收稿日期 2021 02 24 基金項目 國家自然科學(xué)基金 31970345 31701059 資助 作者簡介 宗 寧 碩士研究 生 E mail 1412489149 通 信作者 苗 敏 副教授 E mail minmiao 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2021 48 6 916 922 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10 13610 ki 1672 352x 20220106 006 網(wǎng)絡(luò)出版時間 2022 1 7 8 15 44 URL 番茄 USP1 響應(yīng)干旱和高溫脅迫的研究 宗 寧 趙煥蘭 劉 奎 盧若兮 范葉珍 苗 敏 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 合肥 230601 摘 要 DDB1 作為 CUL4 泛素連接酶的核心組件參與細胞內(nèi)許多重要的生命活動 前期研究發(fā)現(xiàn)番茄 CUL4 DDB1 復(fù)合 物 CRL4 調(diào)節(jié)植物細胞的非生物脅迫應(yīng)答 為進一步闡明 DDB1 在植物抗逆中的調(diào)控機制和 生理功能 通過酵母雙雜交篩選 發(fā)現(xiàn)普遍應(yīng)激蛋白 USP1 與 DDB1 存在相互作用 USPs 家族蛋白參與提高生物 體對逆境脅迫的耐受 進一步研究發(fā)現(xiàn) USP1 定位于細胞質(zhì)中 且其基因表達受到多種脅迫條件誘導(dǎo) 此外泛素化 實驗揭示 USP1 可以被泛素化修飾降解 上調(diào) USP1 表達導(dǎo)致植株對干旱和高溫抗性的增強 表明 USP1 可能正調(diào) 控番茄植株對逆境下脅迫的應(yīng)答 且它的作用受 CUL4 DDB1 泛素連接酶的靶向降解調(diào)控 結(jié)果不僅揭示新的植物 抗逆機理 而且為植物抗逆分子育種提供新的基因資源和技術(shù)途徑 關(guān)鍵詞 番茄 USP1 CUL4 DDB1 泛素化修飾 環(huán)境脅迫 中圖分類號 S641 2 Q945 78 文獻標識碼 A 文章編號 1672 352X 2021 06 0916 07 Study on tomato USP1 in response to drought and high temperature stress ZONG Ning ZHAO Huanlan LIU Kui LU Ruoxi FAN Yezhen MIAO Min School of Food and Biological Engineering Hefei University of Technology Hefei 230601 Abstract As the core component of CUL4 ubiquitin ligase DDB1 participates in many important biological processes Our previous study found that tomato CUL4 DDB1 complex regulates abiotic stress response In order to further clarify the regulatory mechanism and physiological function of DDB1 in plant stress resistance we found that USP1 interacted with DDB1 through yeast two hybrid screening and USPs family proteins were in volved in improving the tolerance of organisms to stress Further studies found that USP1 was located in the cyto plasm and its gene expression was induced by a variety of stress conditions In addition ubiquitination experi ments revealed that USP1 could be degraded