38 2 421 427 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2021 02 22 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2017YFD0701301 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程 CAAS ASTIP IVFCAAS 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種 質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 寧夏瓜菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 2017DC55 作者簡(jiǎn)介 共同第一作者 苑寶潔 碩士研究生 E mail 1160893665 李磊 副研究員 E mail lilei01 通信作者 謝 學(xué)文 副研究員 E mail xiexuewen 李寶聚 研究員 E mail libaoju DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 06 016 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果 苑寶潔 1 2 李 磊 1 張紅杰 2 石延霞 1 柴阿麗 1 謝學(xué)文 1 李寶聚 1 1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 北京 100081 2 河北北方學(xué)院 張家口 075000 摘要 黃瓜細(xì)菌性角斑病是近年來危害嚴(yán)重的黃瓜病害之一 嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致黃瓜大面積減產(chǎn) 本實(shí)驗(yàn)室從 黃瓜根際土壤中篩選得到一株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病菌有顯著抑制效果的生防細(xì)菌 ZF145 經(jīng)菌落形態(tài)觀察 生理生化測(cè)定 Biolog 測(cè)定和多基因序列分析 鑒定菌株 ZF145 為貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis 該 菌株在平板離體試驗(yàn)中的抑菌圈直徑為 5 60 cm 抑制率為 62 22 在盆栽和田間試驗(yàn)中 貝萊斯芽胞桿 菌 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病有顯著的防治效果 盆栽防效為 71 10 田間防效為 61 30 平板對(duì)峙和 雙層培養(yǎng)試驗(yàn)證明菌株 ZF145 具有較為廣譜的抑菌效果 可以明顯抑制 6 株病原細(xì)菌和 8 株病原真菌的生 長(zhǎng) 綜上 菌株 ZF145 生防性狀優(yōu)良 在植物病害生物防治中有一定應(yīng)用潛力 關(guān) 鍵 詞 黃瓜細(xì)菌性角斑病 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 防治效果 中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 02 0421 07 Screening of Antagonistic Bacteria against Bacterial Angular Leaf Spot of Cucumber and Its Control Effect YUAN Baojie 1 2 LI Lei 1 ZHANG Hongjie 2 SHI Yanxia 1 CHAI Ali 1 XIE Xuewen 1 LI Baoju 1 1 Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China 2 Hebei North University Zhangjiakou 075000 China Abstract In recent years bacterial angular leaf spot is one of the most serious cucumber diseases which can lead to yield reduction in a large area An antagonistic bacterium ZF145 with significant inhibitory effect on bacterial angular leaf spot was isolated from the rhizosphere soil of cucumber Based on colony morphology physiological and biochemical analysis biolog analysis and multi gene phylogenetic tree analysis the strain ZF145 was identified as Bacillus velezensis Plate inhibition test showed that the diameter of inhibition zone was 5 60 cm and the inhibition rate was 62 22 but pot and field experiments indicated that the control effect on bacterial angular leaf spot was 71 10 and 61 30 respectively The antagonistic experiments showed that strain ZF145 had a broad spectrum antibacterial effect which can significantly inhibit the growth of six