38 2 469 475 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2021 11 11 基金項(xiàng)目 浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目 解淀粉芽胞桿菌殺蟲生物農(nóng)藥研究 2015C32065 作者簡(jiǎn)介 竺利紅 碩士 副研究員 E mail karen2002 通信作者 碩士 研究員 E mail shiyf2003 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2022 02 012 芽胞桿菌 SM905的鑒定及其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌 的抑菌活性研究 竺利紅 李孝輝 施躍峰 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所 杭州 310021 摘要 芽胞桿菌 Bacillus sp SM905 是本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的一株活性細(xì)菌 為進(jìn)一步明確其分類地位及其 對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 的抑菌活性 利用形態(tài)學(xué) 生理生化特性及 16S rDNA 和 gyrB 序列分析對(duì) SM905 進(jìn)行種屬鑒定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法 插片法和瓊脂平板法測(cè)定了不同濃度的 SM905 發(fā)酵上清液對(duì)靶標(biāo)菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 并通過(guò)盆栽試驗(yàn)考察其防效 結(jié)果表明 SM905 為貝萊斯芽胞桿菌 Bacillus velezensis 不同稀釋倍數(shù)的 SM905 發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌均有一定的抑制 作用 其中 5 倍稀釋液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高 為 97 89 20 倍稀釋液的抑制率也達(dá) 90 左右 處 理組殘留膠孢炭疽菌氣生菌絲表現(xiàn)為畸形 空洞 色素積累等 基內(nèi)菌絲產(chǎn)生大量的分生孢子 SM905 發(fā)酵上清液不影響膠孢炭疽菌孢子的萌發(fā)率 但是導(dǎo)致萌發(fā)后的菌絲生長(zhǎng)稀疏 膨大 盆栽試驗(yàn)結(jié)果表 明 SM905 粉劑 100 倍液間隔 7 d 噴施 2 次對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防效為 80 74 優(yōu)于 10 苯醚甲環(huán)唑水 分散粒劑 800 倍液 本研究表明 芽胞桿菌 SM905 可以作為鐵皮石斛炭疽病生物防治用生防菌 具有良 好的應(yīng)用前景 關(guān) 鍵 詞 膠孢炭疽菌 鐵皮石斛 貝萊斯芽胞桿菌 鑒定 抑菌活性 中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 02 0469 07 Identification of Bacillu sp SM905 and Its Antifungal Activity against Colletotrichum gloeosporioides ZHU Lihong LI Xiaohui SHI Yuefeng Institute of Plant Protection and Microbiology Zhejiang Academy of Agricultural Sciences Hangzhou 310021 China Abstract Bacillus sp SM905 isolated in our previous study is a bacterium with antifungal activity In this study strain SM905 was further identified as B velezensis based on its morphological and physiological characters combined with the sequences analysis of 16S rDNA and gyrB Mycelial growth rate assay showed that mycelia growth of C gloeosporioides was inhibited in varying degrees by different dilutions of SM905 fermentation supernatant Fermentation supernatant diluted five times exhibited the highest inhibition activity against mycelial growth with the inhibition rate of 97 89 Cover glass insertion cultivation assay indicated that the aerial mycelium of C gloeosporioides treated with the fermentation supernatant showed abnormal morphology such as vesicular deformities and pigment accumulation and that a large amount of conidia were produced from the substrate mycelium The results of the agar plate cultivation showed that strain