38 1 97 107 中國生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 2 月 收稿日期 2021 10 08 基金項(xiàng)目 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2019JZZY020707 上海市科委重點(diǎn)研究計(jì)劃重點(diǎn) 18391902400 作者簡(jiǎn)介 郝大志 碩士研究生 E mail 574642689 通信作者 教授 E mail jiechen59 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 08 005 海藻渣復(fù)配微生物菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的協(xié)同增效作用 郝大志 1 王詠坤 1 陳 捷 1 辛舟生 2 高永東 3 1 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 200240 2 山東潔晶集團(tuán)股份有限公司 日照 276826 3 上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 上海 201100 摘要 海藻渣資源化高效利用對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要意義 通過比較海藻渣與棘孢木霉菌劑 解淀粉芽胞桿 菌菌劑單一和復(fù)配使用對(duì)黃瓜苗期枯萎病的防效和寄主防御反應(yīng)的影響 明確海藻渣和復(fù)合菌劑協(xié)同增效 作用 結(jié)果表明 1 海藻渣 3 0 10 5 cfu g 棘孢木霉菌劑 2 0 10 8 cfu g 解淀粉芽胞桿菌菌劑 T1 拌 土處理對(duì)枯萎病防效達(dá) 93 39 較單獨(dú)使用棘孢木霉 解淀粉芽胞桿菌混合菌劑 T3 提高 11 71 接 種鐮孢菌 9 d 后 T1 處理的葉片 POD SOD CAT PPO PAL 活性均顯著高于 T3 T1 處理的葉片和根 部 SA 含量也顯著高于 T3 證明了海藻渣的添加增強(qiáng)了木霉和芽胞桿菌對(duì)黃瓜枯萎病的防效 T1 誘導(dǎo)黃 瓜 SA 防御反應(yīng)基因表達(dá)也有類似變化規(guī)律 相關(guān)性分析表明 添加海藻渣與木霉和芽胞桿菌誘導(dǎo)黃瓜抗 枯萎病相關(guān)信號(hào)物質(zhì)產(chǎn)生和基因及酶活表達(dá)呈正相關(guān) 綜合上述研究結(jié)果 證明了三種組分的復(fù)合制劑協(xié) 同產(chǎn)生的微生態(tài)效應(yīng)和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性作用是防治黃瓜苗期枯萎病協(xié)同增效的主要原因 關(guān) 鍵 詞 木霉菌 芽胞桿菌 海藻渣 黃瓜枯萎病 系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性 中圖分類號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 01 0097 11 Synergistic Effect of Seaweed Residue Combined with Microbial Inoculum on Cucumber Fusarium Wilt Control HAO Dazhi 1 WANG Yongkun 1 CHEN Jie 1 XIN Zhousheng 2 Gao Yongdong 3 1 College of Agriculture and Biology Shanghai Jiaotong University Shanghai 200240 China 2 Shandong Jie Jing Group Co Ltd Rizhao 276826 China 3 Shanghai Agricultural Technology Extension Service Center Shanghai 201100 China Abstract The efficient utilization of seaweed residue is of great significance to environmental protection This study aimed to understand the synergistic effects of seaweed residue Trichoderma asperellum and Bacillus amyloliquefaciens against cucumber Fusarium wilt by comparing seaweed residue and Trichoderma Bacillus in single or in combination The results showed that soil treatment with 1 seaweed residue 3 0 10 5 cfu g Trichoderma asperellum 2 0 10 8 cfu g Bacillus amyloliquefaciens T1 could effectively improve the control effect against cucumber Fusarium wilt with the efficacy of 93 39 