guān)鍵詞 查爾酮合成酶 葡萄 灰霉病菌 霜霉病菌 抗病性 The Role of Chalcone Synthase Gene in Grape Resistance to Gray Mold and Downy Mildew GUO ZeXi SUN DaYun QU JunJie PAN FengYing LIU LuLu YIN Ling Key Lab of Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Guangxi Academy of Agricultural Sciences Nanning 530007 Abstract Objective The objective of this study is to clone the chalcone synthase gene CHS1 in different resistant grape varieties clarify the expression pattern under the infection of Botrytis cinerea and Plasmopara viticola verify the subcellular localization and function of CHS1 and to provide a basis for exploring the broad spectrum resistance mechanism of CHS1 Method CHS1 genes were cloned from the leaf cDNAs of Vitis quinquangularis Yeniang 2 Vitis vinifera Thompson Seedless and Vitis amurensis Shuanghong The differences in the nucleic acid sequence and physicochemical properties of CHS1 protein were analyzed by bioinformatics Expression patterns of CHS1 in different varieties during B cinerea and P viticola infection were also detected by 1140 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 qRT PCR The expression vector was constructed and the transient expression technology mediated by Agrobacterium was used to verify the subcellular localization and disease resistance function in the leaves of tobacco and Thompson Seedless tissue culture seedlings Result The CHS1 is highly conserved among different grape varieties The full length of ORF is 1 182 bp which encodes 393 amino acids The predicted molecular weight of the encoded protein is 42 92 kD which is a stable hydrophilic protein After being infected by B cinerea the expression patterns of VqCHS1 and VvCHS1 were similar but the expression level of VqCHS1 in the resistant variety Yejiang 2 was significantly higher After being infected by P viticola VaCHS1 and VvCHS1 showed different expression pattern changes The expression level of VaCHS1 in the resistant variety Shuanghong continued to increase while the expression level of VvCHS1 gradually