SM905 fermentation supernatant treatment had little effect on the conidia germination rate of C gloeosporioides however the newly formed mycelium grew slowly with the swelling morphology In the pot experiments 100 fold diluted SM905 powder was sprayed twice with an interval of 7 days and the control efficacy on Dendrobium officinale anthracnose 470 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 reached 80 74 which was higher than that of treatment of 10 Difenoconazole WDG 800X dilution Over all our study indicated that B velezensis strain SM905 is a promising bioagent used in biocontrol of D officinale anthracnose Key words Colletotrichum gloeosporioides Dendrobium officinale Bacillus velezensis identification antifungal activity 鐵皮石斛 Dendrobium candidium Wall ex Lindl 為蘭科石斛屬的多年生附生型草本植物 是我國(guó)傳統(tǒng) 名貴中藥材 其多糖成分 具有提高人體免疫力 抗氧化和抗腫瘤的功效 人工栽培已相當(dāng)普遍 1 2 鐵皮石斛喜歡溫暖陰濕的環(huán)境 病蟲發(fā)生危害逐年加重 尤其是葉片炭疽病更為嚴(yán)重 已成為制約鐵 皮石斛產(chǎn)業(yè)化 規(guī)?；l(fā)展的主要因素之一 3 4 該病由膠孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 引起 主要危害葉片和莖桿 引起落葉甚至植株枯死 對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大 5 而我國(guó)在鐵皮石斛上尚沒(méi)有一 種登記藥劑 生產(chǎn)上濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象普遍 農(nóng)藥殘留超標(biāo)隱患大 藥中藥 問(wèn)題突出 嚴(yán)重威脅鐵皮石 斛產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展 6 對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防治 急需安全高效的專用藥劑 生物防治是目前植物病害防治的發(fā)展方向之一 其中微生物殺菌劑具有環(huán)境友好 安全性高等優(yōu)點(diǎn)而 成為研究熱點(diǎn) 7 已獲農(nóng)藥登記的微生物殺菌劑主要有芽胞桿菌類 木霉菌 假單胞菌類等 8 登記作物 包括水稻 小麥 番茄 煙草等 鐵皮石斛尚未在列 國(guó)內(nèi)外關(guān)于鐵皮石斛炭疽病的生物防治研究報(bào)道較 少 少量研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室拮抗菌的分離篩選 曾欣等 9 通過(guò)離體葉片測(cè)定法發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌貝萊斯芽胞桿 菌 Bacillus velezensis B 11對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防效為 64 劉艷明等 10 通過(guò)平板對(duì)峙法測(cè)定了 Ceriporia sp F102 等內(nèi)生真菌到對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性 為了保障鐵皮石斛的綠色高效種植 迫切需要更多 有應(yīng)用前景的生防資源 因此很有必要分離篩選該病原菌的優(yōu)質(zhì) 高效拮抗菌 本研究從土壤中分離到一 株芽胞桿菌 Bacillus sp SM905 發(fā)現(xiàn)其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌有較好的抑制作用 對(duì)其展開(kāi)了菌種鑒定 抑菌活性測(cè)定和盆栽防治試驗(yàn) 為進(jìn)一步的田間應(yīng)用提供理論參考 1 材料與方法 1 1 供試材料 供試菌株芽胞桿菌 SM905 膠孢炭疽菌由本實(shí)驗(yàn)室保存 1 0 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑由瑞士正先達(dá)作 物保護(hù)有限公司生產(chǎn) 細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒 PCR 試劑 16S rDNA 通用引物 27F 1492R gyrB 測(cè)序引物 UP 1S UP 2Sr 由生工工程 上海 股份有限公司生產(chǎn)或合成 種子培養(yǎng)基 黃豆餅粉 5 g 葡萄 糖 1 g 水 1000 mL pH 7 5 發(fā)酵培養(yǎng)基 麩皮 20 g 黃豆餅粉 15 g 番薯淀粉 10 g NaCl 5 g K 2 HPO 4 3 g MgSO 4 1 5 g 水 1000 mL pH 7 5 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂 15 g 水 1000 mL pH 自然 PDB 培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 