Compared with Trichoderma Bacillus T3 T1 increased the contol efficacy by 11 71 After 9 days of inoculation with Fusarium oxysporum compared with T3 T1 was more effective in the induction of POD SOD CAT PPO and PAL enzyme activities in leaves and the accumulation of endogenous salicylic acid in roots and leaves indicating that the addition of seaweed residue enhanced the control effect of Trichoderma and Bacillus on cucumber Fusarium wilt The qPCR results showed that the addition of seaweed residue enhanced the ability of Trichoderma and Bacillus to induce defense response and the expression level of SA pathway gene increased Correlation analysis showed that the addition of seaweed residue was positively correlated with Trichoderma and Bacillus to induce the production of signal substances related to cucumber Fusarium wilt resistance and the expression of genes and enzyme activities In conclusion the major reason that the micro ecological effect and systemic induced resistance effect against the cucumber Fusarium 98 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 wilt was significantly generated by the synergistic action among seaweed residue Trichoderma and Bacillus Key words Trichoderma Bacillus seaweed residue cucumber Fusarium wilt induced systemic resistance 國內(nèi)外對(duì)于海藻渣的綜合利用已有大量的研究 1 3 海藻渣含粗蛋白約 20 粗纖維約 50 灰分約 3 此外還富含水楊酸 茉莉酸 脫落酸 赤霉素等 10 余種生物刺激素及超氧化物歧化酶等 4 6 因此海 藻渣所制備有機(jī)肥可以提高植物的光合作用 抗逆能力及耐鹽堿性 從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì) 7 11 木霉 及芽胞桿菌是常見的植物促生菌及植物土傳病害生物防治微生物 主要通過拮抗 競(jìng)爭(zhēng) 重寄生和誘導(dǎo)抗 性等機(jī)制來保護(hù)植物免受病原菌侵襲 12 13 在黃瓜枯萎病防治方面 季倩茹等 14 研究表明 巨大芽胞桿菌 B213 多粘類芽胞桿菌 B207 和枯草芽胞桿菌 B204 三菌聯(lián)合對(duì)黃瓜枯萎病的防治及防御反應(yīng)酶系的誘導(dǎo) 有明顯協(xié)同增效作用 朱森林等 15 創(chuàng)制的深綠木霉水分散粒劑的防效超過化學(xué)藥劑 葉片抗性氧化酶活性 葉綠素和脯氨酸含量明顯增加 廉華等 16 研究表明 木霉菌分生孢子和厚垣孢子均能增加黃瓜幼苗葉片過 氧化物酶 peroxidase POD 過氧化氫酶 catalase CAT 抗壞血酸過氧化物酶 ascorbic acid peroxidase APX 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 活性 提高對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果 盡管木霉 菌與芽胞桿菌的組合使用在防治植物土傳病害方面具有明顯的協(xié)同增效作用 17 19 但關(guān)于海藻渣與木霉 芽胞桿菌復(fù)合菌劑在防治病害中的協(xié)同增效作用研究并不多見 蘇東海等 20 用枯草芽胞桿菌 乳酸菌 酵 母菌等混合菌株對(duì)海藻渣進(jìn)行發(fā)酵 其粗纖維含量大幅提高 趙忠祥等 21 利用綠色木霉固體發(fā)酵海帶渣 發(fā)酵過程中纖維素被顯著分解 還原糖含量提高 說明了海藻渣可以被木霉菌 芽胞桿菌分解利用 目前 大部分的微生物菌劑主要選用硅藻土 高嶺土等惰性物質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)和孢子載體 而海藻渣則可作為很好的菌 劑營(yíng)養(yǎng)載體及促生物質(zhì)來源 周瑩等 22 制備了以海藻渣為載體的枯草芽胞桿菌菌劑 有效防治了丹參根腐 病 但海藻渣與木霉菌的復(fù)配使用未有報(bào)道 