by ubiquitination modification and upregulation of USP1 expression led to the enhancement of plant resistance to drought and high temperature indicating that USP1 may regulate tomato plant response to stress and its role is regulated by the targeted degradation of CUL4 DDB1 ubiquitin lig ase The result not only reveal new mechanisms of plant stress resistance but also provide new gene resources and technical approaches for plant stress resistance molecular breeding Key words tomato USP1 CUL4 DDB1 ubiquitination environmental stress 植物在生 長發(fā) 育的過 程中 往往會受 到外 界環(huán)境 脅迫的影 響 例如紫 外線 輻射 干旱 鹽堿 重金 屬 高溫 或者 低溫以 及病 蟲害等 這些 逆境脅 迫會 嚴重阻 礙植 物的 正常 生長 甚至 導(dǎo)致 植物 死亡 1 2 面對環(huán)境 脅迫 植物 逐漸 進化出 了許多 策略來 克服 這些外界 壓力 這種 進化 來自于 植物在 習(xí)性 形態(tài) 或者生理 上的 變化 從而 以最大 化其生 存和繁 殖機 會的方 式優(yōu) 化其 生長 和發(fā) 育 3 4 普遍應(yīng)激蛋白 universal stress protein USP 最 早在 1990 年 發(fā)現(xiàn) 于大 腸桿菌 中 此后 陸續(xù) 在包 括細 菌 古細 菌 植物和 多細 胞動物 在內(nèi)的 多種生 物中 都發(fā)現(xiàn)了 該蛋 白 研 究發(fā) 現(xiàn) 該 蛋白在 細胞防 御信 號和抗 應(yīng)激 代謝 途徑 中有 很重要 的作 用 5 7 植物中 存在著 大量 的 USPs 蛋白 目 前 從不 同來 源的 植 物中一 共鑒 定到 了 2 141 種不同 形式的 USPs 8 所 有 的蛋 白質(zhì)都 包含 至少一個 USP 結(jié)構(gòu) 域和其 他的48 卷 6 期 宗 寧等 番茄 USP1 響應(yīng)干旱 和高溫脅迫的研究 917 催化基序 它 們在特 定的 組織 器官和 發(fā)育階 段或 在不同 的應(yīng) 激條 件下 的表 達存在 差異 9 10 USPs 在 保護植物 免受 脅迫方 面具 有不同 的功能 擬南 芥中 的 USP 蛋白 HRU1 能夠 調(diào) 節(jié)缺氧 條件 下細 胞內(nèi) 過氧 化氫 H 2O 2 的水平 11 擬南芥中的另一種 USP AtUSP 在植物受到熱刺 激或者氧化應(yīng)激時 其存 在形式會 產(chǎn)生 變化 從而 影響到 酶的活 性 提 高植 物對熱或者氧化應(yīng)激的抗性 12 同時 Melencion 等 發(fā) 現(xiàn)在 低溫下 AtUSP 的 mRNA 水 平顯著 提高 13 說明 AtUSP 在保 護植 物免受 低 溫的 傷害 方面 也發(fā) 揮 著生理 功能 煙 草中 SbUSP 的異 位表 達通 過去 除細 胞內(nèi)活性 氧來 增強對 滲透 脅迫的 抗性 顯著增 強煙 草 的耐 鹽性 14 除了 非生物 脅迫 USPs 在植 物遭 受生物 脅迫 時也 能發(fā) 揮作 用 15 16 泛素 蛋白酶體系統(tǒng) ubiquitin proteasome system UPS 介導(dǎo)了真核生物 80 85 的蛋白質(zhì)降解 17 是重要的 負調(diào) 節(jié)蛋白 水平 的機制 底物 的泛素 化是 由 3 種酶的連續(xù)活性完成的 分別是泛素化酶 ubiquitin activating enzyme E1 泛素結(jié)合酶 ubiquitin conjugating enzyme E2 和泛素連接酶 ubiquitin ligase E3 18 被泛素 