decreased The results of subcellular localization showed that CHS1 protein is distributed in the cytoplasm and nucleus but it is mainly localized in the nucleus Compared with the negative control the Thompson Seedless leaves overexpressing VaCHS1 showed stronger resistance to gray mold and downy mildew after artificial inoculation Conclusion The expression level of CHS1 in resistant varieties is higher than that in susceptible varieties and overexpression of CHS1 can increase the resistance of susceptible grape varieties to gray mold and downy mildew Key words chalcone synthase CHS grape Botrytis cinerea Plasmopara viticola disease resistance 0 引言 研究意義 葡萄是我國廣泛種植的果樹 其果 實可以用來鮮食 釀酒 制干和制汁等 具有重大的 經(jīng)濟價值 國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示 2019 年我國葡 萄種植面積達到 72 62 萬公頃 產(chǎn)量為 1 419 54 萬噸 灰霉病和霜霉病是危害葡萄生長比較嚴(yán)重的兩種病 害 會造成果實品質(zhì)下降 嚴(yán)重減產(chǎn) 甚至絕收 生 產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑防治灰霉病和霜霉病 普遍存 在病原菌易產(chǎn)生抗藥性 增加生產(chǎn)成本并造成一定的 環(huán)境問題 因此 培育廣譜抗病優(yōu)質(zhì)葡萄品種是葡萄 育種的重點 將抗病品種中的查爾酮合成酶 chalcone synthase 基因 CHS 轉(zhuǎn)入感病品種 提高對灰霉菌和 霜霉菌的抗性 了解 CHS 在葡萄抗灰霉病和霜霉病中 的作用機制 可為廣譜抗病品種的培育提供理論依據(jù) 前人研究進展 類黃酮 flavonoid 是一類低分子 量多酚化合物的總稱 在植 物受到病原菌侵染時類黃 酮合成途徑被迅速激活 進而起到防御作用 類黃酮 不僅在植物自身生理生化方面具有重要作用 例如種 子的顯色反應(yīng) 逆境的抵抗 1 抗病害 2 和信號傳導(dǎo) 3 等 在臨床上還具有防癌 4 抗氧化 5 抗瘧疾和抗 動脈硬化等功能 查爾酮合成酶 CHS 是類黃酮 合成途徑中的關(guān)鍵酶 也是限速酶 研究表明 在 番茄 6 亞麻 7 小麥 8 煙草 9 和蘋果 10 中過表達 CHS 能夠增加對蟲害和病原菌等環(huán)境脅迫的抗性 而在彩色棉中 GhCHS1 參與植株體內(nèi)和纖維中花青素 的合成與累積 在纖維色澤形成中起著關(guān)鍵作用 11 本研究切入點 前期本課題組通過對多個葡萄品 種響應(yīng)不同病原菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 發(fā)現(xiàn) CHS1 XM 019224647 1 的表達量在不同抗性品種 響應(yīng)葡萄灰霉病菌 Botrytis cinerea 和葡萄霜霉病菌 Plasmopara viticola 的侵染過程中均存在顯著差 異 推測該基因可能與抗病相關(guān) DAO 等研究表明 植物 CHS 在紫外線或病原菌等脅迫條件下會被誘導(dǎo) 表達 從而導(dǎo)致類黃酮和異黃酮植物抗毒素的積累 并參與水楊酸防御途徑 12 13 因此筆者推測 CHS 在 葡萄的抗病過程中也發(fā)揮重要作用 擬解決的關(guān)鍵 問題 從野生毛葡萄 野釀二號 Vitis quinquangularis cv Yeniang 2 歐洲葡萄 無核白 Vitis vinifera cv Thompson Seedless 和山葡萄 雙紅 Vitis amurensis cv Shuanghong 中克隆 CHS1 分析其在不同品種中 的序列差異和蛋白特征 