水 1000 mL pH 自然 1 2 菌株 SM905 鑒定 1 2 1 形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定 參照文獻(xiàn) 11 方法進(jìn)行 1 2 2 分子鑒定 采用基因組 DNA 抽提試劑盒提取菌株 SM905 的總 DNA 分別用 16S rDNA 和 gyrB 引物擴(kuò)增 16S rDNA 擴(kuò)增條件 94 預(yù)變性 5 min 94 變性 30 s 50 退火 30 s 72 延伸 1 min 30 s 35 個(gè)循環(huán) 72 延伸 10 min gyrB 擴(kuò)增條件 94 預(yù)變性 4 min 94 變性 1 min 60 退 火 30 s 72 延伸 2 min 35 個(gè)循環(huán) 72 延伸 10 min 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定后 送生工工程 上海 股份有限公司測(cè)序 測(cè)序結(jié)果分別在 Genbank 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì) 并 構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 1 3 菌株 SM905 發(fā)酵上清液和粉劑的制備 取新鮮培養(yǎng)的 SM905 斜面接種于種子培養(yǎng)基中 37 180 r min 振蕩培養(yǎng) 16 h 即得種子液 取種 子液 按 5 的接種量計(jì) 接入發(fā)酵培養(yǎng)基中 37 220 r min 振蕩培養(yǎng)至 2 3 芽胞脫落 取部分發(fā)酵液 8000 r min 離心 15 min 上清液過(guò) 0 22 m 微孔過(guò)濾器 即得發(fā)酵上清液 4 保存 剩余發(fā)酵液用助劑 吸附 烘干 制備含孢量為 100 億 CFU g 的粉劑 常溫避光保存 第 2 期 竺利紅等 芽胞桿菌 SM905 的鑒定及其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性研究 471 1 4 菌株 SM905 對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑制作用 1 4 1 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 采用平板對(duì)峙法 12 測(cè)定 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 取新鮮培養(yǎng) 的 SM905 斜面 用接種環(huán)蘸取少量接入到 PDA 培養(yǎng)基距中心 25 mm 的 4 個(gè)點(diǎn) 打孔器打取培養(yǎng) 7 d 的膠 孢炭疽菌菌絲塊 d 6 mm 接入培養(yǎng)皿中央 培養(yǎng) 5 d 后觀察抑菌效果 1 4 2 對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 將膠孢炭疽菌菌絲塊接種在 PDB 培養(yǎng)液 于 28 180 r min 振蕩培養(yǎng) 10 d 后 無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾 濾液即為孢子懸浮液 將發(fā)酵上清液與融化的 PDA 培養(yǎng)基混合 使其分別稀釋 5 10 20 倍 對(duì)照組為空白 PDA 培養(yǎng)基 待培養(yǎng)基冷卻到 45 時(shí) 加入 1 mL 孢子懸 浮液 迅速搖勻倒平板 每處理設(shè) 5 個(gè)重復(fù) 于 28 恒溫培養(yǎng) 24 h 每皿用打孔器隨機(jī)打 3 個(gè)孔 將 取得的培養(yǎng)物置于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)狀況 以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn) 統(tǒng) 計(jì)孢子萌發(fā)率 1 4 3 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法 13 測(cè)定不同濃度發(fā)酵上清液對(duì)鐵皮石斛膠 孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 將發(fā)酵上清液與融化的 PDA 培養(yǎng)基混合 使其分別稀釋 5 10 20 倍 以 加入等體積無(wú)菌水的 PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照 倒平板 待冷卻后在平板中心接入膠孢炭疽菌菌絲塊 d 6 mm 每處理設(shè) 5 個(gè)重復(fù) 于 28 恒溫培養(yǎng) 5 d 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑 計(jì)算抑菌率 并利用 SPSS 22 0 軟件進(jìn)行單因素方差分析 抑制率 對(duì)照組菌落直徑 處理組菌落直徑 對(duì)照組菌落直徑 6 100 采用插片法 14 觀察菌絲的形態(tài) 即取 5 mL SM905 發(fā)酵上清液加入 95 mL 融化的 PDA 培養(yǎng)基中 混 勻 對(duì)照組培養(yǎng)基中加入等量無(wú)菌水 倒平板 將無(wú)菌蓋玻片 30 度角斜插入凝固的平板 在蓋玻片與培 養(yǎng)基交接處接入膠孢炭疽菌菌絲 于 28 恒溫培養(yǎng) 3 d 取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài) 另取少量菌絲于掃描電鏡進(jìn)一步形態(tài)觀察 1 5 菌株 SM905 防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)采用 