化修 飾的 蛋白 大部 分通過蛋 白酶 體系統(tǒng) 降解 也有 部分修 飾后的 蛋白 會改 變細胞定位和 活性 有研 究發(fā)現(xiàn) 受 損 DNA 結(jié)合蛋 白 1 DDB1 是 CULLIN4 CUL4 RING E3 連 接酶復(fù) 合物 的核 心組 分 19 CUL4 與 DDB1 和另 一 種 DDB1 的相 互作 用蛋白 DDB1 CUL4 相關(guān)因 子 DDB1 CUL4 associated factor DCAF 組裝 形 成基 于 DDB1 CUL4 的泛素連 接酶 CRL4 家族 1 作為 CRL4 泛素連接酶復(fù)合體的重要組成部分 DDB1 由 3 個 WD40 propeller 結(jié)構(gòu) 域 BPA BPB 和 BPC 和一個 C 末端螺旋結(jié)構(gòu)域組成 20 BPB 介導(dǎo)與 CUL4 的相 互作 用 而 BPA 和 BPC 可 以與 CRL4 泛素連 接酶 的底 物受 體 DCAF 結(jié)合 21 DCAF 與靶 向底物 結(jié)合 番 茄中 有 100 多個 DCA F 接合蛋白 識別不同底物蛋白而參與 各種生命活動 22 DDB1 作為 CRL4 泛素連 接酶 的 核心組 分參 與調(diào) 控番 茄中 的多種生 理活 動 包 括葉 綠體發(fā) 育和次 生代謝 的調(diào) 節(jié) 細胞 增殖 的表觀 遺傳 調(diào)控以 及生物 與非生 物的 應(yīng)激反 應(yīng) 18 23 25 前期的 研究 發(fā)現(xiàn) DDB1 與幾 個 DCAF 參與高 鹽 紫外和干旱的脅迫 應(yīng) 答 1 25 但參與這一進程 的靶向 底物 未知 為了 進 一步探 究 DDB1 在非 生物 脅迫應(yīng)答 中調(diào) 控機制 以及 哪些蛋 白底物 參與其 中 本課題 進行 了以 番茄 DDB1 為誘餌 蛋白 的酵 母雙 雜 交篩選 得 到了 一個 USPs 蛋白 稱為 USP1 universal stress protein 1 本 研究 中 我 們驗 證了 DDB1 與 USP1 的相互作用 并且證明了 USP1 可以作為 CRL4 泛素連接酶復(fù)合體 的底物被泛素化降解 同 時發(fā)現(xiàn) 過表 達 USP1 的番茄 植 株能 夠顯 著增 強對 于 干旱以 及高 溫脅 迫的 抗性 證明 了 USP1 可以 參與 到番茄植 株對 于上述 非生 物脅迫 的耐受 性的調(diào) 控之 中 且極 有可 能通過 DDB1 介導(dǎo) 的 USP1 泛素 化降 解參與 調(diào)控 脅迫 應(yīng)答 1 材料與方法 1 1 材料 本研究所用的野生型 wild type WT 番茄 Solanum lycopersicum Mill cv Ailsa Craig 來 自美 國康奈爾大學(xué) THOMPSON 植物研究所 煙草 Nicotiana benthamiana 來自美國愛德華大學(xué) Fangming Xiao 副教授 均由本實 驗室繁 育保存 大腸桿菌 Escheriachia coli DH5 根瘤農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens GV2260 EHA105 LBA4404 購自 上海 唯地 生 物有限 責(zé) 任公 司 酵 母菌 EGY48 Saccharomyces cerevisiae 由本實 驗室 保存 1 2 方法 1 2 1 USP1 的亞細胞定位 根據(jù) USP1 基因的 CDS 序列 Solyc04g014600 2 1 設(shè)計特異性引物 USP1FKpn I 和 USP1RSal I 引物信 息見 表 1 以 擴增 去除了 終止 密碼 子的 目的 片段 將 PCR 產(chǎn) 物連 接到 PART27 MCS GFP 載體 Kpn I 和 Xho l 酶切 上 將 構(gòu)建好 的重 組質(zhì) 粒 PART27 USP1 GFP 轉(zhuǎn)入 大腸 桿 菌 DH5 將成功轉(zhuǎn)化 的 菌株測序驗證 提取重 組 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿菌 GV2260 中 并 通過 注射 法侵 染生 長 1 個月 大小 的本 氏煙 草葉 片 黑暗 