38 2 404 413 中國生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2021 04 30 基金項(xiàng)目 河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 20326515D 河北省農(nóng)林科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程 2019 1 2 03 作者簡(jiǎn)介 共同第一作者 敖明遠(yuǎn) 碩士 E mail aomy163 張曉云 碩士 副研究員 E mail zxy zxl 通信作者 博士 研究員 E mail shezengli DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 08 003 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞桿菌 BAB 1水分散片劑的研制 敖明遠(yuǎn) 1 張曉云 1 郭慶港 1 曲遠(yuǎn)航 1 鹿秀云 1 崔建州 2 李社增 1 馬 平 1 1 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071000 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071000 摘要 枯草芽胞桿菌BAB 1是一株有效防治蔬菜灰霉病和白粉病的生防細(xì)菌 為提高該菌株的應(yīng)用潛力 本研究以BAB 1菌株為有效成分開展水分散片劑的研制 通過生物相容性試驗(yàn) 正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)對(duì) 崩解劑 粘結(jié)劑及分散劑進(jìn)行篩選 最終確定100億CFU g枯草芽胞桿菌BAB 1水分散片劑的適宜配方 為酒石酸5 碳酸氫鈉25 氯化鈉0 5 乳糖5 PEG6000 2 NNO 4 BAB 1母藥補(bǔ)足至100 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明 該水分散片劑崩解時(shí)間為272 17 s pH值為5 75 懸浮率為73 77 產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo) 均符合要求 溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明 該制劑500倍液處理能夠有效防治黃瓜與番茄灰霉病 防效分別達(dá) 到84 11 和75 15 與對(duì)照藥劑43 氟菌 肟菌酯 露娜森 1000倍液的防治效果無顯著性差異 76 25 與84 85 但顯著高于2億孢子 g木霉菌可濕性粉劑500倍液 62 71 與57 95 關(guān) 鍵 詞 枯草芽胞桿菌 水分散片劑 灰霉病 微生物殺菌劑 中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 02 0404 10 Development of Bacillus subtilis BAB 1 Water Dispersible Tablet to Control Vegetable Gray Mold AO Mingyuan 1 ZHANG Xiaoyun 1 GUO Qinggang 1 QU Yuanhang 1 LU Xiuyun 1 CUI Jianzhou 2 LI Shezeng 1 MA Ping 1 1 IPM Center of Hebei Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China Ministry of Agriculture and Rural Affairs Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences Baoding 071000 China 2 College of Forestry Hebei Agricultural University Baoding 071000 China Abstract Bacillus subtilis BAB 1 exhibited strong control effect on vegetable gray mold and powdery mildew To improve the application potential with B subtilis BAB 1 as active ingredient a formulation of strain BAB 1 water dispersible tablet WT was developed The optimized disintegrant binder and dispersant were screened by biocompatibility test orthogonal test or single factor test and the final formulation of 10 billion CFU g B subtilis BAB 1 WT was determined as 5 tartaric acid 25 sodium bicarbonate 0 5 sodium chloride 5 lactose 2 PEG6000 4 NNO and up to 100 by strain BAB 1 technical material The quality of this