并通過 qRT PCR 檢測該基因 受灰霉病菌和霜霉病菌侵染后不同時間點的表達差 異 通過葉片瞬時表達明確該基因的亞細(xì)胞定位和抗 性功能 為培育廣譜抗病的葡萄新品種提供新的思路 和策略 1 材料與方法 試驗于 2020 年在廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重 點開放實驗室完成 1 1 材料與試劑 1 1 1 材料 野生毛葡萄 野釀二號 由廣西壯族自 治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培苗公司提供 歐洲葡萄 無核白 和山葡萄 雙紅 來自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院試 驗基地 葡萄灰霉病菌由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護 研究所惠贈 葡萄霜霉病菌由廣西作物遺傳改良生物 技術(shù)重點開放實驗室葡萄分子設(shè)計育種團隊分離保 存 本氏煙 Nicotiana benthamiana 和葡萄組培苗均 在光照 16 h 黑暗 8 h 25 生長條件下培養(yǎng) 6 期 郭澤西等 查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1141 1 1 2 試劑 植物總 RNA 提取試劑盒 Spectrum Plant Total RNA Kit 購自西格瑪奧德里奇 上海 貿(mào) 易有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購自 TaKaRa 大連 公司 高保 真 DNA 聚合酶 2 Phanta Max Master Mix 感受態(tài)細(xì) 胞 Fast T1 和克隆試劑盒 5 min TA Blunt Zero Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司 膠回收試劑盒 QIAquick Gel Extraction Kit 和質(zhì)粒小提試劑盒 TIANprep Mini Plasmid Kit 購自天根生化科技有限公 司 熒光定量試劑盒 LightCycle 480 SYBR Green Master 購自廣州聚研生物科技有限公司 1 2 方法 1 2 1 CHS1 的克隆 野釀二號 無核白 和 雙 紅 葉片總 RNA 提取參照 Spectrum Plant Total RNA Kit 試劑盒說明書 參照 TaKaRa 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 的試劑盒說明書進行 cDNA 的合成 根據(jù) NCBI 上的 CHS1 序列 登錄號 XM 019224647 1 設(shè)計特異引物 CHS1 F 和 CHS1 R 引物序列見表 1 以 cDNA為模板 利用 2 Phanta Max Master Mix 試劑盒進行擴增 反應(yīng)條件 95 預(yù)變性 3 min 95 15 s 54 15 s 72 45 s 30 個循環(huán) 72 延伸 5 min 1 的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物 參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行 PCR 產(chǎn)物回 收 回收片段參照 5 min TA Blunt Zero Cloning Kit 試 劑盒與 T 載體進行連接 37 連接 5 min 將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 Fast T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 具體步驟參照 Fast T1 的說明書 挑取白斑 PCR 檢測 檢測的引物 為 CHS1 F 和通用引物 M13 F 質(zhì)粒的提取步驟詳見 TIANprep Mini Plasmid Kit 試劑盒說明書 將質(zhì)粒送 往上海生工公司測序 將測序的結(jié)果用軟件 Vector NTI Explorer 進行序列的組裝 堿基序列和氨基酸序 列的比對使用 DNAMAN 軟件 用蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析工 具 http web expasy org protparam 分析 CHS1 蛋白 