實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)了海藻渣復(fù)配木霉菌劑 芽胞桿菌 菌劑對(duì)黃瓜幼苗促生作用的協(xié)同增效 因此研究海藻渣與木霉和芽胞桿菌復(fù)合菌劑間在防治黃瓜苗期枯萎 病中的協(xié)同作用機(jī)制 對(duì)高效利用海藻渣 開發(fā)添加海藻渣的新型復(fù)合生物農(nóng)藥或生防菌劑具有重要意義 本研究將棘孢木霉 Trichoderma asperellum 解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 與海藻渣制備 成復(fù)合制劑 通過與單一海藻渣制劑 單一混合菌制劑比較 明確三者防治黃瓜枯萎病 促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的 協(xié)同增效作用 為海藻渣資源化利用探索一條新途徑 1 材料與方法 1 1 供試材料 1 1 1 供試作物 黃瓜 申青一號(hào) 購買于上海富農(nóng)種業(yè)有限公司 1 1 2 供試海藻渣 平均粒徑 0 25 mm 由山東結(jié)晶集團(tuán)股份有限公司提供 1 1 3 供試菌劑 棘孢木霉 Trichoderma asperellum GDFS1009 菌劑 2 億 cfu g 載體硅藻土 由本實(shí)驗(yàn) 室提供 解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens FS1841 菌劑 2000 億 cfu g 載體麥芽糊精 由四川 龍蟒福生科技有限公司提供 1 1 4 供試病原菌 黃瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum 由本實(shí)驗(yàn)室提供 1 1 5 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基 potato pextrose agar PDA 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂 20 g 蒸餾水 1000 mL pH 自然 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 potato pextrose PD 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 蒸餾水 1000 mL pH 自然 1 1 6 供試栽培基質(zhì)與土壤 蔬菜栽培有機(jī)基質(zhì) 有機(jī)質(zhì)含量 55 2 購買于丹陽市茂禾有機(jī)肥料有限公司 自然田土 有機(jī)質(zhì)含量 2 76 自然田土壤過 1 mm 篩后與有機(jī)基質(zhì) 1 1 混合 121 高溫蒸汽滅菌 1 h 1 1 7 供試化學(xué)試劑 水楊酸 Sigma Aldrich CAS No 69 72 7 茉莉酸 Sigma Aldrich CAS No 77026 92 7 多酚氧化酶 PPO 檢測(cè)試劑盒 雷根生物技術(shù)有限公司 Cat TE0427 超氧化物 歧化酶 SOD 檢測(cè)試劑盒 雷根生物技術(shù)有限公司 Cat TE0720 過氧化物酶 POD 檢測(cè)試劑盒 雷根生物技術(shù)有限公司 Cat TE0423 過氧化氫酶 CAT 檢測(cè)試劑盒 雷根生物技術(shù)有限公司 Cat TE0740 苯丙氨酸解氨酶 PAL 檢測(cè)試劑盒 雷根生物技術(shù)有限公司 Cat TE0401 第 1 期 郝大志等 海藻渣復(fù)配微生物菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的協(xié)同增效作用 99 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 病原菌孢子懸浮液的制備 將黃瓜枯萎病病原菌在 PDA 培養(yǎng)基上 28 活化培養(yǎng) 3 d 轉(zhuǎn)接到 PD 培養(yǎng)基上 28 200 r min 培養(yǎng) 5 d 發(fā)酵液經(jīng) 8 層紗布過濾后獲得孢子懸浮液 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)孢 子懸液的孢子數(shù) 并將孢子懸浮液稀釋至 1 10 6 cfu mL 1 2 2 盆栽處理與方法 將海藻渣 木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 載體分別按照不同處理與土壤混勻 使得 土壤中的海藻渣含量為 1 木霉含量為 3 0 10 5 cfu g 芽胞桿菌含量為 2 0 10 8 cfu g 共 4 個(gè)處理 海 藻渣 木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 T1 海藻渣 T2 木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 T3 和空白載體處理 CK 上述制劑與土壤均勻混合 每個(gè)處理播種 3 個(gè)育苗盤 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì) 處理方法 將不同處理的土壤裝入 21 孔塑料育苗盤 34 5 cm 24 cm 11 cm 中 每孔栽入催芽 黃瓜種子 2 粒 播種后充分澆水 直至穴盤底部排水孔有水溢出 