formulation was satisfied with dispersion time of 272 17 s pH 5 75 and suspension rate of 73 77 Pot test showed the 500 fold aqueous solution treatment of BAB 1 WT could effectively control gray mold on cucumber and tomato with control efficacy of 84 11 and 75 15 respectively There was no significant difference in the control effect between the BAB 1 WT and the 1000 fold aqueous solution of 43 trifloxystrobin fluopyram Lunasen 76 25 and 84 85 but significantly higher than that of the 500 fold aqueous solution of 2 10 8 conidia g Trichoderma WP 62 71 and 57 95 第 2 期 敖明遠(yuǎn)等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的研制 405 Key words Bacillus subtilis water dispersible tablet grey mold microbial fungicide 蔬菜 番茄 黃瓜等 灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一類真菌性病害 在我國絕大多 數(shù)保護(hù)地栽培蔬菜區(qū)均有發(fā)生 常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失 1 蔬菜灰霉病的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑 但長期 大量 頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性 化學(xué)農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等一系列問題 2 5 因此 為達(dá) 到減量或替代化學(xué)農(nóng)藥使用的目的 研發(fā)和利用環(huán)保高效的新型微生物殺菌劑 成為國內(nèi)外植物保護(hù)工作 者的研究熱點(diǎn) 劑型是農(nóng)藥有效成分的最終使用形式或狀態(tài) 生防微生物可通過加工成合適的劑型 達(dá)到提高其生物 活性 擴(kuò)大使用方式和用途等目的 微生物殺菌劑的劑型主要有固態(tài)制劑 如粉劑 顆粒劑 水分散粒劑 和可濕性粉劑等 和液態(tài)制劑 如水劑 懸浮劑等 6 目前 美國已有 35 種防治灰霉病的微生物殺菌劑 通過農(nóng)藥登記 有效成分涉及枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis 解淀粉芽胞桿菌 B amyloliquefaciens 短小芽 胞桿菌 B pumilus 地衣芽胞桿菌 B licheniformis 鉤狀木霉菌 Trichoderma hamatum 熒光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens 奧德曼細(xì)基格孢菌 Ulocladium oudemansii 鏈孢粘帚霉 Gliocladium catenulatum 灰綠鏈霉菌 Streptomyces griseoviridis 利迪鏈霉菌 S lydicus 酵母 Yesat 黑酵母菌 Aureobasidium pullulans 寡雄腐霉 Pythium oligandrum 及麝香霉 Muscodor albus 相關(guān)劑型包括乳油 10 個(gè)產(chǎn)品 28 6 懸浮劑 5 個(gè)產(chǎn)品 14 3 顆粒劑 2 個(gè)產(chǎn)品 5 7 可濕性粉劑 5 個(gè)產(chǎn)品 14 3 可溶液劑 6 個(gè)產(chǎn)品 17 1 水劑 2 個(gè)產(chǎn)品 5 7 及粉劑 1 個(gè)產(chǎn)品 2 9 7 種 7 乳油與可溶液劑為美 國登記的防治灰霉病的微生物殺菌劑的主要?jiǎng)┬?歐盟僅有 3 種防治灰霉病的微生物殺菌劑通過農(nóng)藥登記 有效成分分別為解淀粉芽胞桿菌 FZB24 粉紅粘帚霉 Coniothyrium minitans J1446 及釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae LAS02 劑型有可濕性粉劑 2 個(gè)產(chǎn)品 67 與水分散粒劑 1 個(gè)產(chǎn)品 33 2 種 8 我國已有 28 個(gè)防治灰霉病的微生物殺菌劑產(chǎn)品通過國家農(nóng)藥登記 有效成分涉及哈茨木霉菌 T harzianum 木霉菌 T sp 枯草芽胞桿菌 海洋芽胞桿菌 B marinus 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 B methylotrophicus 及熒光假單胞菌 P fluorescens 防治對(duì)象有草莓灰霉病 番茄灰霉病 黃瓜灰霉病 葡萄灰霉病及人參灰 霉病等 6 種病害 但在劑型方面表現(xiàn)單一 僅有可濕性粉劑 25 