的理化參數(shù) 表 1 本試驗所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in this study 引物名稱 Primer name 序列 Primer sequence 5 3 用途 Purpose CHS1 F ATGGTGTCAGTGGGGGAAAT CHS1 R TGCTACACAATCGACTCAC 基因擴增 Gene amplification CHS1 qF CGTTCTGAGCGAGTATGGGA CHS1 qR TGTGGTGCCCTTTCCTTCTT 實時熒光定量 PCR Real time fluorescence quantitative PCR EF 1 F AATTTTGACCAAGATCGACAGG EF 1 R CAGCAACAGTTTGACGCATG 葡萄內(nèi)參基因 Reference gene in grape CHS1 2F GCTCTAGAATGGTGTCAGTGGGGGAAATC CHS1 2R GCCCCGGGATGTGAGTCGATTGTGTAGCA 亞細(xì)胞定位 Subcellular localization 1 2 2 病原菌培養(yǎng)及接種方法 葡萄霜霉病菌的培 養(yǎng)和接種 取不同葡萄品種一年生枝條上第 2 4 位健 康的完全伸展開的幼嫩葉片 用無菌水清洗兩次 濾 紙吸干葉片表面水分 用打孔器打取直徑為 1 或 1 5 cm 的葉盤 放入鋪有兩層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行保 濕 將實驗室在 赤霞 葉片上擴繁的葡萄霜霉病菌 配置成濃度為 2 10 5 mL 的孢子囊懸浮液 用移液器 接種到 野釀二號 無核白 和 雙紅 的葉盤上 每個葉盤上接種 35 L 在抗性表型觀察試驗中 每 個品種接種 12 個葉盤 葡萄灰霉菌病的培養(yǎng)和接種 在超凈工作臺上 將在 PDA 培養(yǎng)基上新活化的灰霉病菌作為接種試材 用滅過菌的打孔器在灰霉病菌菌落邊緣打下直徑 0 5 cm 菌塊 如霜霉病菌接種步驟中準(zhǔn)備的葉盤 葉盤中 間用無菌牙簽刺一個小孔 將灰霉病菌菌塊倒扣在葉 盤針刺處 使得菌絲與葉片接觸 在相對濕度 90 22 黑暗條件下培養(yǎng) 3 d 觀察發(fā)病癥狀 在抗性表型 觀察試驗中 每個品種接種 16 個葉盤 1 2 3 CHS1 的表達模式分析 取不同葡萄品種一年 生枝條上第 2 4 位健康的幼嫩葉片 用超純水清洗兩 次 濾紙吸干葉片表面水分 用打孔器打取直徑為 1 cm 的葉盤 放入鋪有兩層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行 保濕 葉盤均分到 5 個培養(yǎng)皿中 每個皿的標(biāo)記為 0 6 12 24 和 48 h 每個品種選取長勢一致的 3 棵植 1142 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 株作為 3 個生物學(xué)重復(fù) 按照 1 2 2 中的接種方法 分 別進行霜霉病菌和灰霉病菌接種 并分別在 0 6 12 24 和 48 h 取樣 迅速用液氮冷凍 保存于 80 冰箱 備用 葉盤 RNA 提取和 cDNA 合成參照 1 2 1 利用 Primer 5 0軟件設(shè)計熒光定量引物 CHS1 qF R 以 EF 1 為內(nèi)參基因 引物信息見表 1 使用 ROCHE 公司的 LightCycle 480 進行熒光定量 PCR 每個生物學(xué)重復(fù)設(shè) 置 3 個技術(shù)重復(fù) 熒光定量反應(yīng)體系參照 LightCycle 480 SYBR Green Master 說明書 采用 2 Ct 法計算不 同時間點 CHS1 相對 0 h 的表達量變化 采用 IBM SPSS Statistics 計算各組別間的差異顯著性 1 2 4 VaCHS1 的亞細(xì)胞定位 以 雙紅 葉片 cDNA 為模板 使用含有 Xba 和 Xma 酶切位點的上下游 引物 CHS1 2F R 利用 2 Phanta Max Master Mix 進 行 PCR 擴增 同時使用 Xba 和 Xma 酶切 pBI121 GFP 載體 將目的基因和載體大片段回收純化后進行 連接 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì) 胞 通過 PCR 酶切鑒定陽性克隆并進行測序 將 構(gòu)建成功 測序正確的重組載體質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn) 