在人工氣候室內(nèi)培育 育苗光照時(shí)間 為 16 h 光照 8 h 黑暗 室內(nèi)溫度控制 24 25 每 3 d 澆施 1000 mL 無菌水 3 d 后每穴只保留一 棵苗生長(zhǎng) 病菌接種與取樣 栽種 15 d 后灌根接種黃瓜枯萎病菌 1 10 6 cfu mL 每穴 5 mL 分別于接種病菌 0 3 6 和 9 d 后取黃瓜第二片真葉與主根系 用錫箔紙包好 在接種病原菌當(dāng)天取主根表面土壤 放入黑色 離心管 置于 80 冰箱中保存 用于后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定 1 3 黃瓜根系防御反應(yīng)物質(zhì)測(cè)定 1 3 1 水楊酸和茉莉酸的提取 稱取 0 1 g 黃瓜 二葉期幼苗 根系與第二片真葉 液氮中研磨至粉碎 向粉末中加入 1 mL 提取緩沖液 甲醇 水 甲酸 70 29 1 4 振震蕩 30 min 后于 4 13000 r min 離心 20 min 取上清液 再經(jīng)離心濃縮儀濃縮 6 h 殘?jiān)?200 L 甲醇溶解 獲得茉莉酸 JA 和水楊酸 SA 粗提樣 保存于棕色瓶 1 3 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將水楊酸 茉莉酸標(biāo)品配置成 0 5 1 5 10 50 100 500 和 1000 ng mL 的混合 標(biāo)品 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)峰面積與濃度的線性關(guān)系 y 1 1e 003x 4 65e 004 r 0 9995 計(jì)算水楊酸 濃度 y 2 54e 003x 1 17e 003 r 0 9995 計(jì)算茉莉酸濃度 1 3 3 茉莉酸 jasmonic acid JA 和水楊酸 salicylic acid SA LC MS MS 分析 超高效液相色譜 三 重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 Nexera LC30AD SCIEX SelexION Triple Quad 5500 System 日本島津公司 Sciex 公司 色譜條件 色譜柱為 ACQUITY BEH C18 液相柱 2 1 mm 100 mm 1 7 m 進(jìn)樣量為 5 L 流動(dòng)相 為 0 1 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 甲酸水溶液 A 相 和甲酸乙腈 B 相 柱溫為 40 質(zhì)譜條件 ESI 負(fù)離子模式 氣簾氣 35 psi 離子化電壓 4500 V 去溶劑溫度 500 霧化氣 55 psi 輔助加熱氣 55 psi 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè) multiple reaction monitoring MRM 分析 1 3 4 茉莉酸 JA 和水楊酸 SA 含量計(jì)算 C樣 A 樣 C 標(biāo) V 標(biāo) A 標(biāo) V 樣 其中 A 峰面積 C 濃度 V 體積 標(biāo) JA SA 標(biāo)樣 樣 待測(cè)樣品 單位鮮重樣品 JA SA 含量 ng g C 樣 定容體積 樣品鮮重 1 4 黃瓜葉片抗氧化酶系活性測(cè)定 葉片酶活測(cè)定方法 多酚氧化酶 polyphenol oxidase PPO 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 過氧化物酶 peroxidase POD 過氧化氫酶 catalase CAT 苯丙氨酸解氨酶 L phenylalanin ammo nialyase PAL 活性測(cè)定方法參照試劑盒說明書 PPO 活性單位為每 1 min 吸光度變化 0 01 所需酶 量為一個(gè)活性單位 U SOD 活性單位以抑制氮藍(lán)四唑 nitroblue tetrazolium NBT 光化還原的 50 為一個(gè)酶活性單位 U POD 活性單位為每 1 min 吸光度變化 0 01 所需酶量為一個(gè)活性單位 U CAT 活性單位為在 37 1 min 催化水解 1 moL 過氧化氫量為一個(gè) CAT 酶活力單位 U PAL 活性單位為 每 1 h 吸光度變化 0 01 所需酶量為一個(gè)酶活性單位 U 1 5 黃瓜葉片防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)分析 RNA 提取與 cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成 按照總 RNA 提取試劑盒說明書提取總 RNA 使用 NanoDrop 超微量 分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度后 保存于 80 以總 RNA 為反轉(zhuǎn)錄模板 按照試劑盒說明書進(jìn)行基因 100 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 組 DNA 去除與反轉(zhuǎn)錄 16 L 基因組 DNA 去除體系 50 ng L 終濃度模板 4 g DNA wiper Mix 4 L RNase free ddH 2 O 補(bǔ)足至 16 L 42 反應(yīng) 2 min 20 L 反轉(zhuǎn)錄體系 16 L 去除基因組 DNA 模板 5 HiScript qRT SuperMix 4 L PCR 反應(yīng)程序 37 孵育 15 min 85 加熱失活 5 s 將反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 于 20 保存?zhèn)溆?