個(gè)產(chǎn)品 89 和水分散粒劑 3 個(gè)產(chǎn)品 11 2 種劑型 9 相比美國而言 我國的微生物殺菌劑劑型種類單一 此外 顆粒劑 水分散粒劑 懸浮 劑和可溶液劑一般被認(rèn)為是環(huán)保型制劑 而其他制劑在應(yīng)用過程中均產(chǎn)生二次污染 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足綠色農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)的需求 因此 開發(fā)新型環(huán)保型制劑十分必要 水分散片劑是列于我國國家農(nóng)藥制劑標(biāo)準(zhǔn)中的劑型 指在水中崩解 有效成分分散成懸浮液的片狀制 劑 10 在加工過程中 該劑型將母藥 潤濕劑 分散劑 崩解劑 粘結(jié)劑及填料等混合后經(jīng)高壓壓制而成 重量固定的片劑 具備入水后崩解快 有效成分能迅速均勻分布在溶液體系中的特點(diǎn) 11 該類制劑運(yùn)輸 攜帶及使用方便 同時(shí)在生產(chǎn)環(huán)節(jié)和使用過程中無粉塵飛揚(yáng) 最大程度的減少了環(huán)境污染 12 13 但由于水 分散片劑的加工工藝還存在諸多問題 導(dǎo)致國內(nèi)水分散片制劑的品種較少 目前僅有 2 個(gè)水分散片劑產(chǎn)品 通過國家農(nóng)藥登記 其有效成分分別為苯噻酰 五氟磺 硝磺草 除草劑 PD20211114 與 1 甲基環(huán)丙烯 植 物生長調(diào)節(jié)劑 PD20170964 9 尚無微生物農(nóng)藥水分散片劑的登記 同時(shí)有關(guān)微生物農(nóng)藥水分散片劑配 方篩選的報(bào)道亦較少 王勇等 14 呂躍東等 15 16 曾報(bào)道綠色木霉 烯酰嗎啉水分散片劑 300 600 倍液能夠 有效防治番茄灰霉病 黃瓜枯萎病及棉花黃萎病 防效分別達(dá)到 83 95 81 89 與 88 97 本研究以有效防治蔬菜灰霉病的生防枯草芽胞桿菌 BAB 1 17 為研究對(duì)象 通過對(duì)適用助劑 崩解劑 粘結(jié) 劑 分散劑 種類和用量進(jìn)行篩選 確定水分散片劑的適宜配方 并采用盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)其防治效果 為該 菌株進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù) 1 材料與方法 1 1 供試材料 供試藥劑 枯草芽胞桿菌 BAB 1 CGMCC No 2099 母藥 由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所生 產(chǎn) 含量為 2 10 10 CFU g 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉劑 PD20170879 山東康惠植物保護(hù)有限公司生 406 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 產(chǎn) 露娜森 PD20152429 43 氟菌 肟菌酯 拜耳股份公司生產(chǎn) 供試助劑 3 種崩解劑 5 種分散劑及 5 種粘結(jié)劑 詳細(xì)信息見表 1 表 1 供試助劑信息表 Table 1 The information of tested additives 助劑 Additives 用途 Usage 生產(chǎn)廠家 Manufacturer 助劑 Additives 用途 Usage 生產(chǎn)廠家 Manufacturer 酒石酸 崩解劑 上海源葉生物科技有限公司 GY D10 分散劑 北京廣源益農(nóng)化學(xué)有限責(zé)任公司 碳酸氫鈉 崩解劑 天津市福晨化學(xué)試劑廠 聚乙烯吡咯烷酮 K30 PVP K30 粘結(jié)劑 北京索萊寶科技有限公司 氯化鈉 崩解劑 天津市福晨化學(xué)試劑廠 乳糖 粘結(jié)劑 上海源葉生物科技有限公司 亞甲基雙萘磺酸鈉 NNO 分散劑 山東優(yōu)索化工科技有限公司 淀粉 粘結(jié)劑 上海源葉生物科技有限公司 聚萘甲醛磺酸鈉鹽 MF 分散劑 山東優(yōu)索化工科技有限公司 聚乙二醇 6000 PEG6000 粘結(jié)劑 上海源葉生物科技有限公司 木質(zhì)素磺酸鈉 分散劑 上海源葉生物科技有限公司 糊精 粘結(jié)劑 上海源葉生物科技有限公司 SP 2836 分散劑 江蘇擎宇化工科技有限公司 供試作物品種 黃瓜品種為津優(yōu) 1 號(hào) 天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn) 番茄品種為奧賽特 968 北京碩源種子有限公司生產(chǎn) 1 2 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑配方助劑種類篩選 以枯草芽胞桿菌 BAB 1 菌株的存活情況為評(píng)價(jià)指標(biāo) 依據(jù)各供試助劑與菌株 BAB 1 間的生物相容性 而確定助劑種類 針對(duì)各助劑在水中的溶解性設(shè)計(jì)以下兩種測(cè)定方法 1 2 1 可溶于培養(yǎng)基的助劑與菌株BAB 1間生物相容性 崩解劑與分散劑均可溶于水 故采用平板菌落計(jì) 數(shù)法評(píng)價(jià)這兩類助劑與菌株 BAB 1 的相容性 參考劉盼西等 18 方法 并略作修改 稱取 BAB 1 菌株母藥 10 0 g 加入到含有 90 