入農(nóng)桿菌 GV3101 28 培養(yǎng) 2 d 參照尹玲 14 的瞬 時轉(zhuǎn)化方法注射煙草葉片 48 h 后取標(biāo)記的農(nóng)桿菌注 射的煙草葉片 于激光共聚焦顯微鏡 C2 ER Nikon Japan 下觀察 GFP 融合蛋白的綠色熒光位置 拍照 記錄 1 2 5 VaCHS1 瞬時轉(zhuǎn)化至葡萄葉片 將 pBWA V HS VaCHS1 GFP 過表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 GV3101 挑取單菌落接種到 5 mL YEP 培養(yǎng)基上 并加上 2 5 L 的 100 ng mL 1 的卡那霉素 在 28 200 r min 的搖 床上培養(yǎng) 2 d 2 d 后 將舊培養(yǎng)基上的菌液吸取 200 L 至 20 mL 新鮮 YEP 中生長 24 h 后 將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn) 移到 50 mL 離心管 室溫下 1 500 g 離心 4 min 用 滲透緩沖液 50 mmol L 1 MES pH 5 6 2 mmol L 1 Na 3 PO 4 0 5 蔗糖 w v 和 100 mol mL 1 乙酰丁香 酮 洗滌沉淀兩次 并將細(xì)菌懸浮液稀釋至 OD 600 為 0 2 在 25 黑暗環(huán)境中生長 1 2 h 注射前輕輕搖 動離心管 使用不帶針頭的 1 mL 注射器注射菌液到 無核白 葉片遠軸端 滲透后 將葉片轉(zhuǎn)移到光照 16 h 黑暗 8 h 溫度為 22 的生長室生長 2 d 后 分別用灰霉病菌和霜霉病菌鑒定瞬轉(zhuǎn)后葡萄葉片的抗 性 同時以 pBWA V HS GFP 空載作為對照 接種方 法與 1 2 2 中離體葉盤類似 但是整片葉子接種時注意 避開葉片的主葉脈 同時接種點要與觀察到 GFP 熒光 的注射點盡量保持重合 每組鑒定選取 5 片葉子作為 生物學(xué)重復(fù) 2 結(jié)果 2 1 不同葡萄品種接種霜霉病菌和灰霉病菌的表型 通過室內(nèi)離體葉盤法接種鑒定發(fā)現(xiàn) 野釀二號 無核白 和 雙紅 3 個葡萄品種對霜霉病的抗性 存在較大差異 如圖 1 所示 歐亞種 無核白 接種 5 d 后 葉盤上可以觀察到明顯的白色霜霉 而山葡萄 雙紅 和毛葡萄 野釀二號 的葉盤表面未見任何 發(fā)病癥狀 同樣地 利用室內(nèi)離體葉盤法對 3 個品種 進行灰霉病抗性鑒定 結(jié)果表明 相同面積的灰霉病 菌菌塊接種相同大小的葉盤 5 d 后 無核白 表現(xiàn) 圖 1 不同葡萄品種接種霜霉病菌和灰霉病菌后的表型 Fig 1 Phenotypes of leaf discs of different grape varieties inoculated with P viticola and B cinerea 6 期 郭澤西等 查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1143 出明顯的發(fā)病癥狀 病斑直徑顯著大于 雙紅 而 野釀二號 葉盤上只觀察到接種前針刺的小孔 這 表明 歐亞種 無核白 對霜霉病菌和霜霉病菌均表 現(xiàn)為感病 野釀二號 和 雙紅 則對這兩種病原 菌均有較強的抗性 2 2 不同葡萄品種 CHS 的克隆和序列分析 以 野釀二號 無核白 和 雙紅 cDNA 為 模板 利用 RT PCR 分別從 3 個品種中擴增出 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 的編碼區(qū)序列 全長均 為 1 182 bp 編碼 393 個氨基酸 預(yù)測編碼的 CHS1 蛋白的分子量為 42 92 kD 理論等電點為 6 10 包含 20 種氨基酸 正電荷的氨基酸 Arg Lys 43 個 負(fù) 電荷的氨基酸 Asp Glu 48 個 不穩(wěn)定性系數(shù)為 34 59 屬于穩(wěn)定蛋白 且親水性平均系數(shù) GRAVY 為 0 064 為親水蛋白 TMHMM 在線網(wǎng)站分析表明 該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域 不屬于跨膜蛋白 序列比對 分析結(jié)果如圖 2 所示 VvCHS1 和 VaCHS1 的氨基酸 序列完全一致 VqCHS1 與 VvCHS1 VaCHS1 只在 第 61 位存在 1 個氨基酸的差異 