放置 36 h 后用 激光共聚 焦顯 微鏡觀 察煙 草葉片 細胞中 綠色熒 光蛋 白的分 布情 況 1 2 2 CO IP 實驗 在生長 4 周 齡的 煙草 葉片 中利 用煙草瞬 時表 達得到 總蛋 白 再 用蛋白 提取緩 沖液 提取 蛋白提取緩沖液含有 50 mmol L 1 Tris HCl pH7 5 150 mmol L 1 NaCl 5 mmol L 1 乙二胺四乙酸 EDTA 2 mmol L 1 二硫蘇糖醇 DTT 10 甘油 Glycerol 1 聚乙烯吡咯烷酮 PVPP 0 1 mol L 1 苯甲 基磺酰氟 PMSF 和 100 植物蛋 白酶 抑制 劑 蛋白 提取液 與 15 L Anti HA 磁 珠于 4 孵育 2 h 將磁 珠 清洗 3 次 后加入 5 蛋 白 loading buffer 95 煮樣 5 min 再進 行蛋 白免 疫印跡 1 2 3 RNA 提 取和 定量 PCR 分析 Trizol 法提 取番 茄 USP1 轉(zhuǎn)基因植株以及野生型植株幼嫩葉片的918 安 徽 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2021 年 RNA 提取 后的 RNA 用 HiScript 反轉(zhuǎn) 錄試 劑盒 反轉(zhuǎn)錄 為 cDNA 再進 行定 量 PCR 的分 析 定量 引 物為 USP1qPCRF 和 USP1qPCRR 引物 信息 見表 1 同 時 以番茄 UBI3 作為 內(nèi)參 基因 1 2 4 酵 母雙 雜交 實驗 根據(jù) USP1 基因的 CDS 序 列 Solyc04g014600 2 1 設(shè)計特異性引物 USP1FEcoR I 和 USP1RXho l 以野 生型 番茄 cDNA 為模板擴 增得 到包含 終止 密碼子 的基因 片段 將基 因片段 連接 到 PJG4 5 載體上 獲 得重 組質(zhì) 粒 重 組質(zhì) 粒測序 驗證 正確 后與 誘餌 質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)化 到 EGY48 酵 母感受 態(tài)中 于 營養(yǎng) 缺陷 型三缺 培養(yǎng) 基 Ura His Trp 進行篩選 培養(yǎng) 將 克 隆轉(zhuǎn)至 顯色 培養(yǎng) 基 Ura His Trp X gal 中驗證 相互作 用 表 1 本研究所用引物信息 Table 1 Primer information used in this study 名稱 序列 5 3 USP1F CATATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1R TCTTCCCAATCTCACAAATGAAAC USP1FKpn I GTAGGTACCATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1RSal I GATGTCGACCTTTTGAGGACTGGTTTTCAC USP1qPCRF GTAATTGGAGGCAGAGGCTTAG USP1qPCRR CAGTAACAGGACATGTTGCATTT USP1FEcoR I CCGGAATTCATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1RXho l CCGCTCGAGTTCCCAATCTCACAAATGAAACA pJG4 5F CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG pJG4 5R AAGCCGACAACCTTGATTGGAG pEG202F CGTTGTCGCACGTATTGATG pEG202R ATAAGAAATTCGCCCGGAAT NPT IIF AGACAATCGGCTGCTCTGAT NPT IIR TCATTTCGAACCCCAGAGTC UBI3RTF AGGTTGATACACTGGAAAGGTT UBI3RTR AATCGCCTCCAGCCTTGTTGTA 1 2 5 USP1 過表 達載 體的 構(gòu)建 和轉(zhuǎn) 基因 植株 的獲 得 根據(jù) 番茄 USP1 基因 Solyc04g014600 2 1 的序 列設(shè)計引物 USP1F USP1R USP1FKpn I 和 USP1RSal