mL 無菌水的三角瓶中 180 r min 振蕩培養(yǎng) 30 min 得到濃度為 0 1 g mL 的溶液 采用系列稀釋法制成 1 10 7 和 1 10 8 g mL 稀釋液 各取 100 L 分別均勻涂布于助劑終濃度為 1 3 5 w v 的 LB 固體培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 0 g 酵母浸粉 5 0 g 氯化鈉 5 0 g 瓊脂 12 0 g 蒸餾水 1000 mL 平板上 35 恒溫培養(yǎng) 12 h 后記錄每個(gè)平板上的菌落數(shù) 每個(gè)供試助劑每個(gè)濃度處理重復(fù) 3 次 以不添 加助劑的 LB 平板作為對(duì)照 1 2 2 不溶于培養(yǎng)基的助劑與BAB 1菌株間相容性 由于粘結(jié)劑在水中溶解性能差 故本部分主要針對(duì)粘 結(jié)劑開展生物相容性研究 將供試粘結(jié)劑按 1 3 5 w v 的比例與 LB 培養(yǎng)基混合 經(jīng)濕熱滅菌 后充分混合制成 LB 固體培養(yǎng)基平板 將活化的菌株 BAB 1 單菌落劃線接種于含有不同粘結(jié)劑的平板上 30 恒溫培養(yǎng) 24 h 后觀察其生長情況 每種供試粘結(jié)劑每個(gè)濃度處理重復(fù) 3 次 以不添加粘結(jié)劑的 LB 固體培養(yǎng)基平板作為對(duì)照 1 3 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑崩解劑最佳用量的確定 固定水分散片劑配方中其他組分不變 采用 L 9 3 3 正交表進(jìn)行 3 因素 3 水平正交試驗(yàn) 以崩解時(shí)間作 為評(píng)價(jià)指標(biāo) 確定最佳崩解劑的用量及適宜組合 試驗(yàn)因素水平設(shè)置列于表 2 1 4 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑粘結(jié)劑及其用量的篩選 固定水分散片劑配方中其他組分不變 單因素更換不同比例的粘結(jié)劑壓制成水分散片劑 參考范春然 19 表 2 崩解劑優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平 Table 2 The factors and levels of disintegrant in orthogonal test 因素 Factor 水平 Level 酒石酸 Tartaric acid A 碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate B 氯化鈉 Sodium chloride C 1 5 15 0 5 2 10 20 1 3 15 25 2 第 2 期 敖明遠(yuǎn)等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的研制 407 的方法 以片劑的外觀和可壓性作為考察指標(biāo) 片劑表面光潔度和可壓性分別分為 5 級(jí) 最優(yōu)的記 5 分 最差的記 1 分 以二者得分之和評(píng)價(jià)片劑優(yōu)劣 得分最高者為最佳組合 1 5 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑分散劑用量的確定 固定水分散片劑配方中其他組分不變 單因素更換不同比例的分散劑 1 2 3 及 4 壓制 成水分散片劑 以懸浮率為指標(biāo) 確定分散劑的最佳用量 1 6 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的加工方法 將一定比例的崩解劑 粘結(jié)劑及分散劑與菌株 BAB 1 母藥混合 經(jīng)混合機(jī) VH 2 型 上海天闔機(jī)械 設(shè)備有限公司 充分混勻后 用單沖電動(dòng)壓片機(jī) DTB 3 型 上海天闔機(jī)械設(shè)備有限公司生產(chǎn) 直接干粉 壓片成水分散片 獲得枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑 1 7 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定 根據(jù) 中華人民共和國藥典 中水分散片劑或微生物農(nóng)藥相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)中的測(cè)定方法對(duì)水分散片劑的 活菌含量 pH 值 崩解時(shí)間 片重差異 懸浮率等性狀進(jìn)行測(cè)定 1 7 1 活菌含量測(cè)定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法 20 測(cè)定水分散片劑的活菌含量 1 7 2 pH值測(cè)定 隨機(jī)抽取水分散片 1 片 投入 50 mL 水中 充分溶解攪勻測(cè)定 pH 值 重復(fù) 6 次 21 1 7 3 崩解時(shí)限檢查 隨機(jī)抽取水分散片 1 片 投入裝有 200 mL 水的燒杯中 水溫為 15 25 當(dāng) 片劑或碎片周圍氣體不再逸出 片劑應(yīng)崩解 溶解或分散于水中 此時(shí)結(jié)束計(jì)時(shí) 重復(fù) 6 次 21 1 7 4 片重差異測(cè)定 隨機(jī)抽取水分散片 20 片 稱量總重量 求得平均片重后 再分別稱定各片重量 每 片的重量與平均質(zhì)量相比 片重差異需在 5 以內(nèi) 超過重量差異限度數(shù)量不多于 