說明 CHS1 在不同品 種中高度保守 圖 2 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 的氨基酸序列比對 Fig 2 Amino acid sequence alignment of VqCHS1 VvCHS1 and VaCHS1 2 3 不同品種受到病原菌侵染后 CHS1 的表達模式分析 用打孔器在 野釀二號 和 無核白 的嫩葉上 打取葉盤 直徑 0 5 cm 灰霉病菌菌塊進行侵染 并在 侵染后 0 6 12 24 和 48 h 分別收集葉盤用于 CHS1 的熒光定量分析 結(jié)果如圖 3 所示 與 0 h 相比 灰 霉病菌侵染 6 h 后 野釀二號 VqCHS1 誘導(dǎo)上調(diào)表 達 侵染后 12 24 h 表 達 量 比 6 h 有所下降 而 48 h 又急劇上升 感病品種 無核白 VvCHS1 的表達模 式變化雖然與之類似 但整體表達量均低于抗灰霉病 的 野釀二號 VqCHS1 用相同濃度的霜霉病菌孢子囊懸浮液接種 雙紅 和 無核白 的嫩葉葉盤 接種后 0 6 12 24 和 48 h 分別取樣用于 VaCHS1 和 VvCHS1 表達量分析 結(jié)果如圖 4 所示 霜霉病菌侵染后 抗霜霉病的品種 雙紅 中的 VaCHS1 的持續(xù)上調(diào)表達 在 24 h 時表 達量達到最高 48 h 時表達量略有下降 而感病品種 無核白 VvCHS1 的表達量持續(xù)下降 在 48 h 時略 有回升 b b a b b b c b a a 0 5 10 15 20 25 VqCHS1 VvCHS1 0 hpi 6 hpi 12 hpi 24 hpi 48 hpi 柱上不同小寫字母表示相對表達量在 0 05 水平上差異顯著 圖 4 同 Different lowercase letters on the bars indicate significant difference in the relative expression at 0 05 level The same as Fig 4 圖 3 灰霉病菌侵染 野釀二號 和 無核白 過程 CHS1 的表達變化 Fig 3 The expression changes of CHS1 in Yeniang 2 and Thompson Seedless during B cinerea infection 1144 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 2 4 CHS1 蛋白的亞細(xì)胞定位 為了驗證 VaCHS1 的亞細(xì)胞定位 將含有 pBI121 VaCHS1 GFP 載體的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化至煙草葉片表皮 細(xì)胞中 表達 pBI121 GFP 的煙草葉片為陰性對照 觀察融合蛋白的熒光位置 結(jié)果如圖 5 所示 瞬時表 達 pBI121 GFP 的細(xì)胞 綠色熒光分布在細(xì)胞膜 細(xì) 胞核和細(xì)胞質(zhì) 而瞬時表達 pBI121 VaCHS1 GFP 的 細(xì)胞 綠色熒光主要分布在細(xì)胞核內(nèi) 少量分布在細(xì) 胞膜 2 5 CHS1 的抗病功能驗證 為了驗證 CHS1 在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的功 能 將 pBWA V HS GFP 和 pBWA V HS VaCHS1 GFP 分別瞬時轉(zhuǎn)化感病品種 無核白 組培苗葉片 2 d 后 首先在紫外燈下觀察蛋白的表達情況 如圖 6 A 6 B 所示 觀察到明顯的綠色熒光 說明 pBWA V HS GFP 和 pBWA V HS VaCHS1 GFP 在 無核白 a a b a b a c a b a 0 3 6 9 12 15 VaCHS1 VvCHS1 0 hpi 6 hpi 12 hpi 24 hpi 48 hpi 3 圖 4 霜霉病菌侵染 雙紅 和 無核白 過程 CHS1 的表 達變化 Fig 4 The expression changes of CHS1 in Shuanghong and Thompson Seedless during P viticola infection ABCD EFGH pBI121 GFP pBI121 VaCHS1 GFP A E 熒光蛋白通道 Fluorescent protein channel B F 葉綠體熒光蛋白通道 Chloroplast fluorescent protein