pathogenic bacteria and eight pathogenic fungi In conclusion strain ZF145 had excellent biocontrol properties and had a certain application potential in biological control of plant diseases Key words bacterial angular leaf spot of cucumber Bacillus velezensis ZF145 control effect 黃瓜細(xì)菌性角斑病是由扁桃假單胞流淚致病變種 Pseudomonas amygdali pv Lachrymans 侵染引起的一 種細(xì)菌性病害 1 2 該病在苗期和成株期均可發(fā)生 苗期以子葉危害為主 成株期以葉片 葉柄以及卷須危 害為主 發(fā)生嚴(yán)重時(shí)還可造成莖蔓和果實(shí)的危害 3 5 嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌主要在種子 422 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 內(nèi)或隨病殘?bào)w殘留在土壤中存活 也可從傷口或氣孔侵入對(duì)黃瓜造成危害 6 目前 黃瓜細(xì)菌性角斑病的 防治主要依靠銅制劑及農(nóng)用抗生素等 與殺真菌的藥劑相比種類單一 且長(zhǎng)期使用單一藥劑易造成抗藥性 增強(qiáng) 7 因此 有針對(duì)性地篩選黃瓜細(xì)菌性角斑病菌拮抗菌株 開發(fā)可以防治黃瓜細(xì)菌性角斑病的微生物 殺菌劑是病害生物防治研究的重要方向 芽胞桿菌具有強(qiáng)大的繁殖能力 對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高 在各種復(fù)雜的環(huán)境下都能夠生存等優(yōu)點(diǎn) 在生物防 治中有巨大的開發(fā)潛力 已經(jīng)報(bào)道的能防治植物病害的芽胞桿菌主要有枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis 多 粘類芽胞桿菌 Paenibacillus polymyxa 蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis 地衣芽胞桿菌 Bacillus licheniformis 蠟樣芽胞桿菌 Bacillus cereus 側(cè)孢芽胞桿菌 Bacillus laterosporus 短小芽胞桿菌 Bacillus pumilus 和貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis 等 8 9 本試驗(yàn)旨在從黃瓜根際土壤中篩選出高效的生防細(xì)菌 并對(duì)其抑菌效果進(jìn)行初步研究 以期為黃瓜細(xì) 菌性角斑病的生物藥劑開發(fā)提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 1 1 1 供試菌株 胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種 Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum 扁桃假單 胞流淚致病變種 Pseudomonas amygdali pv lachrymans 丁香假單胞番茄致病變種 Pseudomonas syringae pv tomato 西瓜嗜酸菌 Acidovorax citrulli 野油菜黃單胞野油菜致病變種 Xanthomonas campestris pv campestris 密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種 Clavibacter michiganense subsp sepedonicums 茄匍柄霉 Stemphylium solani Weber 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 炭疽菌 Colletotrichum sp 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 尖孢鐮孢菌 Fusarium oxysporum 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 西瓜殼二孢菌 Ascochyta cittulina Smith 茄鏈格孢菌 Alternaria solani 以上菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所保存 1 1 2 供試培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 g 氯化鈉 10 g 酵母提取物 5 g 瓊脂 18 g 1 L 蒸餾水 用于拮抗菌株的分離和培養(yǎng) NA 固體培養(yǎng)基 牛肉膏 3 g 蛋白胨 10 g 氯化鈉 5 g 瓊脂 18 g 1 L 蒸 餾水 用于病原細(xì)菌的培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn) NB 液體培養(yǎng)基 牛肉膏 3 g 蛋白胨 10 g 氯化鈉 5 g 1 L 蒸 餾水 用于病原細(xì)菌菌懸液的搖培 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂粉 15 g 1 L 蒸餾水 用于病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn) 1 1 3 供試黃瓜品種 黃瓜品種 中農(nóng) 6 號(hào) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育 1 2 拮抗細(xì)菌的分離及純化 先將從河北滄州 山東濰坊 壽光 北京通州 