雁蕩 1 號(hào) 品種 采用人工接種病原菌 即每盆噴施含孢量為 10 7 孢子 mL 的鐵皮石斛膠 孢炭疽菌孢子懸浮液 10 mL 2 d 后用于試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè) 4 個(gè)處理 1 噴施 SM905 粉劑 100 倍液 20 mL 1 次 2 間隔 7 d 噴施 SM905 粉劑 100 倍液 20 mL 2 次 3 噴施 10 苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑 800 倍液 20 mL 1 次 4 噴施無(wú)菌水 20 mL 1 次 每處理 30 盆 重復(fù) 3 次 每個(gè)處理分別于首次施藥后 15 30 d 隨機(jī)調(diào)查 30 株鐵皮石斛 統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)并計(jì)算防效 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為 0 級(jí) 無(wú)病斑 1 級(jí) 病斑面積占 整個(gè)葉面積 5 以下 3 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積 6 15 5 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積 16 25 7 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積 26 50 9 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積 50 以上 計(jì)算病情指數(shù)和防治 效果 病情指數(shù) 病級(jí)數(shù) 該病級(jí)植株數(shù) 最大病級(jí)數(shù) 植株總株數(shù) 100 防治效果 對(duì) 照組病情指數(shù) 處理組病情指數(shù) 對(duì)照病情指數(shù) 100 利用 SPSS 22 0 軟件進(jìn)行單因素方差分析 2 結(jié)果與分析 2 1 菌株 SM905 鑒定 2 1 1 形態(tài)學(xué) 生理生化特征 SM905 在營(yíng)養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基上呈淡黃色菌落 表面干燥且粗糙 邊緣不 整齊 革蘭氏染色呈陽(yáng)性 短桿狀 兩端鈍圓 單 個(gè) 成對(duì)或成串出現(xiàn) 橢圓形芽胞 中生到次端生 圖 1 好氧 能利用葡萄 和乳糖 蔗糖 甘 露醇和麥芽糖等 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸 可水解淀粉和 明膠 氧化酶反應(yīng) V P 反應(yīng) 硝酸鹽還原反應(yīng)和 接觸酶反應(yīng)均呈陽(yáng)性 根據(jù)上述特征 初步判斷 SM905 為芽胞桿菌屬 2 1 2 16S rDNA 和 gyrB 序列分析 菌株 SM905 的 16S rDNA 和 gyrB 序列 Genbank 號(hào)分別為 OM021868 B A C 圖 1 SM905 桿狀體 A 孢囊體 B 芽胞 C 形態(tài) 100 Fig 1 Rod shaped strain A sporangium B and spore C morphology of strain SM905 100 472 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 和 OM037015 并與相關(guān)屬種進(jìn)行比對(duì) 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 圖 2 可以看出 菌株 SM905 與貝萊斯芽胞 桿菌 B velezensis 的模式菌株 BCRC 17467 聚合在一枝 同源性達(dá) 99 以上 結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征 將菌株 SM905 鑒定為貝萊斯芽胞桿菌 SM905 Bacillus velezensis strain BCRC 17467 DQ903176 1 Bacillus amyloliquefaciens strain IFO 15535 AB014097 1 Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601 DQ309294 1 Bacillus siamensis KCTC 13613 KC608573 1 Bacillus subtilis strain IFO 13719 AB014103 1 Paenibacillus apiarius AB462410 1 100 93 100 0 1 SM905 Bacillus velezensis strain BCRC 17467 EF433407 1 Bacillus vallismortis strain DSM 11031 NR 024696 1 Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535 NR 041455 1 Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601 NR 116022 1 Bacillus subtilis subsp subtilis strain 168 NR 102783 2 Bacillus licheniformis strain NBRC 12200 NR 113588 1 Bacillus pumilus strain ATCC 7061 NR 043242 1 Paenibacillus apiarius strain DSM 5581 MN845156 1 100 52 91 56 51 0 02 A B 圖 2 菌株 SM905 基于 16S rDNA A 和 gyrB B 序列的進(jìn)化樹(shù) Fig 2 