實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析 20 L 反應(yīng)體系 50 ng L cDNA 2 0 L 10 mol L 正反向引物 表 1 各 0 4 L 2 ChamQ Universal SYBR qPCR Super Mix 10 0 L ddH 2 O 補(bǔ)足至 20 L 反應(yīng)程序 95 預(yù)變性 300 s 95 變性 10 s 60 退火 30 s 40 個(gè)循環(huán) 95 熔解 10 s 65 熔解 60 s 97 熔解 1 s 37 冷卻 30 s 以 EF1 為內(nèi)參 設(shè) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù) 反應(yīng)結(jié)束后 觀察熔解曲線趨勢(shì)是否正確 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光 定量 PCR 儀檢測(cè)到的 CT 值 按照 2 CT 法 計(jì)算不同處理時(shí)間下黃瓜葉片中目的基因的相對(duì)表達(dá)量 表 1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物 Table 1 The primers of the quantitative real time PCR 引物名稱 Primer name 引物序列 Primer sequence 5 3 目的片段名稱 Amplification EF1 F EF1 R CTGTGCTGTCCTCATTATTG AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC 內(nèi)參基因 PR1 F PR1 R TGCTCAACAATATGCGAACC TCATCCACCCACAACTGAAC 水楊酸途徑 PAD4 F PAD4 R AGAACAGCAAGCAGAATAGGAC CTTGAAGCAATCGTAGTAACCC 水楊酸途徑 LOX1 F LOX1 R TTGGAGGAAACAAAATCAAAGGGA TGGCACTAATGAGTTGGAAAGAAA 茉莉酸途徑 LOX2 F LOX2 R CCTAAGAGCAAACTTGACCCA CAATGCCTCAGCAACTGTAAG 茉莉酸途徑 EIN2 F EIN2 R ACAAAAGGGGCACCAGC CCAACTCTCAGTAGAAGGCAA 乙烯途徑 ACC F ACC R AGAACACATAGCCAGCAAAGG GGAGATGACGGAGGAAGAAAG 乙烯途徑 NPR1 F NPR1 R TTACTGATAAGGGCAAGAAGGCC AAAGTTCACAAAGAGCAGGATGG 水楊酸途徑 1 6 黃瓜苗期枯萎病防效 病原菌接種 9 d 后統(tǒng)計(jì)黃瓜苗期枯萎病病情指數(shù) 黃瓜苗期枯萎病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照方中達(dá) 23 的分級(jí)標(biāo) 準(zhǔn) 0 級(jí) 無癥狀 1 級(jí) 真葉 子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的 50 2 級(jí) 真葉 子葉黃化或萎蔫 面積超過總面積的 50 3 級(jí) 葉片萎蔫或枯死 僅生長(zhǎng)點(diǎn)存活 4 級(jí) 全株嚴(yán)重萎蔫 以致枯死 病情 指數(shù)參照宗兆鋒和康振生 24 的計(jì)算方法 病情指數(shù) 病級(jí)數(shù) 該病級(jí)植株數(shù) 最大病級(jí)數(shù) 植株總 株數(shù) 100 防治效果 對(duì)照組病情指數(shù) 處理組病情指數(shù) 對(duì)照病情指數(shù) 100 1 7 相關(guān)性分析 將海藻渣 木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 T1 與木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 T3 所測(cè)的各項(xiàng)酶活 SA 含 量 JA 含量 基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析 相關(guān)系數(shù)越接近 1 說明 T1 與 T3 在該項(xiàng)為協(xié)同增效 1 8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用 GraphPad Prism 9 0 軟件進(jìn)行圖表制作 數(shù)據(jù)采用 SAS 9 4 軟件通過最小顯著差異法 LSD 比較 不同處理間的差異顯著性 2 結(jié)果與分析 2 1 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑防治黃瓜苗期枯萎病 海藻渣 木霉 芽胞桿菌混合菌劑 T1 海藻渣單獨(dú)使用 T2 木霉 芽胞桿菌混合菌劑 T3 與 CK 