大興等地區(qū)采集的黃瓜根際土壤樣品中稱取 10 g 土樣放 入裝有 90 mL 無菌水的三角瓶中 置于 28 180 r min 的搖床上震蕩 30 min 土壤樣品充分懸浮后取出置 于 80 的水浴鍋中水浴 10 min 然后將土壤樣品按 10 4 10 5 10 6 進(jìn)行梯度稀釋 每個(gè)梯度吸取 100 L 于 LB 平板上涂布 置于 28 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 菌落長(zhǎng)出后選取不同形態(tài)經(jīng)平板劃線法進(jìn)行純化后保 存編號(hào) 備用 10 12 1 3 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選 以黃瓜細(xì)菌性角斑病為靶標(biāo)菌 采用雙層培養(yǎng)法 12 對(duì) 1 2 分離的拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選 首先將活化好的 拮抗細(xì)菌和病原菌用無菌接種針挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到 LB 和 NB 液體培養(yǎng)基中 置于 28 180 r min 搖床上振蕩培養(yǎng) 24 h 制成菌懸液備用 在 90 mm 的 LB 固體培養(yǎng)皿中央點(diǎn)入 5 L 待測(cè)拮抗細(xì)菌菌懸液 于 28 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 24 h 待測(cè)拮抗細(xì)菌長(zhǎng)出后取出培養(yǎng)皿倒置放入通風(fēng)櫥中 在每個(gè)培養(yǎng)皿的蓋 子里加入 3 mL 氯仿 放置 12 h 取出 在 4 mL 5 水瓊脂中加入 100 L 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸液 混勻后 倒入 LB 平板中 作為上層 置于 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后取出觀察抑菌圈 并采用十字交叉法對(duì)抑菌 圈的直徑進(jìn)行測(cè)量 計(jì)算抑制率 抑菌率 抑菌直徑 對(duì)照菌落直徑 100 1 4 拮抗細(xì)菌 ZF145 的鑒定 1 4 1 菌株 ZF145 形態(tài)觀察和生理特性測(cè)定 采用三線法用接種環(huán)挑取活化好的單菌落在 LB 固體平 板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線 置于 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后取出觀察其菌落的顏色 形態(tài)和大小 依據(jù) 伯 第 2 期 苑寶潔等 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果 423 杰細(xì)菌鑒定手冊(cè) 第八版及 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 28 培養(yǎng) 24 48 h 后 對(duì)生理生化特征進(jìn) 行鑒定 13 1 4 2 Biolog 測(cè)定 挑取菌株 ZF145 單菌落接種至 LB 培養(yǎng)基試管斜面上 28 培養(yǎng) 24 h 由中國(guó)農(nóng)業(yè) 微生物菌種保藏中心使用 BIOLOG GEN 試劑盒 按照試劑盒說明書操作 對(duì)菌株 ZF145 進(jìn)行唯一碳源 利用的測(cè)定 1 4 3 多基因擴(kuò)增及序列分析 采用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒 試劑盒購(gòu)北京自天根生化科技有限公 司 提取菌株 ZF145 的總 DNA 利用細(xì)菌 16S rDNA 的通用引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和 1492R 5 ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3 針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)引物 gyrB F 5 GCAGCAAAACAGT TATGATGAA 3 和 R 5 AGTCTTCTCCGATACCTGTGC 3 atpD F 5 ACAAGTTTGTCTTCCTC GCC 3 和 R 5 TGAGGTCGCTCTTCATTTAGG 3 菌株 ZF145 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 11 15 反應(yīng)總體系為 50 L PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為 94 預(yù)變性 3 min 94 變性 30 s 60 退火 1 min 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 72 補(bǔ)充延伸 10 min 擴(kuò)增產(chǎn)物選用 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物直接采用雙向測(cè)序 方法進(jìn)行測(cè)序 測(cè)序工作由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成 將所測(cè)得的菌株 ZF145 的 16S rDNA 序列 分析上傳 NCBI 利用 NCBI 的 Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì) 14 比對(duì)不同菌株的 16S rDNA atpD gyrB 基因 采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 