Phylogenetic trees of strain SM905 based on sequences of 16S rDNA A and gyrB B 2 2 菌株 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用 2 2 1 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 從圖 3 可知 SM905 對(duì)鐵皮石斛炭疽病菌有較強(qiáng)的抑菌活性 形成了明 顯的抑菌帶 界限邊緣整齊 靠近抑菌帶邊緣菌絲稀疏并顏色加深 2 2 2 對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 與對(duì)照相比 不同稀釋倍數(shù)的 SM905 發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌孢 子萌發(fā)率與對(duì)照相比差異不顯著 表 1 從形態(tài)上觀察 SM905 發(fā)酵上清液對(duì)新萌發(fā)菌絲生長(zhǎng)抑制明顯 表現(xiàn)為菌絲粗細(xì)不一 分支少 菌絲中部有明顯的膨大 而對(duì)照組菌絲粗細(xì)均勻 舒展 分支多 呈大網(wǎng) 狀 圖 4 表明 SM905 發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了含有抗 膠孢炭疽菌的活性物質(zhì) 能顯著抑制其孢子萌發(fā)后 新菌絲的生長(zhǎng) 2 2 3 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響 從表 1 可以 看出 SM905 發(fā)酵上清液不同稀釋倍數(shù)對(duì)膠孢炭疽 菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率存在極顯著差異 P 0 01 隨著稀釋倍數(shù)增大 抑制效果逐漸下降 表 1 SM905 發(fā)酵上清液 20 倍稀釋液對(duì)膠孢炭疽菌菌絲 生長(zhǎng)的抑制率仍大于 90 通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到 該濃度處理組氣生菌絲粗細(xì)不一 盤曲折疊 隔膜 之間菌絲縮短 菌絲膨大 大量色素積累 基部菌 絲產(chǎn)生大量分生孢子 而對(duì)照組膠孢炭疽菌菌絲均 勻 光滑 粗壯 菌絲內(nèi)無(wú)色素積累現(xiàn)象 無(wú)分生 孢子產(chǎn)生 進(jìn)一步通過(guò)掃描電鏡觀察到處理組菌絲 圖 3 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 Fig 3 Antifungal activity of SM905 against Colletotrichum gloeosporioides 第 2 期 竺利紅等 芽胞桿菌 SM905 的鑒定及其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性研究 473 表 1 SM905 發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 Table 1 Inhibitory effect of strain SM905 fermentation filtrate on spore germination and mycelial growth of C gloeosporioides 發(fā)酵上清液稀釋倍數(shù) Dilution ratio of fermentation filtrate 孢子萌發(fā)率 Spore germination rate 菌絲生長(zhǎng)抑制率 Inhibition rate of mycelial growth 稀釋 5 倍 Diluted by 5 times 86 22 1 86 b 97 89 0 48 Aa 稀釋 10 倍 Diluted by10 times 87 29 2 47 ab 93 84 0 67 Bb 稀釋 20 倍 Diluted by 20 times 88 38 2 63 a 90 14 0 49 Cc 對(duì)照 Control 88 18 3 31 ab A B A 對(duì)照組菌絲 Mycelium of control group B 處理組菌絲 Mycelium of treatment group 圖 4 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌孢子新萌發(fā)菌絲的影響 400X Fig 4 Effect of SM905 against the newly germinated mycelium of C gloeosporioides 400X DE BA C 1 光學(xué)顯微鏡 Optical microscope 400 A 對(duì)照組菌絲 Mycelium of control group B 處理組氣生菌絲 Aerial mycelium of treatment group C 處理 組基部菌絲 Substrate mycelium of treatment group 2 掃描電鏡 SEM D 對(duì)照組菌絲 Mycelium of control group E 處理組菌絲 Mycelium of treatment group 圖 5 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲形態(tài)的影響 Fig 5 The effect of strain SM905 on mycelial morphology of C gloosporioides 出現(xiàn)大量空洞 菌絲斷裂現(xiàn)象明顯 證實(shí)了 SM905 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲的破壞作用 圖 5 2 3 菌株 SM905 防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗(yàn) 