間病情指數(shù)出現(xiàn)顯著差異 T1 T2 T3 處理病情指數(shù)極顯著低于 CK 處理 海藻渣 木霉 芽胞桿 菌混合菌劑 T1 的防治效果顯著高于海藻渣單獨(dú)使用 T2 及木霉 芽胞桿菌混合菌劑單獨(dú)使用 T3 木霉 芽胞桿菌混合菌劑 T3 的防治效果顯著高于海藻渣單獨(dú)使用 T2 海藻渣單獨(dú)使用 T2 的防 治效果較差 平均防效只有 25 79 證明海藻渣本身誘導(dǎo)黃瓜幼苗對(duì)枯萎病是有限的 木霉 芽胞桿菌混 合菌劑 T3 平均防效為 81 78 添加海藻渣后防效提高到 93 49 提高了 11 71 結(jié)果表明海藻渣可 以增強(qiáng)木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑對(duì)黃瓜幼苗枯萎病防效 海藻渣與木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑對(duì)黃瓜幼苗枯 萎病防效協(xié)同增效 表 2 圖 1 第 1 期 郝大志等 海藻渣復(fù)配微生物菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的協(xié)同增效作用 101 表 2 海藻渣復(fù)配微生物菌劑處理對(duì)黃瓜枯萎病防效的影響 Table 2 Effect of seaweed residue combined with microbial agents on cucumber Fusarium wilt 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect 海藻渣 木霉菌劑 芽胞桿菌菌劑 Seaweed residue Trichoderma Bacillus T1 5 95 93 49 a 海藻渣 Seaweed residue T2 67 86 25 79 c 木霉菌劑 芽胞桿菌菌 Trichoderma Bacillus T3 16 67 81 78 b 空白硅藻土處理 CK 91 67 注 表中數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)差異顯著性 P 0 05 下同 Note Data were mean SD values in the same column followed by different letters were significantly different P 0 05 according to least significant difference test The same below 圖 1 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的影響 Fig 1 Influence of seaweed residue on the control effect of Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents gainst cucumber Fusarium wilt 2 2 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響 通過灌根接種尖孢鐮刀菌后 0 3 6 和 9 d 測(cè)定葉片抗氧化酶系的活性結(jié)果表明 葉片超氧化物歧化 酶 SOD 與苯丙氨酸解氨酶 PAL 活性變化趨勢(shì)相近 與 CK 相比 未接種病原菌情況下的 T1 T2 和 T3 處理的葉片 SOD 活性及 PAL 活性均顯著高于 CK 隨著接種病菌后時(shí)間的增加 各處理的植物防御 反應(yīng)逐漸加強(qiáng) 其中 T1 處理的大部分時(shí)間節(jié)點(diǎn)中的葉片 SOD 活性 PAL 活性均高于 T3 和 T2 處理 可 見海藻渣能增強(qiáng)木霉 芽胞桿菌混合菌劑對(duì)葉片 SOD 和 PAL 活性的誘導(dǎo) 圖 2 隨著接種病菌后時(shí)間增加 T1 T3 的 POD CAT 活性均顯著提高 PPO 變化較為復(fù)雜 但在 9 d 時(shí) T1 的 POD PPO CAT 活性為所有處理中最高 且 T1 T3 T2 圖 2 綜上試驗(yàn)結(jié)果 由于抗氧化酶系統(tǒng)變化較為復(fù)雜 在病原菌剛接種時(shí)不同處理中 POD SOD CAT PPO PAL 活性變化并不一致 但 T1 處理的黃瓜葉片 POD SOD CAT PPO PAL 活性均隨著接種病 原菌后的天數(shù)增加而提高 T1 處理葉片的酶活在 9 d 時(shí)均高于 T2 T3 及 CK 海藻渣對(duì)黃瓜抗氧化系統(tǒng) 酶活有一定的誘導(dǎo)作用 添加海藻渣可以進(jìn)一步增強(qiáng)微生物菌劑的誘導(dǎo)效果 海藻渣與木霉 芽胞桿菌混 合菌劑在誘導(dǎo)黃瓜抗氧化酶系統(tǒng)中表現(xiàn)為協(xié)同增效 圖 2 2 3 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜根部和葉片水楊酸和茉莉酸含量變化的影響 在未接種病菌情況下 海藻渣及微生物菌劑對(duì)黃瓜根系茉莉酸積累有顯著影響 T1 處理中茉莉酸含量 是 CK 的 0 46 倍 T2 T3 處理的茉莉酸含量則低于 CK 接種后 6 d T1 T2 T3 處理的茉莉酸含量仍呈 降低趨勢(shì) 但水楊酸含量則逐漸增加 推測(cè)可能與茉莉酸信號(hào)通路途徑和水楊酸信號(hào)通路途徑間存在拮抗 