channel C G 明場 Bright field D H 熒光蛋白通道 葉綠體熒光蛋白通道和明場的疊加圖 Merged field 圖 5 CHS 蛋白在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位 Fig 5 Subcellular localization of CHS protein in tobacco leaves 上正常表達 然后用直徑為 0 5 cm 的灰霉病菌菌塊和 濃度為 2 10 5 孢子囊 mL 的霜霉病菌菌液分別侵染瞬 時轉(zhuǎn)化的葉片 5 d 后觀察發(fā)病情況 結(jié)果如圖 6 C 6 D 所示 表達 VaCHS1 的 無核白 葉片接種灰霉 病菌后 發(fā)病面積和嚴(yán)重程度明顯小于對照組 抗性 顯著增強 5 個重復(fù)試驗鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致 如圖 6 E 6 F 所示 對照組 無核白 葉片接種點周圍可以觀 察到明顯的白色霜霉菌 而過表達 VaCHS1 的 無核 白 葉片表現(xiàn)出較強的霜霉病抗性 葉片表面幾乎觀 察不到病菌生長 5 片葉子重復(fù)表型一致 3 討論 3 1 CHS 基因結(jié)構(gòu)與抗病性 類黃酮是植物重要的次生代謝產(chǎn)物 參與植物對 6 期 郭澤西等 查爾酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1145 A B GFP 和 VaCHS1 GFP 熒光蛋白表達 Expression of fluorescent protein of GFP and VaCHS1 GFP C E 灰霉病菌 霜霉病菌侵染表達 GFP 的 無核白 葉片 B cinerea and P viticola infect Thompson Seedless leaves expressing GFP D F 灰霉病菌 霜霉病菌侵染表達 VaCHS1 的 無核白 葉片 B cinerea and P viticola infect Thompson Seedless leaves expressing VaCHS1 圖 6 CHS1 的抗病功能驗證 Fig 6 Function verification of CHS1 in disease resistance 逆境環(huán)境的抵抗 15 CHS 是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵 酶 也是限速酶 16 查爾酮合成酶基因家族是個古老 的基因家族 具有高度保守性 17 目前為止 在鹽膚 木 金錢蓮 桑樹 海南龍血樹和高粱等多種植物中 都已克隆得到 CHS 本研究克隆到的 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 3個基因的 ORF 均為 1 182 bp 編碼 393 個氨基酸 與顯齒蛇葡萄 18 中克隆得到的 AgCHS1 和巨峰葡萄中克隆得到的 CHS4 19 的 ORF 長 度完全一致 說明 CHS 在同一科 屬的植物中具有高 度保守性 而在草地早熟禾 17 和鹽膚木 20 中克隆得到 的 PpCHS1 和 RcCHS 的 ORF 長度則為 1 170 和 1 173 bp 說明不同物種間的 CHS 存在一定差異 此外 1146 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 55卷 CHS 上游的啟動子包含一些特殊元件調(diào)控自身的表 達 例如銀杏 GbCHS 啟動子區(qū)存在紫外 藍光響應(yīng)單 元 植物激素響應(yīng)單元 真菌誘導(dǎo)元件 MYB 結(jié)合位 點 TATA box 和 CAAT box 等多個順式作用元件 21 龍血樹 DcCHS1 的啟動子區(qū)域中包含大量光應(yīng)答元 件 激素應(yīng)答元件 MBY 結(jié)合相關(guān)元件以及參與防御 和應(yīng)激反應(yīng)的富含 TC 的重復(fù)元件 22 小 麥 CHS 啟動 子上的 ABRE 脫落酸響應(yīng)原件 和茉莉酸甲酯的響 應(yīng)原件被外界條件刺激 病原體侵染 創(chuàng)傷和低溫脅 迫 后會誘導(dǎo) CHS 表達 8 本研究中抗霜霉病品種 雙 紅 的 VaCHS1 與感病品種 無核白 的 VvCHS1 之 間無氨基酸差異 推測抗病性差異可能與其基因上游 的啟動子序列差異有關(guān) 3 2 CHS 在各種脅迫下的表達變化 CHS 