2 片 且不能有 1 片超 過限度 1 倍 21 1 7 5 懸浮率測(cè)定 懸浮率測(cè)定采用國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率測(cè)定方法 GB T14825 2006 22 1 8 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑對(duì)蔬菜灰霉病的防效評(píng)價(jià) 采用盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑對(duì)番茄灰霉病與黃瓜灰霉病的防治效果 試驗(yàn)共設(shè) 5 個(gè)處理 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑 500 倍水稀釋液 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散 片劑 1000 倍水稀釋液 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉劑 500 倍水稀釋液 露娜森 1000 倍水稀釋液以及清水 對(duì)照 選擇生長 10 d 左右子葉完全展開的黃瓜幼苗及生長 60 d 左右 3 4 片真葉的番茄幼苗 將不同藥液均 勻噴施于黃瓜與番茄葉面 平均 4 mL 株 待葉面藥液自然風(fēng)干 24 h 后 將番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢 菌 BC 15 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離并保存 菌盤 5mm 貼接于黃瓜葉片中部及番茄 每片復(fù)葉上部 3 片小葉中部 每處理 3 次重復(fù) 每重復(fù) 10 株 病原菌接種后移入 25 恒溫 光照 黑暗 16 h 8 h 相對(duì)濕度 90 的人工氣候室內(nèi) 培養(yǎng) 3 d 后開始觀察發(fā)病情況 當(dāng)空白對(duì)照充分發(fā)病時(shí) 按 下面的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各處理發(fā)病情況 并計(jì)算各處理的病情指數(shù)和防治效果 病情嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0 級(jí) 無病斑 1 級(jí) 病斑面積占葉面積 5 以下 3 級(jí) 病斑面積占葉面積 5 15 5 級(jí) 病斑面積占葉面積 16 25 7 級(jí) 病斑面積占葉面積 26 50 9 級(jí) 病斑面積占葉面 積 50 以上 病情指數(shù) 各級(jí)病葉數(shù) 相應(yīng)病級(jí)值 調(diào)查葉總數(shù) 最高病級(jí)值 100 防治效果 對(duì)照病情指數(shù) 處理病情指數(shù) 對(duì)照病情指數(shù) 100 1 9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析皆采用 minitab16 軟件進(jìn)行處理 應(yīng)用 SPSS 19 0 軟件鄧肯氏新復(fù)極差多重比 較法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析 2 結(jié)果與分析 2 1 助劑與枯草芽胞桿菌 BAB 1 的生物相容性 采用平板菌落計(jì)數(shù)法研究 3 種崩解劑及 5 種分散劑與枯草芽胞桿菌 BAB 1 的生物相容性 結(jié)果表明 崩解劑酒石酸 碳酸氫鈉 氯化鈉與菌株 BAB 1 生物相容性較好 在 1 3 及 5 濃度時(shí)該菌株均可良 好生長且無顯著性差異 圖 1A C 分散劑 NNO 與菌株 BAB 1 生物相容性最好 在 1 3 與 5 濃度 408 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 下該菌株均可良好生長且與對(duì)照無顯著性差異 GY D10 與菌株 BAB 1 生物相容性較好 在 1 與 3 濃度 下不影響該菌株生長 但 5 濃度時(shí)菌株 BAB 1 生長顯著低于對(duì)照 MF 在 1 和 3 濃度時(shí) 菌株 BAB 1 生長顯著低于與對(duì)照 5 濃度時(shí)則完全受到抑制 木質(zhì)素磺酸鈉和 SP 2836 與 BAB 1 菌株生物相容性較 差 僅在 1 濃度時(shí)菌株 BAB 1 能夠生長 并顯著低于對(duì)照 3 和 5 濃度時(shí)則完全受到抑制 圖 2A C a aa a 0 50 100 150 200 250 a a a a 0 50 100 150 200 250 a a aa 0 50 100 150 200 250 CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 氯化鈉 Sodium chloride 助劑 Agent 菌含量 Con c en tratio n 10 8 CFU g 菌含量 Con c en trati on 1 0 8 CFU g 菌含量 Concentrat ion 10 8 CFU g CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 氯化鈉 Sodium chloride CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 氯化鈉 