分析其親緣關(guān)系 1 5 菌株 ZF145 抑菌譜的測(cè)定 1 5 1 細(xì)菌抑菌譜測(cè)定 菌株 ZF145 對(duì)病原細(xì)菌的抑菌譜測(cè)定采取雙層培養(yǎng)的方法 方法參照 1 3 黃瓜細(xì) 菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選 1 5 2 真菌抑菌譜測(cè)定 采用平板對(duì)峙法 15 檢測(cè)拮抗細(xì)菌對(duì)病原真菌的抑制效果 PDA 平板中央接種直徑 5 mm 的待測(cè)病原菌菌餅 28 培養(yǎng) 2 d 后 在距平板中央 3 5 cm 處接種 5 L OD 600 為 0 8 的拮抗菌株 以不接拮抗菌株為對(duì)照 28 培養(yǎng) 5 d 每個(gè)處理重復(fù) 3 次 測(cè)量靶標(biāo)菌的對(duì)照菌落半徑和處理菌落直徑 用抑菌率表示 抑菌率 對(duì)照菌落直徑 處理菌落直徑 對(duì)照菌落直徑 100 1 6 拮抗菌株 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果 1 6 1 盆栽防效 將病原菌和拮抗細(xì)菌在 NA LB 固體平板上活化 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后挑取單菌落 轉(zhuǎn)接到 NB LB 液體培養(yǎng)基 置于 28 180 r min 搖床上培養(yǎng) 36 h 后制備成菌懸液待用 盆栽黃瓜長(zhǎng)至 2 片真葉時(shí) 噴施 1 10 8 cfu mL 黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸浮液 接種病菌 24 h 后 采用噴霧接種法接種菌株 ZF145 菌懸液 1 10 8 cfu mL 以 5 中生菌素可濕性粉劑為藥劑對(duì)照 清水對(duì)照只接致病菌不接生防 菌 接菌后將黃瓜苗放入相對(duì)濕度 95 溫度 26 28 保濕柜中保濕培養(yǎng) 24 h 之后轉(zhuǎn)入相對(duì)濕度 50 溫度 15 20 的育苗溫室培養(yǎng) 重復(fù) 3 次 清水對(duì)照充分發(fā)病后計(jì)算病情指數(shù)與防治效果 黃 瓜細(xì)菌性角斑病 按角斑病斑所占葉片表面積進(jìn)行分級(jí) 0 級(jí) 無病斑 1 級(jí) 0 5 3 級(jí) 6 25 5 級(jí) 26 50 7 級(jí) 51 75 9 級(jí) 75 以上 病情指數(shù) 100 各級(jí)病葉數(shù) 相對(duì)級(jí)數(shù)值 調(diào)查總?cè)~數(shù) 9 防治效果 100 對(duì)照病情指數(shù) 處理病情指數(shù) 對(duì)照病情指數(shù) 1 6 2 田間防效 本試驗(yàn)于 2019 年 1 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院壽光蔬菜研發(fā)中心日光溫室內(nèi)檢測(cè)貝萊斯芽胞 桿菌對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的田間防治效果 試驗(yàn)期間溫室內(nèi)按同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理 在溫室內(nèi)設(shè)置 3 個(gè)獨(dú)立 的隔離拱棚 每個(gè)拱棚長(zhǎng)為 10 m 寬為 3 m 共計(jì) 30 m 2 每個(gè)拱棚內(nèi)種植 2 壟黃瓜 每壟種植 33 株 待 黃瓜植株長(zhǎng)至 10 片真葉時(shí) 采用噴霧接種法將 1 10 8 cfu mL 的黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸液接種于黃瓜植株 上 每株黃瓜接種 25 mL 菌懸液 24 h 后分別接種 1 10 8 cfu mL 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 菌懸液 100 倍液 噴霧處理 5 中生菌素可濕性粉劑 1000 倍噴霧處理和清水對(duì)照 清水對(duì)照只接致病菌 待清水對(duì)照發(fā)病 后 開始調(diào)查其他處理的病情指數(shù) 計(jì)算防治效果 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗細(xì)菌的分離篩選 采用平板稀釋法 對(duì)采集的 7 份黃瓜根際土壤樣品中的拮抗細(xì)菌進(jìn)行分離 最終獲得 384 株拮抗細(xì)菌 并對(duì)其進(jìn)行保存 編號(hào) 通過雙層培養(yǎng)法測(cè)定對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的抑制效果 篩選到 8 株對(duì)黃瓜細(xì)菌性 424 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 角斑病抑制效果較好的拮抗菌株 其中菌株 ZF145 抑菌圈直徑最大 圖 1 顯著高于其他菌株的抑菌直 徑 為 5 60 cm 抑制效果為 62 22 表 1 A ZF145 B CK 圖 1 菌株 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的抑制效果 Fig 1 The inhibitory effect of antagonistic strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber 表 1 拮抗細(xì)菌菌株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防效 Table 1 Control effect of antagonistic bacterial strains on bacterial angular leaf spot