關(guān)系有關(guān) 圖 3A 在未接種病菌的情況下 海藻渣及海藻渣 木霉 芽胞桿菌混合菌劑對(duì)黃瓜根系水楊酸含量無顯著影 響 但在接種病原菌后則顯著提高黃瓜根系積累水楊酸的速度 在接種病原菌 3 d 后 T1 中水楊酸含量為 CK 的 0 5 倍 而 T2 T3 水楊酸含量無顯著變化 在接種病原菌 6 d 后 T2 水楊酸迅速上升至 CK 的 0 75 102 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 CK T1 T2 T3 0 50 100 150 200 i gh cdef defg fgh ab bcd h a efg bcde fgh ab cdef abc 0 5000 10000 15000 i gh h gh defg c efgh cdef cde fgh efgh cde a cd b 超氧化物歧化酶活性 SO D acti c i ty U g 苯丙氨酸解氨酶活性 PAL a ct icit y U g A bcd cd B 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 過氧化物酶活性 PO D act ic it y U g 多酚氧化酶活性 PPO a c t i ci ty U g CD 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d e e de a cd g g g c h f h b h e de 0 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 20 40 60 80 hi h j h i f g fg g d e a c b de de 過氧化氫酶活性 CAT a ct icit y U g C 0 100 200 300 400 500 b k hi ijk fg jk ef gh l de a c b cd de hig 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 圖 2 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響 Fig 2 Effect of seaweed residue on antioxidant enzyme activity of cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 0 1 2 3 4 b a cd bc ef b de h gh 0 100 200 300 400 h fg h d gh f d c c e a gh b A fg fg fg ef gh ef fg de def ef B 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d CK T1 T2 T3 圖 3 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗根系茉莉酸 A 水楊酸 B 含量變化的影響 Fig 3 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid JA and salicylic acid SA content in cucumber seedling roots induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 倍 且比 T1 及 T3 還要高 在接種病原菌 9 d 后 T1 水楊酸為 CK 的 0 77 倍 為所有處理中最高 T3 高于 T2 T2 在 9 d 時(shí)水楊酸含量降低 這可能是因?yàn)閱为?dú)的海藻渣處理對(duì)黃瓜防御反應(yīng)的誘導(dǎo)不具有持效性 與 T2 相比 T1 具有對(duì)寄主防御反應(yīng)更為持效的誘導(dǎo)能力 說明海藻渣能強(qiáng)化微生物菌劑的誘導(dǎo)效應(yīng) 圖 3B 未接種病菌的情況下 海藻渣及混合菌劑對(duì)黃瓜葉片水楊酸積累有一定影響 但不顯著 接種病菌后 第 1 期 郝大志等 海藻渣復(fù)配微生物菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的協(xié)同增效作用 103 CK T1 T2 T3 葉片中水楊酸含量均逐漸增加 且呈 T1 T3 T2 CK 說明了海藻渣與微生物菌劑誘 導(dǎo)葉片中水楊酸積累具有協(xié)同作用 接種后葉片中的茉莉酸積累也有類似規(guī)律 圖 4A B 綜上檢測(cè)結(jié)果 無論在根系還是葉片中水楊酸含量都顯著高于茉莉酸含量 說明海藻渣及混合菌劑主 要誘導(dǎo)黃瓜的水楊酸含量增加 以激發(fā)相關(guān)防御反應(yīng)途徑 葉片及根系中水楊酸含量均為 T1 T3 T2 CK 說明了海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片及根系中水楊酸積累具有顯著增效作用 在未接種病原時(shí) 各處理間的根系及葉片中水楊酸含量差異較小 而茉莉酸差異較大 說明在未接種病原 菌時(shí) 海藻渣及微生物菌劑就已經(jīng)提高茉莉酸含量 以提高黃瓜幼苗的抗病性 而在接種病原后 水楊酸 含量快速增加 主要通過提高水楊酸的應(yīng)答速度及含量來提高黃瓜幼苗的抗病性 海藻渣對(duì)水楊酸含量增 加的誘導(dǎo)能力雖然低于微生物菌劑 