Sodium chloride A B C A 1 B 3 C 5 圖 1 不同崩解劑對(duì)枯草芽胞桿菌 BAB 1 生長的影響 Fig 1 The effect of different disintegrants on the growth of B subtilis BAB 1 采用毒性平板法評(píng)價(jià)了 5 種粘結(jié)劑與枯草芽胞桿菌 BAB 1 的生物相容性 結(jié)果表明 在試驗(yàn)濃度范圍 內(nèi) 除 PVP K30 在高濃度 5 對(duì)枯草芽胞桿菌 BAB 1 生長表現(xiàn)抑制作用外 其他粘結(jié)劑 PEG6000 淀 粉 糊精 乳糖均不影響 BAB 1 菌株的生長 圖 3A E 2 2 崩解劑適宜用量的確定 以崩解時(shí)間為指標(biāo) 對(duì)碳酸氫鈉 酒石酸和氯化鈉 3 種崩解劑的最適用量進(jìn)行篩選 正交試驗(yàn)結(jié)果 表 3 表明 各因素水平組合間崩解時(shí)間差異較大 直觀分析結(jié)果表明處理 9 A3B3C2 崩解時(shí)間最短 274 s 而正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明 碳酸氫鈉 B 的 delta 值最大 說明碳酸氫鈉的用量對(duì)水分散片劑崩解 時(shí)間的影響最大 其次為酒石酸 A 氯化鈉 C 的影響最小 表 3 因此最佳組合應(yīng)為 A2B3C2 經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證 A2B3C2 與 A3B3C2 兩種組合崩解時(shí)間無顯著性差異 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分 第 2 期 敖明遠(yuǎn)等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的研制 409 a a b a c c 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 助劑 Agent a a b a cc 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 木質(zhì)素磺酸鈉 Sodium ligninsulfonate 菌含量 Concentr ation 10 8 CFU g a a c b cc 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 木質(zhì)素磺酸鈉 Sodium ligninsulfonate 木質(zhì)素磺酸鈉 Sodium ligninsulfonate 菌含量 Co ncentrati on 1 0 8 CFU g 菌含量 Co ncen trati on 1 0 8 CFU g A B C A 1 B 3 C 5 圖 2 不同分散劑對(duì)枯草芽胞桿菌 BAB 1 生長的影響 Fig 2 The effect of different dispersants on the growth of B subtilis BAB 1 AB CDE CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 A PEG6000 B PVP K30 C 淀粉 Starch D 糊精 Dextrin E 乳糖 Lactose 圖 3 不同粘結(jié)劑與枯草芽胞桿菌 BAB 1 的生物相容性評(píng)價(jià) Fig 3 The biocompatibility evaluation between different binders and B subtilis BAB 1 410 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 析 表 4 表明 因素 B 的 P 0 05 即碳酸氫鈉對(duì)崩解時(shí)間的影響顯著 P 0 05 因素 A 的 P 0 10 即酒石酸對(duì)崩解時(shí)間有一定的影響 因素 C 的 P 0 10 即氯化鈉對(duì)其無顯著性影響 因此 綜合直觀分 析與方差分析的結(jié)果 再加上成本因素考慮 選擇 A1B3C1 為最佳組合 即酒石酸 5 碳酸氫鈉為 25 氯化鈉為 0 5 表 3 崩解劑配比優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 3 The results of orthogonal test to optimize disintegrant proportion 處理 Treatments 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate B 氯化鈉 Sodium chloride C 崩解時(shí)間 Disintegration time s 1 1 1 1 298 2 1 2 2 287 3 1 3 3 279 4 2 1 2 288 5 2 2 3 286 6 2 3 1 276 7 3 1 3 292 8 3 2 1 286 9 3 3 2 274 k 1 288 0 292 7 286 7 k 2 283 3 286 3 283 0 k 3 284 0 276 3 285 7 delta 4 7 16 3 3 7 排秩 Rank Cases 2 1 3 注 k 1 k 2 和 k 3 分別代表各因素水平下水分散片劑崩解時(shí)間的均值 Note k 1 k 2 and k 3 represent the mean disintegration