I 用巢 式 PCR 擴增得 到目 的基 因片 段 使用限 制性 內(nèi)切 酶 Kpn I 和 Sal I 以及 T4 DNA 連接 酶將基 因連 接到 帶有 35S 啟動子 的 PBI121 載體 上 載體帶 有 NPT II 篩選標記 將構(gòu)建 好的 載體 轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿 菌 LBA4404 中 再利 用 農(nóng) 桿菌 介導(dǎo) 的轉(zhuǎn) 化得到 PBI121 35S USP1 轉(zhuǎn) 基因 愈傷組 織 愈傷 組織 在含 有卡那 霉素 的 MS 篩 選培 養(yǎng)基上 分化 生長 待長 成苗 型后移 入營 養(yǎng)土 中栽 培 提取轉(zhuǎn) 基因 植株 的葉 片 DNA 采 用 PCR 擴增 標記 基因 NPTII 引物信息見 表 1 和定量 PCR 進行 轉(zhuǎn)基 因植株 的鑒 定 1 2 6 USP1 過表達 植株的 脅迫 處理 選取 長勢相 同的 4 周齡 的 USP1 過表達 植 株進 行脅 迫處 理 對 照 組 與處 理組 均保持 14 h 光照 10 h 黑暗 高溫 脅 迫處理將 番茄 植株放 置于 40 人 工氣候 箱 正常 澆水 干 旱脅 迫處理 則將 番茄植株 置于 25 的 溫 室內(nèi) 并 停止 澆水 對照 組的番茄 均生 長于 25 的溫室 內(nèi) 正常 澆水 種子萌發(fā)實驗選取剛露白的種子置于相應(yīng)的 1 2 MS 培養(yǎng) 基上 在 25 的溫 室內(nèi) 14 h 光照 10 h 黑暗 條件 下生 長 2 結(jié)果與分析 2 1 USP1 的基 因表 達模式 分 析及 亞細 胞定 位 為了探 究 USP1 基因 的表 達模式 根 據(jù) USP1 基 因的 Locus ID Solyc04g014600 2 1 在 番茄 基因 表 達 數(shù)據(jù) 庫網(wǎng)站 TomExpress http tomexpress tou louse inra fr 查詢了USP1 基因在 番茄 不同 組織 器官 及不同 生長 時期 的表 達量 發(fā)現(xiàn) USP1 基 因在 番茄 的種子 分生 組織 花以 及果實 中均有 表達 其中 在種子 和果 實的 表達量 較高 圖 1 通過構(gòu) 建含 有 GFP 標 記的 USP1 融合 蛋白 載 體 對 USP1 的亞 細胞 定 位進行 了探 究 同時 設(shè)置 了 GFP 空載作 為對照 USP1 GFP 融合蛋 白以 及 GFP 蛋白 均通 過農(nóng) 桿菌 介 導(dǎo)的侵 染在 煙草 葉片 中瞬 時表達 侵染 的煙 草葉 片 在黑暗 中放 置 36 h 后 于激 光 共 聚焦 顯微 鏡下 觀察 通 過 觀察 可以 發(fā)現(xiàn) USP1 蛋白主 要在 細胞 質(zhì)中 表達 圖 2 48 卷 6 期 宗 寧等 番茄 USP1 響應(yīng)干旱 和高溫脅迫的研究 919 圖 1 番茄 USP1 基因的表達模式 Figure 1 Expression pattern of USP1 gene in tomato 2 2 USP1 在不 同脅 迫誘導(dǎo) 下 的表 達量 分析 為了探 明 USP1 基因 的表達 是 否受 脅迫 條件 的 影 響 我們 選用 5 周齡 的野 生型番 茄 AC 進行 了脅 迫誘導(dǎo)實驗 高溫脅迫處理組的番茄植株放置于 40 人工 氣候箱 中 正 常澆水 分 別于 0 2 6 和 10 h 后 取樣 用于 定量 分析 NaCl 處理 組置 于 25 溫 室中 用 300 mmol L 1 的 NaCl 進行 澆灌 在處理 后 0 12 24 和 48 h 取 樣分 析 模 擬干 旱處 理組置于 25 溫室中 用 400 mmol L 1 的 Mannitol 進 行澆 灌 在處理 后 0 12 24 和 48 h 取 樣 分 析 所有 處理 組光 照周 期 均保持 14 h 光照 10 h 黑 暗 脅迫 處理 定量 PCR 結(jié)果 表明 番 茄植 株在 高 溫 鹽和模 擬干 旱脅迫處 理后 USP1 基因 的表 達量均產(chǎn)生了明顯的變化 圖 3 這種變化說明 USP1 基 因確實 參與 到了番 茄在 應(yīng)對高 溫 鹽以 及 干旱脅 迫的 調(diào)控 之中 