的表達受到多種外界環(huán)境刺激的控制 包括 紫外線 病原菌 創(chuàng)傷和生物鐘等各種生物和非生物 脅迫 23 研究表明 不同 CHS 受到不同的刺激 其表 達模式的變化也不盡相同 VvCHS1 和 VvCHS2 在受 到創(chuàng)傷時僅表現(xiàn)出輕微的上調(diào)表達 而 VvCHS3 則在 創(chuàng)傷后 8 h 表達量增加 5 倍 與創(chuàng)傷處理相比 UV C 和霜霉病菌處理后 3 個 VvCHS 的轉(zhuǎn)錄物積累則均 顯著減少 24 而在 CIAFFI 等 25 的研究中發(fā)現(xiàn) 在 不同基因型的葡萄品種中 3 種 VvCHS 組成型表達 量存在顯著差異 但這種差異與葡萄對霜霉病的抗 性并無顯著相關(guān)性 接種霜霉病菌后 在抗性較強 品種中 霜霉 病菌接種導(dǎo)致從感染的早期階段 16 24 hpi 開始 轉(zhuǎn)錄物積累穩(wěn)定且顯著減少 上述兩項 研究中 推測在抗性品種中 CHS 表達水平的下降是由 于與該基因具有相同催化底物的芪合酶表達量大幅提 高 二者對底物的競爭性抑制導(dǎo)致的 對霜霉病有較 強抵抗力的黃瓜品種 Jing Chun NO 4 受到黃瓜霜霉 病菌侵染后 CHS 在 25 hpi 到 30 hpi 時表達量增加了 5 倍以上 隨后又迅速降低 26 使用葡萄的寄主病原 菌 葡萄霜霉病菌和非寄主病原菌 黃瓜霜霉病 菌分別接種抗病葡萄 Gloire 和感病葡萄 Riesling 時 發(fā)現(xiàn)兩種病菌都能誘導(dǎo) CHS 的表達 但感病葡萄 Riesling 中 CHS 的表達量低于抗病葡萄 Gloire 值得注意的是 抗病品種中 CHS 有較弱的組成型表達 而在感病品種中則沒有 27 本研究分別用灰霉病菌侵 染 野釀二號 和 無核白 霜霉病菌侵染 雙紅 和 無核白 發(fā)現(xiàn)抗病品種 野釀二號 雙紅 中 VqCHS1 和 VaCHS1 在受到病原菌侵染后都可以誘 導(dǎo)上調(diào)表達 而感病品種 無核白 中 VvCHS1 的表 達量明顯低于 VqCHS1 和 VaCHS1 這與 QIAO 等 26 和 KORTEKAMP 27 的研究結(jié)果一致 說明 CHS 在抗 病葡萄抵抗灰霉病菌和霜霉病菌侵染過程中發(fā)揮重要 作用 CHS 可以通過催化形成不同的類黃酮化合物來 提高植物的抗病能力 也可通過改變植保素 26 黃酮 素 23 抗氧化酶 SOD 和 POD 9 等的積累以及防御酶 的活性來提高防御能力 在煙草中過表達或沉默 NtCHS 可以顯著提高或減少煙草葉片中總黃酮 綠 原酸 蕓香苷 花青素等物質(zhì)的含量 9 抗枯萎病的 棉花品種中 CHS 表達量明顯上調(diào)后 類黃酮的含量提 高從而增加其對枯萎病的抗性 28 本研究中在感病品 種 無核白 葉片中瞬時表達 VaCHS1 能夠提高對灰 霉病和霜霉病的抗病能力 但具體是通過何種途徑誘 導(dǎo) CHS 的表達還有待進一步驗證 4 結(jié)論 從不同抗性的葡萄品種 野釀二號 雙紅 無 核白 中分別克隆了 CHS1 該基因高度保守 主要 定位于細(xì)胞核 雖然 CHS1 受灰霉病菌和霜霉病菌 侵染后表達模式的變化不同 但抗性品種 野釀二 號 以及 雙紅 中 CHS1 的整體表達水平均顯著 高于感病品種 無核白 過表達 VaCHS1 可以顯 著提高 無核白 葉片對灰霉病和霜霉病的抗性 表明 CHS1 在葡萄抵御灰霉病和霜霉病的過程中發(fā) 揮重要的作用 參考文獻 References 1 王佳媛 海南龍血樹查爾酮合酶基因 DcCHS 的克隆及其啟動子 功能分析 D ???海南大學(xué) 2014 WANG J Y Cloning of chalcone synthase gene from Dracaena cambodiana and functional identification of its promoter D Haikou Hainan University 2014 in Chinese 2 王志彬 柑橘查爾酮合成酶基因遺傳多樣性及其功能研究 D 重 慶 西南大學(xué) 2019 WANG Z B Genetic diversity and functional study of chalcone synthase gene in citrus D Chongqing Southwest University 2019 in Chinese 3 ZHAO C Y WANG F LIAN Y H XIAO H ZHENG J K Biosynthesis of citrus flav