of cucumber 菌株 Strains 抑菌圈直徑 Colony diameter cm 抑菌率 Inhibition rate ZF68 3 50 0 50 38 89 5 56 bc ZF72 3 10 0 17 34 44 1 92 b ZF73 3 77 0 25 41 85 2 80 bcd ZF74 3 17 0 29 35 19 3 21 d ZF76 3 83 0 29 42 59 3 21 cd ZF77 3 10 0 36 34 44 4 01 d ZF79 3 43 0 40 38 15 4 49 bcd ZF145 5 60 0 29 62 22 3 21 a 2 2 拮抗細(xì)菌 ZF145 的鑒定 菌株 ZF145 在 28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后 在 LB 固體培養(yǎng)皿上菌落為乳白色 邊緣不規(guī)則 有褶皺 圖 2 生理生化測(cè)定結(jié)果表明 菌株 ZF145 為革蘭氏陽(yáng)性菌 在 NaCl 含量 1 8 的培養(yǎng)基上均能 生長(zhǎng) 檸檬酸鹽利用 明膠液化為陰性 Biolog 檢測(cè)結(jié)果表明 菌株 ZF145 可以利用 D 葡萄糖 氯化鋰 圖 2 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 在 LB 培養(yǎng)基的菌落形態(tài) Fig 2 The colony morphology of Bacillus velezensis ZF145 on LB medium 第 2 期 苑寶潔等 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果 425 亞碲酸鉀 1 乳酸鈉 但不能利用 D 山梨醇 D 甘露醇 丙三醇 L 谷氨酸 D 天冬氨酸 D 絲氨酸 初步鑒定菌株 ZF145 屬于芽胞桿菌屬 表 2 菌株 ZF145 全基因組長(zhǎng) 3929800 bp 登錄號(hào) GCA 014622705 1 分析菌株 ZF145 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹 該菌株與貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis CP055160 聚在一簇 確定菌株 ZF145 為貝萊斯芽胞桿菌 表 2 ZF145 生理生化特征 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of ZF145 項(xiàng)目 Items 反應(yīng) Reaction 項(xiàng)目 Items 反應(yīng) Reaction 革蘭氏染色反應(yīng) Gram stain 1 8 NaCl 檸檬酸鹽利用 Citric acid 吐溫 40 Tween 40 半乳糖 Galactose 天冬氨酸 Aspartic acid 1 乳酸鈉 Sodium lactate 絲氨酸 Serine D 果糖 6 PO4 D Fructose 6 PO4 山梨醇 Sorbitol 鹽酸胍 Guanidine HCl 丙三醇 Glycerol 注 表示該試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性 表示該試驗(yàn)結(jié)果為陰性 Note indicated that the result of the experiment was positive indicated that the result of the experiment was negative 圖 3 菌株 ZF145 基于多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 3 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain ZF145 2 3 菌株 ZF145 抑菌譜的測(cè)定 拮抗菌株 ZF145 可以明顯抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌 丁香假單胞番茄致病變種 馬鈴薯環(huán)腐病菌 野 油菜黃單胞野油菜致病變種和西瓜嗜酸菌 5 種病原細(xì)菌的生長(zhǎng) 且對(duì)病原真菌也有明顯的抑制效果 可以 抑制番茄匍柄霉病 灰葡萄孢 西瓜殼二孢 尖孢鐮孢菌 茄鏈格孢 辣椒炭疽病菌 多主棒孢菌 辣椒 疫霉菌 8 種病原真菌的生長(zhǎng) 表明拮抗菌株 ZF145 具有較為廣譜的抑菌能力 表 3 426 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 表 3 菌株 ZF145 對(duì)病原菌的抑菌效果 Table 3 The inhibitory effect of ZF145 on 14 different pathogenic fungi 病原菌 Pathogen 抑菌率 Inhibition rate 病原菌 Pathogen 抑菌率 Inhibition rate 胡蘿卜軟腐果膠桿菌 P carotovorum subsp carotovorum 45 19 4 49 c 灰葡萄孢菌 B cinerea 63 09 3 76 a 丁香假單胞菌番茄致病變種 P syringae pv tomato 42 59 3 21 c 多主棒孢菌 C cassiicola 53 67 3 79 b 西瓜嗜酸菌 A citrulli 14 81 3 21 f 尖孢鐮孢菌 F oxysporum 31 25 3 31 d 野油菜黃單胞野油菜致病變種 X campestris pv campestris 25 93 3 21 e 茄鏈格孢菌 A solani 43 53 2 35 c 番茄匍柄霉菌 S solani Weber 48 11 2 86 c 炭疽菌 Colletotrichum sp 54 07 1 41 b 西瓜殼二孢菌 A cittulina Smith 46 33 2 98 c 辣椒疫霉菌 P capsici 43 63 