為 后續(xù)的 實驗 探明 了方 向 GFP 綠色熒光蛋白 DAPI 細 胞核染料 Bright 明視 野 Merge 疊加場 圖 2 USP1 的亞細胞定位 Figure 2 Subcellular localization of USP1 2 3 USP1 與 DDB1 存在相 互 作用 USP1 蛋 白與 DDB1 蛋白之 間 的相 互作 用通 過 酵母雙 雜交 系統(tǒng) 得到 了驗 證 將 PEG202 DDB1 與 PJG4 5 USP1 共同 轉(zhuǎn)化到 EGY48 酵母 感受 態(tài)中 同 時設(shè)置 PEG202 空載 和 PJG4 5 USP1 的組 合為 負對 照 可以明 顯觀察到 在 三缺顯色培 養(yǎng)基 Gal Raff Ura His Trp X gal 上 含 有 PEG202 DDB 1 和 PJG4 5 USP1 質(zhì) 粒的 EGY48 酵母 可以 顯現(xiàn) 出藍 色 圖 4A 而 負對 照沒 有任何 變 色的 跡象 圖 4C 同 時正對 照在 三缺 顯色 平板 上可以 正常 顯色 圖 4B 說明 USP1 與 DDB1 在酵母 中 存在 相互 作用 但 可 能因為 酵母 是異 源系 統(tǒng) 所以 USP1 與 DDB1 的相 互作用 在酵 母中 表現(xiàn) 得較 弱 a 熱脅迫 b NaCl 脅迫 c 甘露醇脅迫 圖 3 USP1 在不同脅迫下的表達量 Figure 3 Expression of USP1 under different stress 為 了 進一 步驗證 USP1 與 DDB1 的相 互作 用 我們進 行了 免疫 共沉 淀實 驗 在免 疫共 沉淀 實驗 中 DDB1 HA 和 USP1 Flag 在煙草 葉片 中共 表達 同 時以 DDB1 HA 和 GFP Flag 共表 達 作為 對照 組 這 幾種蛋白 在總蛋 白 Input 中都可以 檢測得 到 說 明 所有的蛋 白在 煙草瞬 時表 達系統(tǒng) 中均正 常表達 而 在免疫 沉淀 部分 IP 則只 能檢測 到 USP1 蛋白 的存 在 GFP 蛋白 未被 檢測 到 圖 5 這 表 明 USP1 Flag920 安 徽 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2021 年 蛋白連 同 Anti HA 免 疫磁珠 和 DDB1 HA 蛋白 一同 被 沉 淀了 下來 說明 USP1 蛋白 與 DDB1 蛋白 在植 物細胞 體內(nèi) 存在 著相 互作 用 且相 互結(jié) 合能 力較 強 圖 4 USP1 與 DDB1 在酵母中有相互作用 Figure 4 USP1 interacts with DDB1 in yeast 圖 5 USP1 與 DDB1 的免疫共沉淀分析 Figure 5 Immuno precipitation analysis of USP1 and DDB1 由酵母雙 雜交 實驗和 免疫 共沉淀實 驗可 以得出 USP1 與 DDB1 之間 確實存 在 著相 互作 用 這也 為 后面我 們探 究 USP1 的泛素 化 和功 能性 質(zhì)奠 定了 基 礎(chǔ) 2 4 USP1 可以 被泛 素化 我 們 已經(jīng) 驗證了 USP1 與 DDB1 之間 存在 著相 互作用 而 DDB1 與 CUL4 可以 形成 CRL4 泛素連 接酶復(fù)合體 1 所以猜測 USP1 可以作為底物被 CRL4 泛素化 修飾 為 了 探究 USP1 是否 可以 被泛 素 化 修飾 將 Ub HA 與 USP1 Flag 在煙草 葉片 中共 同表達 同時 設(shè)置 Ub HA 與 GFP Flag 作為對照 組 由免疫 共沉 淀實 驗結(jié) 果可 知 Ub HA 與 USP1 Flag 可以被共 同沉淀下來 在 IP 部分 被檢測到 同 時 USP1 Flag 在 IP 部分的 條 帶呈現(xiàn) 出多 泛素 化修 飾的 典型彌散 的狀 態(tài) 而 作為 對照組 的其他 兩組合 沒有 在 IP 部分 中檢 測到 條帶 圖 6 這 說明了 USP1 可 以與泛素 分子 結(jié)合受 到多 泛素化 修飾 多泛素 化修 飾的蛋 白經(jīng) 由 26S 蛋 白酶體 降 解 圖 6 USP1 的泛素化實驗 Figure 6 Ubiquitination of USP1 圖 7 USP1 OE 