由盆栽試驗(yàn)結(jié)果 表 2 可以看出 人工接種病原菌后 對(duì)照組開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病 30 d 時(shí)病情指數(shù)為 15 78 SM905 粉劑 100 倍液間隔 7 d 噴施 2 次 藥后 15 d 對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防效達(dá) 83 96 與噴施 1 次的防 474 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 效 55 36 差異極顯著 但低于 10 苯醚甲環(huán)唑 800 倍液 85 4 30 d 時(shí)防效仍保持在 80 優(yōu)于 10 苯醚甲環(huán)唑 800 倍液 79 28 顯著優(yōu)于 SM905 噴施 1 次防效 50 70 表明 SM905 防治鐵皮 石斛炭疽病應(yīng)選擇發(fā)病初期用藥 并且連續(xù)用 2 次防效更好 持效期更長(zhǎng) 表 2 SM905 粉劑防治鐵皮石斛炭疽病的盆栽試驗(yàn) Table 2 Control efficacy of strain SM905 on Dendrobiumbium officinale anthracnose 15 d 30 d 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy SM905 1 次 5 37 55 36 Cc 7 78 50 70 Bc SM905 2 次 1 93 83 96 Bb 3 04 80 74 Aa 10 苯醚甲環(huán)唑 Difenoconazole WDG 1 76 85 4 Aa 3 27 79 28 Ab 無(wú)菌水 Sterile water 12 03 15 78 注 表中大小寫字母分別表示差異顯著性 P 0 01 和 P 0 05 Note Data with the uppercase and lowercase letters indicated significant difference at 0 01and 0 05 level respectively 3 討論 鐵皮石斛是名貴中藥材 炭疽病是影響其品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害之一 研制安全 高效的生物農(nóng)藥 對(duì)于保障鐵皮石斛質(zhì)量安全 促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的研究意義及廣闊的應(yīng)用前景 貝萊斯芽胞 桿菌屬于芽胞桿菌屬 該菌首次發(fā)現(xiàn)于西班牙馬拉加的一條名為貝萊斯河的河口 研究表明貝萊斯芽胞桿 菌對(duì)引起稻瘟病 梨灰霉病 草莓炭疽病 小麥赤霉病等病害的多種植物病原菌具有抑制作用 15 18 在生 物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛能 貝萊斯芽胞桿菌對(duì)鐵皮石斛炭疽病的研究局限于實(shí)驗(yàn)室拮抗菌的分離篩 選階段 所篩菌株僅在室內(nèi)中表現(xiàn)出拮抗作用還是不夠的 只有在應(yīng)用中依舊表現(xiàn)出良好防效的拮抗菌株 才具有生防應(yīng)用潛力 19 本研究篩選到一株貝萊斯芽胞桿菌 SM905 平板對(duì)峙試驗(yàn)表明該菌對(duì)鐵皮石斛膠 孢炭疽菌具有較強(qiáng)的抑制活性 本研究還進(jìn)一步展開(kāi)了 SM905 對(duì)鐵皮石斛炭疽病的盆栽防治試驗(yàn) 結(jié)果 表明 SM905 粉劑 100 倍液對(duì)炭疽病的防效達(dá) 80 以上 優(yōu)于 10 苯醚甲環(huán)唑 800 倍液 本說(shuō)明該菌株具 有較強(qiáng)的開(kāi)發(fā)前景 各生防菌株的來(lái)源不同 產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)類型不同 其作用機(jī)理也有所差異 20 作用機(jī)理的研究 對(duì)建立田間使用技術(shù)十分關(guān)鍵 以往研究表明貝萊斯芽胞桿菌的抑菌機(jī)理為致使病原菌菌絲畸形和降低孢 子萌發(fā)率 21 24 相比之下本研究菌株 SM905 在機(jī)理上有兩個(gè)不同點(diǎn) SM905 僅抑制膠孢炭疽菌孢子萌發(fā) 后新菌絲的生長(zhǎng) 對(duì)孢子萌發(fā)率本身沒(méi)有顯著影響 SM905 發(fā)酵上清液 20 倍稀釋液能抑制膠孢炭疽菌氣 生菌絲的生長(zhǎng) 使其膨大畸形 空洞 甚至斷裂 但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)病原菌基部菌絲在 3 d 內(nèi)產(chǎn)生大 量分生孢子 而對(duì)照組菌絲培養(yǎng) 10 d 后才開(kāi)始形成明顯的分生孢子堆 說(shuō)明 SM905 發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì) 脅迫了病原菌菌絲的生長(zhǎng) 加速其老化產(chǎn)孢 分生孢子可以在不良環(huán)境中休眠 如條件合適 則繼續(xù)萌發(fā) 生長(zhǎng) 侵染植物 因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)選擇發(fā)病初期施藥 同時(shí)保證足夠的藥劑濃度 或者通過(guò)重復(fù)施藥 以達(dá)到徹底殺滅病原菌菌絲的目的 這一點(diǎn)與盆栽試驗(yàn)結(jié)果吻合 SM905 粉劑 100 倍液施用 2 次效果優(yōu)于 1 次 在后續(xù)的研究中 我們將進(jìn)一步開(kāi)展 SM905 的發(fā)酵工藝研究 活性物質(zhì)的分離鑒定以及田間應(yīng)用技 術(shù)研究 希望能為鐵皮石斛的安全生產(chǎn)提供一種新型高效的生防制劑 