0 94 c 密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種 C michiganense subsp sepedonicums 30 37 2 80 de 2 4 拮抗菌株 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病防治效果 2 4 1 盆栽防效 采用噴霧接種法對(duì)兩葉一心的黃瓜植株接種黃瓜細(xì)菌性角斑病菌 4 d 后 清水對(duì)照開始 發(fā)病 其病情指數(shù) 21 09 而接種拮抗菌株 ZF145 菌懸液 1 10 8 cfu mL 后 黃瓜植株的病情指數(shù)為 6 10 防治效果為 71 10 與對(duì)照藥劑中生菌素的防治效果無明顯差異 表 4 研究表明從土壤樣品中分離出 來的貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 在溫室條件下對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病具有良好的防治效果 表 4 菌株 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的盆栽防治效果 Table 4 Control effect of strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect 貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis ZF145 1 10 8 cfu mL 6 10 0 50 71 10 2 37 a 5 中生菌素 Zhongshengmycin1000 6 19 0 38 70 63 1 82 a 清水對(duì)照 CK 21 09 1 02 2 4 2 田間防效 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 按 10 8 CFU mL 濃度施用時(shí)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果為 61 30 對(duì)照藥劑 5 中生菌素可濕性粉劑按 1000 倍施用時(shí)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果為 54 48 表 5 同等條件下 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 的防治效果高于對(duì)照藥劑中生菌素的防治效果 表明菌株 ZF145 在田間也具有較強(qiáng)的抑菌活性 表 5 菌株 ZF145 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的田間防治效果 Table 5 Control efficacy of antagonistic bacteria strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect 貝萊斯芽胞桿菌 B velezensis ZF145 1 10 8 cfu mL 9 16 0 65 61 30 2 73 a 5 中生菌素 Zhongshengmycin1000 10 77 0 48 54 48 2 03 b 清水對(duì)照 CK 23 66 2 30 3 討論 近年來 黃瓜細(xì)菌性角斑病發(fā)生嚴(yán)重 對(duì)黃瓜產(chǎn)量造成嚴(yán)重的威脅 目前 對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防 治方法主要采用化學(xué)防治 但化學(xué)藥劑存在種類單一 抗藥性等問題 15 而生物防治能有效地避免這些問 題 并且可以達(dá)到一菌多防的效果 16 17 大量研究發(fā)現(xiàn) 土壤中存在大量的拮抗細(xì)菌 可以抑制多種病原 菌的生長(zhǎng) 從馬鈴薯根際土壤中篩選到一株解淀粉芽胞桿菌 Z17 2 對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌具有明顯的抑制 作用 18 因此 本試驗(yàn)以篩選黃瓜細(xì)菌性角斑病的高效生防菌株為出發(fā)點(diǎn) 從黃瓜根際土壤中分離出 384 株細(xì)菌菌株 并成功篩選獲得了 1 株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病具有良好拮抗能力的貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 其 離體抑菌率為 62 22 盆栽防治效果為 71 10 田間防治效果為 61 30 大量研究表明 對(duì) 1 種病原菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株可能會(huì)對(duì)多種病原菌具有抑制效果 研究 發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌可以有效的抑制多主棒孢病菌 19 小麥赤霉病 立枯絲核菌 20 等病原菌的生長(zhǎng) 李新 第 2 期 苑寶潔等 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果 427 宇 21 研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌 ZF 57 可以有效抑制密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍致病型 丁香假單胞菌番茄致病 變種 胡蘿卜軟腐果膠桿菌 青枯雷爾氏菌 茄匍柄霉菌 多主棒孢菌的生長(zhǎng) 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽 胞桿菌 ZF145 可以有效抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌 丁香假單胞菌流淚致病變種 丁香假單胞菌番茄致病變 種 密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種 茄匍柄霉菌 灰葡萄孢菌 尖孢鐮孢菌等多種病原菌的發(fā)生 表 明貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 應(yīng)用空間較為廣泛 因此 以生防菌的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)可作為防治真菌病害及細(xì)菌病害 的有效拮抗菌株 這表明貝萊斯芽胞桿菌 ZF145 在黃瓜細(xì)菌性角斑病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景 參 考 文 獻(xiàn) 1 李磊 基于全基因組測(cè)序的黃瓜細(xì)菌性流膠病病原菌致病力和比較基因組分析 D 北京 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018 2 Jeong H Klopper W Ryu CM Genome sequences of Pseudomonas amygdali pv Tabaci strain ATCC 11528 and pv Lachrymans strain 98A 744 J Genome A 2015 3 3 e00683 15 3 何永梅 李榮 黃瓜細(xì)菌性角斑病發(fā)生原因與綜合防治 J 植物醫(yī)生 2018 31 2 59 61 4 黃和喜 金靜 劉士輝 等 靶斑病與霜霉病 細(xì)菌性角斑病的區(qū)別及其防治 J 現(xiàn)代園藝 2018 369 21 168 169 5 鄧銀寶 肖艷 范小明 等 12 松脂酸銅懸浮劑防治黃瓜細(xì)菌性角斑病試驗(yàn)效果初報(bào) J 現(xiàn)代園藝 2017 23 5 6 6 代園鳳 丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系和甜瓜株系的分子生物學(xué)比較 D 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013 7 王素英 對(duì)作物具有促生和防病作用細(xì)菌組合的篩選 D 北京 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2003 8 李德全 陳志誼 聶亞鋒 生防菌 Bs 916 及高效突變菌株抗菌物質(zhì)及其對(duì)水稻抗性誘導(dǎo)作用的研究 J 植物病理學(xué)報(bào) 2008 2 192 198 9 趙昱榕 李磊 謝學(xué)文 等 貝萊斯芽胞桿菌 ZF2 對(duì)多主棒孢病菌防治效果 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2019 35 2 217 225 10 謝學(xué)文 董瑞利 石延霞 等 黃瓜炭疽病拮抗細(xì)菌的篩選及其抑制效果 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2016 32 2 215 220 11 趙旖森 張亮 盛浩 等 辣椒疫霉病生防細(xì)菌的篩選鑒定及其防效 J 中國(guó)蔬菜 2019 1 65 69 12 袁雪 侯旭 胡曉 等 桃褐腐病拮抗細(xì)菌的篩選 鑒定及生防作用 J 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 2018 33 04 11 17 13 東秀珠 蔡妙英 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) M 北京 科學(xué)出版社 2001 14 朱飛舟 陳利玉 陳漢春 16SrRNA 基因序列分析法測(cè)定病原細(xì)菌 J 長(zhǎng)沙 中南大學(xué)學(xué)報(bào) 醫(yī)學(xué)版 2013 38 10 1035 1041 15 程永樂 馬鈴薯四種病害拮抗菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化 D 呼和浩特 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 16 崔彥 防治黃瓜細(xì)菌角斑病的中草藥提取物的篩選與研究 D 保定 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008 17 Gao H Li P Xu X et al Research on Volatile Organic Compounds From Bacillus subtilis CF 3 Biocontrol Effects on Fruit Fungal Pathogens and Dynamic Changes During Fermentation J Frontiers in Microbiology 2018 9 456 18 李夏冰 劉瑜 時(shí)浩杰 等 黃瓜細(xì)菌性角斑病對(duì)噻唑鋅的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 J 農(nóng)藥 2013 52 11 832 834 850 19 李煥玲 李寶聚 李寶聚博士診病手記 五十三 黃瓜細(xì)菌性角斑病的癥狀多樣性與綜合防治 J 中國(guó)蔬菜 2012 21 23 25 20 趙先麗 孫軍德 程海濤 黃瓜細(xì)菌性角斑病的拮抗細(xì)菌篩選初報(bào) J 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2005 3 95 97 21 李新宇 解淀粉芽胞桿菌微粉劑的研制及對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治研究 D 沈陽(yáng) 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2020 責(zé)任編輯 呂平香