植株 RNA 水平鑒定 Figure 7 RNA level identification of USP1 OE plants 2 5 過 表達 USP1 可以 提 高番茄 植株 對于 脅迫 的耐 受性 USP1 在受 不同 脅迫 環(huán)境 中的 誘 導(dǎo)表 達 干旱 高 溫 高鹽 脅迫 條件 下 USP1 基因 表達 量均 有顯 著的提 高 為了 進一 步驗 證 USP1 基 因在 對于 番茄 逆境脅迫 中的 生物學(xué) 功能 利用 根癌農(nóng) 桿菌介 導(dǎo)的 轉(zhuǎn) 化 獲得了 USP1 的 過表 達植株 USP1 OE 經(jīng) 過 定 量 PCR 鑒 定 結(jié)果 顯示 5 個 USP1 OE 株系 中 USP1 基因的 表達 上調(diào) 均 為陽 性株系 圖 7 選 取其 中的 3 個 株系 用于 脅迫 實驗 同時 以 野生 型番 茄 AC 作 為對照 脅 迫實 驗選 取 4 周齡健 康植 株 在高 溫脅 迫 處理 5 d 干旱 脅迫 處理 3 周 后 AC 與 USP1 OE 的生長狀 況出 現(xiàn)了明 顯的 差異 可以看 到 相 較于 野生型 番茄 AC 圖 8A C USP1 OE 圖 8B D 的 生長狀 態(tài)良 好 這說明 USP1 的 過表 達可 以顯 著提 高番茄 植株 對于 干旱 以及 高溫脅 迫的 耐受 性 此 外 還選取 了 OE 2 株系在 1 2 MS 培 養(yǎng)基 上進 行了 番茄 種子萌 發(fā)實 驗 在添 加 450 mmol L 1 的 1 2 MS 培養(yǎng)48 卷 6 期 宗 寧等 番茄 USP1 響應(yīng)干旱 和高溫脅迫的研究 921 基上生 長 6 d 后 OE 2 株 系的生 長狀 況明 顯好 于野 生型 表現(xiàn) 為 OE 2 株系 根系的 長度 要明 顯比 AC 長 同 時 在不 添加 脅迫 條件 的 1 2 MS 培養(yǎng) 基上 USP1 過 表達株 系和 野生型 的生 長狀況 無明 顯差 異 圖 9 說 明過 表達 USP1 也可以 增強 番茄 幼苗 耐受 干旱脅 迫的 能力 高溫脅迫 干旱脅迫 A C 分別表示高溫和干旱脅迫 的野生 OE 2 植株 B D 分別表示高溫和干旱脅迫的 USP1 OE 植株 圖 8 USP1 過表達顯著增強番茄對于高溫及干旱的耐受性 Figure 8 Overexpression of USP1 significantly enhanced tomato tolerance to high temperature and drought 圖 9 USP1 過表達對番茄幼苗生長發(fā)育的影響 Figure 9 Effects of USP1 overexpression on the growth and development of tomato seedlings 3 討論與結(jié)論 在本研 究中 我 們分 析了 USP1 的表 達模 式 發(fā)現(xiàn) USP1 在番 茄植 株中表 達 廣泛 通 過亞 細胞 定 位揭示 了 USP1 主要 在細胞 質(zhì) 中表 達 并且 發(fā)現(xiàn) USP1 在環(huán) 境脅 迫的 條件 下 其 表達 量會 發(fā)生 變化 這種變化 在干 旱和高 溫脅 迫中表 現(xiàn)的尤 為明顯 這 說明 USP1 在番 茄遭 受這幾 種 環(huán)境 脅迫 時會 發(fā)揮 作 用 為 了探 究 USP1 在番茄 體 內(nèi)作 用的 機制 根 據(jù) 之前的 研究 發(fā)現(xiàn) 我 們驗 證了 USP1 與 DDB1 之間 的相互 作用 而 DDB1 作為 CRL4 泛素連 接酶 復(fù)合 體的關(guān) 鍵組 成部 分 1 這 種相互 作用 說明 USP1 可 以作為 底物 被 CRL4 泛素 化降解 泛 素化 實驗 印證 了 這一 觀點 USP1 可以與 泛素 分子結(jié) 合并 且被 泛 素化修 飾 但連 接 DDB1 與 USP1 的接 合蛋 白 DCAF 在本研 究中 尚未 探究 根據(jù)之前的研 究 USPs 家族基因在包 括擬南 芥 煙草 水 稻等多 種植 物中 都具有 提高植 物對 于逆境 脅迫 耐受 性的 功能 8 為 了進 一步 說明 USP1 對于番茄 植株 在面對 環(huán)境 脅迫的 具體作 用 我 們構(gòu) 