time of the tested formulation at different disintegrant dosages 表 4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表 Table 4 Analysis of variance of orthogonal design results 因素 Factor 偏差平方和 Sum of square of deviations 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F P A 38 222 2 19 111 9 053 0 099 B 406 889 2 203 444 96 374 0 010 C 21 556 2 10 778 5 106 0 164 誤差 Error 4 222 2 2 111 2 3 粘結(jié)劑的篩選 以水分散片劑的外觀和可壓性作為評(píng)價(jià)指標(biāo) 對(duì)粘結(jié)劑的種類及含量進(jìn)行篩選 結(jié)果表明 以 2 PEG6000 和 5 乳糖配方壓片形成的水分散片劑得分最高 10 表 5 該組合形成的片劑硬度適中 表面光滑平整 綜合性能優(yōu)于其他粘結(jié)劑組合 2 4 分散劑的篩選 2 1 結(jié)果表明分散劑 NNO 和 GY D10 與枯草芽胞桿菌 BAB 1 生物相容性較好 結(jié)合成本考慮 選擇 NNO 作為水分散片劑的分散劑 通過單因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)了不同 NNO 用量對(duì)水分散片劑懸浮率的影響 結(jié)果 表明 隨著 NNO 用量的增加 水分散片劑的懸浮率逐漸提高 當(dāng)用量為 4 時(shí) 懸浮率最高達(dá)到 69 1 因此選擇 4 為最佳用量 圖 4 2 5 水分散片劑最佳配方的確定及主要性能指標(biāo) 通過以上配方篩選試驗(yàn) 確定了枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑適宜配方 崩解劑 酒石酸 5 碳 酸氫鈉 25 氯化鈉 0 5 粘結(jié)劑 乳糖 5 PEG6000 2 分散劑 NNO 4 菌株 BAB 1 母藥補(bǔ)足至 100 最終研制成枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑 該片劑的直徑為 1 5 cm 厚度 0 4 cm 硬度適中 第 2 期 敖明遠(yuǎn)等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的研制 411 表 5 不同粘結(jié)劑及其用量對(duì)水分散片劑質(zhì)量的影響 Table 5 The effect of different binders and their dosages on BAB 1 WT quality 處理 Treatment PEG6000 PVP K30 淀粉 Starch 糊精 Dextrin 乳糖 Lactose 光潔度 Smoothness 可壓性 Compatibility 總分 Total score 1 0 0 0 0 0 1 1 2 2 0 5 0 0 0 2 2 4 3 0 0 5 0 0 2 2 4 4 0 0 0 5 0 2 4 6 5 0 0 0 0 5 2 5 7 6 2 5 0 0 0 5 2 7 7 2 0 5 0 0 5 2 7 8 2 0 0 5 0 5 4 9 9 2 0 0 0 5 5 5 10 注 表中供試助劑列中數(shù)據(jù)為在其供試制劑中的用量 w w Note Data in the tested adjuvant column is the dosage percentage ratio w w in the tested formulation a b c d 0 20 40 60 80 CK 2 3 4 添加比例 Addition proportion 圖 4 不同 NNO 用量對(duì)水分散片劑懸浮率的影響 Fig 4 The effect of different dosages of NNO on suspension rate of BAB 1 WT 表面光滑平整 片重為 1 5681 0 0080 g 有效 成分含量為 100 億 CFU g 崩解時(shí)間 272 17 s pH 值 5 75 懸浮率為 73 77 表 6 2 6 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑對(duì)番茄和黃 瓜灰霉病防治效果 通過溫室盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)了該制劑對(duì)黃瓜灰霉 病和番茄灰霉病的防治效果 結(jié)果表明 當(dāng)清水對(duì) 照處理病情指數(shù)達(dá)到 33 75 黃瓜灰霉病 和 37 51 番茄灰霉病 時(shí) 枯草芽胞桿菌水分散片劑 500 表 6 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的主要性狀 Table 6 The main characteristics of Bacillus subtilis BAB 1 WT 指標(biāo) Index 測(cè)定結(jié)果 Tested results 有效成分含量 content of active ingredient 100 億 CFU g pH 5 75 0 07 片重 Tablet weight 1 