參 考 文 獻(xiàn) 1 郭冕 江吉富 石斛多糖藥理作用的研究概況 J 醫(yī)學(xué)綜述 2015 21 24 4525 4528 2 何伯偉 潘慧鋒 浙江鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)提升發(fā)展的實(shí)施措施與建議 J 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 2 152 155 3 盧振輝 李明焱 王偉杰 等 鐵皮石斛主要病蟲害及其非化學(xué)農(nóng)藥防治 J 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016 57 1 123 126 4 李景蕻 張麗華 鐵皮石斛種苗生產(chǎn)中 種常見(jiàn)病害及防治 J 種子 2015 34 12 128 130 5 趙玲琳 王國(guó)榮 沈偉東 等 鐵皮石斛炭疽病病原菌的分離鑒定及其有效殺菌劑的篩選 J 植物保護(hù) 2018 44 6 185 190 第 2 期 竺利紅等 芽胞桿菌 SM905 的鑒定及其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性研究 475 6 戴德江 沈瑤 沈穎 等 浙江省特色作物安全用藥整體解決的實(shí)踐與思考 J 農(nóng)藥科學(xué)與管理 2015 36 12 1 7 7 姚錦愛(ài) 黃鵬 賴寶春 等 貝萊斯芽胞桿菌 ZZBV 3 的鑒定及其對(duì)草莓根腐病的防效 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2021 37 1 172 177 8 袁善奎 王以燕 師麗紅 等 我國(guó)生物源農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)制定現(xiàn)狀及展望 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2018 34 1 1 7 9 曾欣 張亞惠 遲惠榮 等 溫郁金內(nèi)生拮抗細(xì)菌 B 11 的分離及其抑菌活性 J 微生物學(xué)通報(bào) 2019 46 5 1018 1029 10 劉艷明 黃雅麗 李婷 等 野生與人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生真菌生物多樣性比較及抗炭疽病活性菌株的篩選 J 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2020 41 3 47 55 11 東秀珠 蔡妙英 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) M 北京 科學(xué)出版社 2001 349 388 12 楊勝清 張帆 馬貴龍 貝萊斯芽胞桿菌 S6 拮抗物質(zhì)分離純化及抑菌機(jī)理 J 農(nóng)藥 2017 56 9 645 648 13 蔡甜星 劉楚非 蔡烈偉 等 放線菌 V17 的分類鑒定及其對(duì)茶樹(shù)炭疽病菌的拮抗作用 J 寧德師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2021 33 3 281 285 14 汪紅 解麗芳 王甜 等 用浸染法提高放線菌形態(tài)觀察的效果 J 西華師范大學(xué)學(xué)報(bào) 2011 32 3 256 258 15 沙月霞 隋書婷 曾慶超 等 貝萊斯芽胞桿菌 E69 預(yù)防稻瘟病等多種真菌病害的潛力 J 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019 52 11 1908 1917 16 孫平平 崔建潮 賈曉輝 等 貝萊斯芽胞桿菌 L 1 對(duì)梨灰霉和青霉病菌的抑制作用評(píng)價(jià)及全基因組分析 J 微生物學(xué)報(bào) 2018 58 9 1637 1646 17 Nam M H Kim H S Lee H D et al Biological control of anthracnose crown rot in strawberry using Bacillus velezensis nsb 1 J Acta Horticulturae 2014 1049 685 688 18 宗英 趙月菊 劉陽(yáng) 等 一株貝萊斯芽胞桿菌抑制禾谷鐮刀菌的研究 J 核農(nóng)學(xué)報(bào) 2018 32 2 310 317 19 Kloepper J W Beauchamp C J A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria J Canadian Journal of Microbiology 1992 38 12 1219 1232 20 王波 周澗楠 黃忠勤 等 一株多粘類芽胞桿菌 Paenibacillus polymyxa 對(duì)甘薯黑斑病的生物防治效果及作用機(jī)理初探 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2017 29 10 40 43 21 李永麗 周洲 尹新明 貝萊斯芽胞桿菌 Mr12 預(yù)防蘋果輪紋病等病害的潛力及其全基因組分析 J 果樹(shù)學(xué)報(bào) 2021 38 9 1459 1467 22 Rabbee MF Ali MS Choi J et al Bacillus velezensis a valuable member of bioactive molecules within plant microbiomes J Molecules 2019 24 6 1046 23 朱志賢 于翠 李勇 等 一株桑椹菌核病生防菌分離鑒定及其拮抗作用分析 J 中國(guó)森林病蟲 2019 38 5 1 7 24 楊勝清 張帆 馬貴龍 貝萊斯芽胞桿菌 S6 拮抗物質(zhì)分離純化及抑菌機(jī)理 J 農(nóng)藥 2017 56 9 645 648 責(zé)任編輯 呂平香