建了 USP1 的過 表達 植株 USP1 OE 選取 了干 旱和 高 溫 脅迫對 USP1 OE 植株進 行 處理 實驗 結(jié)果 印證 了 我 們的 假設(shè) USP1 OE 植株對 于干 旱和 高溫 脅迫 的耐受 性要 明顯 強于 野生 型 對照 組 同 時 我 們 還發(fā)現(xiàn) USP1 OE 植株在 形態(tài)上與 野生型 番茄植 株 有明顯的 不同 過表 達植 株的葉 片更寬 葉子 的裂 片更小 顏色 更綠 這些 形態(tài)上 的差別 極有可 能是 轉(zhuǎn)基因 植株 抗逆 性強 的原 因之一 總而言之 USP1 能夠響應(yīng)番茄植株遭受的各種 環(huán)境脅迫 并且能 夠顯著 提高番茄植 株對于 干旱和 高溫脅迫的 耐受性 但對 于高鹽脅迫 的耐受 性并未 改變 500 mmol L 1 NaCl 處理后 野生型與轉(zhuǎn)基因 植 株生長 狀態(tài)相 似 番 茄植 株在脅 迫環(huán)境 下 USP1 的表達量會顯著升高 圖 3 來響應(yīng)外界脅迫 提升 對于脅迫的耐受性 此時 USP1 蛋白的數(shù)量維持在一 個較高的水平 而 DDB1 會進入細胞核中 啟動其 他抗逆基因的表達 當(dāng)外界脅迫消失時 DDB1 會進 入細胞質(zhì)中 此時 USP1 可以通過 CUL4 DDB1 組成 的 CRL4 泛素連接酶復(fù)合體進行泛素化降解 通過泛 素化 的 途徑 來維持 USP1 蛋 白的數(shù) 量在 一個合 適的 水平 以保 證植株 的正常 生長 下一 步的研 究方向 是構(gòu)建 USP1 的敲除轉(zhuǎn)基因植株 結(jié)合 USP1 OE 植 株 探究在逆境脅迫中 USP1 對于下游的相關(guān)基因 的表達和 ROS H 2O 2 植物激素等與抗逆相關(guān)的物 質(zhì)含量的影響 以及 USP1 轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)的差別對922 安 徽 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2021 年 于其抗逆性的關(guān)系 構(gòu)建一條完整的 USP1 對于番茄 植株抗逆作用機制的通路 參考文獻 1 MIAO M ZHU Y Y QIAO M J et al The tomato DWD motif containing protein DDI1 interacts with the CUL4 DDB1 based ubiquitin ligase and plays a pivotal role in abiotic stress responses J Biochem Biophys Res Commun 2014 450 4 1439 1445 2 周少燕 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)分析 J 南方農(nóng)業(yè) 2016 10 12 177 180 3 VINOCUR B ALTMAN A Recent advances in engi neering plant tolerance to abiotic stress achievements and limitations J Curr Opin Biotechnol 2005 16 2 123 132 4 烏鳳章 王賀 新 徐國 輝 等 木本植 物低 溫脅 迫生 理及 分子機制 研究進 展 J 林業(yè)科學(xué) 2015 51 7 116 128 5 KVINT K NACHIN L DIEZ A et al The bacterial uni versal stress protein function and regulation J Curr Opin Microbiol 2003 6 2 140 145 6 SIEGELE D A Universal stress proteins in Escherichia coli J J Bacteriol 2005 187 18 6253 6254 7 KERK D BULGRIEN J SMITH D W et al Arabidopsis proteins 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