5681 0 0080 崩解時(shí)間 Time 272 17 3 31 s 懸浮率 Suspension rate 73 77 1 36 倍與 1000 倍水稀釋液處理能顯著降低黃瓜和番茄灰霉病的病情指數(shù) 表明兩處理的防治效果顯著 表 7 該制劑兩個(gè)濃度處理對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果分別為 84 11 和 79 48 與對(duì)照藥劑露娜森的防 治效果無顯著性差異 但顯著高于 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉劑 同時(shí)該制劑 500 倍水稀釋液對(duì)番茄 灰霉病的防治效果為 75 15 與對(duì)照藥劑露娜森無顯著性差異 顯著高于 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉 劑 但該制劑 1000 倍水稀釋液對(duì)番茄灰霉病的防治效果為 59 32 與 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉劑 無顯著性差異 412 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 表 7 100 億 CFU g 枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑對(duì)黃瓜和番茄灰霉病的防治效果 Table 7 Control efficacy of 10 billion CFU g Bacillus subtilis BAB 1 WT against gray mold on cucumber and tomato 黃瓜灰霉病 Cucumber gray mold 番茄灰霉病 Tomato gray mold 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy 清水對(duì)照 CK 33 75 1 60 a 37 51 4 97 a 露娜森 Lunasen1000 8 76 1 94 c 76 25 5 29 a 6 54 1 50 c 84 85 3 52 a 2 億孢子 g 木霉菌可濕性粉劑 2 10 8 conidia g Trichoderma WP 500 13 76 1 49 b 62 71 4 04 b 18 15 4 76 b 57 95 12 22 b 100 億 CFU g 枯草芽胞桿菌水分散片劑 B subtilis BAB 1 WT 1000 7 57 2 53 c 79 48 7 04 a 17 55 1 97 b 59 32 5 46 b 100 億 CFU g 枯草芽胞桿菌水分散片劑 B subtilis BAB 1 WT 500 5 86 0 75 c 84 11 4 13 a 10 72 0 82 c 75 15 2 78 a 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小寫字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 3 討論 在 農(nóng)藥和化肥 雙減的國家戰(zhàn)略驅(qū)動(dòng)下 微生物殺菌劑成為植物保護(hù)領(lǐng)域中最熱門的研發(fā)重點(diǎn)之一 但在微生物殺菌劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中仍存在許多問題 其中制劑工藝創(chuàng)新被列為重要關(guān)鍵技術(shù) 微生物殺菌 劑制劑優(yōu)劣及其加工工藝是決定生防菌能否走向市場(chǎng)的關(guān)鍵因素 23 微生物殺菌劑的有效成分為活體生防微生物 因此保證制劑中各種助劑成分不影響有效成分的存活 即生防微生物與助劑生物學(xué)相容性 成為微生物殺菌劑制劑創(chuàng)制中關(guān)鍵技術(shù)問題 關(guān)于生防微生物與助劑 生物學(xué)相容性的研究報(bào)道較多 李姝江等 23 通過研究發(fā)現(xiàn)載體高嶺土和白炭黑 潤濕劑十二烷基苯磺酸鈉 對(duì)解淀粉芽胞桿菌 BA 12 的活性影響最小 可以作為可濕性粉劑研發(fā)的載體與助劑 程立君等 24 對(duì) 4 種穩(wěn) 定劑和 5 種紫外保護(hù)劑進(jìn)行篩選 確定 CMC Na 糊精和黃原膠對(duì)酷綠木霉 TR1 菌絲生長和孢子萌發(fā)沒有 影響 能夠用于木霉可濕性粉劑的研制 明亮等 25 通過篩選載體與助劑 確定了解淀粉芽胞桿菌 B1619 水分散粒劑的最佳配方 而關(guān)于制備水分散片劑的助劑篩選研究報(bào)道較少 本試驗(yàn)以生物學(xué)相容性試驗(yàn)和 正交試驗(yàn)結(jié)合 篩選枯草芽胞桿菌 BAB 1 水分散片劑的適宜助劑并確定適宜用量 為該生防微生物菌株的 制劑化提供了豐富的科學(xué)數(shù)據(jù)支撐 前期本實(shí)驗(yàn)室以枯草芽胞桿菌 BAB 1 為有效成分 研制了 100 億 CFU g 枯草芽胞桿菌粉塵劑 該制 劑對(duì)番茄灰霉病的室內(nèi)防效達(dá)到 57 14 71 43 對(duì)黃瓜灰霉病的室內(nèi)防效達(dá)到 48 80 17 該制劑對(duì)黃 瓜灰霉病的防效低于本研究中水分散片劑的防效 雖然粉塵劑能夠有效降低棚室內(nèi)濕度 降低病害發(fā)生率 但該制劑在研制及使用過程中會(huì)出現(xiàn)粉塵飛揚(yáng) 易于對(duì)環(huán)境造成污染 危害人類