但海藻渣對(duì)茉莉酸含量增加的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于微生物菌劑 海藻渣的添 加豐富了微生物菌劑的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性 圖 3 4 JA content ng g SA cont ent n g g 圖 4 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片茉莉酸 水楊酸含量變化的影響 Fig 4 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid JA and salicylic acid SA content in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 2 4 海藻渣對(duì)木霉 芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜葉片防御反應(yīng)信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的影響 2 4 1 對(duì)水楊酸 SA 途徑的影響 測(cè)定接種病菌 0 3 6 和 9 d 的黃瓜幼苗葉片水楊酸相關(guān)基因的表達(dá)情 況 發(fā)現(xiàn)海藻渣及混合菌劑處理均可以激活黃瓜幼苗防御反應(yīng) 未接種病原菌時(shí) 海藻渣及混合菌劑處理 黃瓜根部可引起黃瓜葉片內(nèi)與水楊酸相關(guān)的基因 PAD4 PR1 NPR1 的表達(dá)變化 T1 處理顯著上調(diào) 接 種病原菌后 CK 的 PAD4 PR1 表達(dá)上調(diào) NPR1 表達(dá)下調(diào) 但變化程度較小 T1 的 PAD4 PR1 NPR1 表達(dá)顯著上調(diào) T2 的 PAD4 PR1 表達(dá)上調(diào) NPR1 表達(dá)下調(diào) T3 的 PAD4 PR1 NPR1 表達(dá)顯著上調(diào) 但上調(diào)程度低于 T1 與 CK 相比 海藻渣及混合菌劑處理的葉片無論是否接種原菌 PAD4 PR1 NPR1 均被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào) 且 T1 上調(diào)程度顯著高于 T3 T3 顯著高于 T2 與黃瓜葉片水楊酸含量變化相比 SA 途徑基因表達(dá)先于含量變化 且誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸衰減 但水楊酸含量逐步增加 海藻渣本身對(duì)黃瓜幼苗防御 反應(yīng)具有一定的誘導(dǎo)能力 但不如微生物菌劑 添加海藻渣增強(qiáng)了木霉 芽胞桿菌混合菌劑對(duì)防御反應(yīng)誘 導(dǎo)能力 SA 途徑基因表達(dá)水平提高 水楊酸含量積累 表明了海藻渣與木霉 芽胞桿菌混合菌劑對(duì)黃瓜幼 苗枯萎病防效的協(xié)同作用 圖 5 2 4 2 對(duì)茉莉酸 JA 途徑的影響 關(guān)于茉莉酸途徑的誘導(dǎo) 未接種病原菌時(shí) T1 處理 LOX1 顯著上調(diào) LOX2 顯著下調(diào) T2 T3 處理 LOX1 LOX2 均顯著上調(diào) 接種病菌后 CK 的 LOX1 表達(dá)下調(diào) LOX2 表達(dá)先上調(diào) 后下調(diào) T1 的 LOX1 表達(dá)上調(diào) LOX2 先下調(diào) 在 6 d 后上調(diào) T2 的 LOX1 LOX2 均表達(dá)下調(diào) T3 的 LOX1 表達(dá)下調(diào) LOX2 先上調(diào) 6 d 后下調(diào) 與 CK 相比 海藻渣與混合菌劑處理在 LOX2 基因表達(dá)水平表現(xiàn)協(xié) 同增效 但在 LOX1 基因上未表現(xiàn) LOX1 基因表達(dá)水平更多受海藻渣的影響 LOX2 基因表達(dá)水平更多受 微生物菌劑影響 0 6 d 內(nèi)基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)與葉片 JA 含量相吻合 在未接種病原菌 海藻渣本身 對(duì)黃瓜幼苗 JA 途徑強(qiáng)于微生物菌劑 接種病原菌后 LOX1 與 LOX2 在 3 和 6 d 時(shí)表達(dá)水平表現(xiàn)出相反的 變化 但在 9 d 時(shí) T1 的 LOX1 顯著高于 T2 T3 T1 的 LOX2 顯著高于 T3 表明添加海藻渣增強(qiáng)了木霉 芽胞桿菌混合菌劑對(duì) JA 途徑的誘導(dǎo)能力 圖 6 104 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 jk gh fg hij ghij c d ghi ij a b e k f ij fg C 0 2 4 6 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d de d h a de c h b g h de g ef i ef gh i hi b ef d h a e c i d fg e A deef fg B 0 2 4 6 0 2 4 6 9 d 尖孢鐮刀菌接種后時(shí)間 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢鐮刀菌接種后