38 2 333 341 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2020 12 18 基金項(xiàng)目 河北省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目 19226510D 21326505D 河北省農(nóng)村科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程 2019 1 03 河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng) 新專項(xiàng)課題 2022KJCXZX ZBS 6 作者簡(jiǎn)介 宋健 研究員 E mail sj3250 通信作者 研究員 E mail cwplx751209 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 07 013 對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌 JQD117發(fā)酵培養(yǎng)基 及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 宋 健 張海劍 豐 碩 程佳旭 柳健虎 郭瑋冰 曹偉平 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 保定 071000 摘要 為了提高蘇云金芽胞桿菌的芽胞產(chǎn)量 應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis Bt JQD117 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上 采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 方法優(yōu)化培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件參數(shù) 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為棉籽餅粉 2 00 大豆餅粉 1 00 酵母粉 1 50 可溶性淀粉 2 00 CaCO 3 0 30 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 18 K 2 HPO 4 0 04 最佳發(fā)酵條件 接種量 3 裝液量 60 mL 溫度 30 轉(zhuǎn)速 150 r min 初始 pH 7 5 在最佳發(fā)酵條件下理論活芽胞產(chǎn)量可以達(dá) 到 6 75 10 9 個(gè) mL 試驗(yàn)驗(yàn)證后實(shí)際活芽胞產(chǎn)量為 5 97 10 9 個(gè) mL 運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì) Bt 的發(fā)酵條件進(jìn)行 優(yōu)化 獲得了提高芽胞產(chǎn)量的關(guān)鍵參數(shù) 為該菌株產(chǎn)業(yè)化 規(guī)模化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ) 為韭菜遲眼蕈蚊的綠 色防控和蔬菜的安全生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ) 關(guān) 鍵 詞 韭菜遲眼蕈蚊 蘇云金芽胞桿菌 發(fā)酵 單因素試驗(yàn) 響應(yīng)面法 中圖分類號(hào) S476 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1005 9261 2022 02 0333 09 Optimization of Fermentation Culture Medium and Flask Fermentation Conditions for Bacillus thuringiensis Strain JQD117 with High Toxicity against Bradysia odoriphaga SONG Jian ZHANG Haijian FENG Shuo CHENG Jiaxu LIU Jianhu GUO Weibing CAO Weiping Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences IPM Center of Hebei Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China Ministry of Agriculture and Rural Affairs Baoding 071000 China Abstract Aiming to increase living spore production of a Bacillus thuringiensis Bt strain JQD117 we employed response surface analysis methods to optimize the culture medium and the flask fermentation conditions Based on preliminary results from single factor experiments we used response surface analysis to model and optimize the components of culture medium and parameters of flask fermentation conditions The best ratios of each single factors for the strain Bt JQD117 were 2 00 cotton seed cake meal 1 00 soybean meal 1 50 yeast extract 2 00 soluble starch 0 30 CaCO 3 0 04 MnSO 4 0 18 MgSO 4 and 0 04 K 2 HPO 4 For fermentation conditions the optimum parameters were 3 inoculation amount 60 mL liquid volume in flask 150 r min at 30 C and pH 7 5 Theoretically the living spore can reach 6 75 10 9 spore mL under this optimized condition The verification experiment showed that the living spore yield was 5 97 10 9 spore mL Our results have placed a critical foundation and theoretical basis for large scale application of strain JQD117 for green control of Bradysia odoriphaga and the safe production of vegetables such as leeks Key words Bradysia odoriphaga Bacillus thuringiensis fermentation single factor experiment response surface analysis 334 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 韭菜遲眼蕈蚊 Bradysia odoriphaga Yang et Zhang 屬雙翅目 長(zhǎng)角亞目 眼蕈蚊科 遲眼蕈蚊屬 幼蟲(chóng) 俗稱 韭蛆 韭菜遲眼蕈蚊是我國(guó)特有的昆蟲(chóng) 目前國(guó)外尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道 1 它嚴(yán)重為害百合科 菊科 藜科 十字花科 葫蘆科 傘形花科等 7 科 30 多種蔬菜的地下嫩莖 主根 地面附近的皮下組織等 對(duì) 韭菜的為害最為嚴(yán)重 2 4 目前生產(chǎn)上對(duì)韭菜遲眼蕈蚊的防治主要以化學(xué)防治為主 5 由于韭菜是多年生宿 根植物 長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥 導(dǎo)致 毒韭菜 事件時(shí)有發(fā)生 隨著高毒農(nóng)藥的禁用 尋找環(huán)境友好 安全有效的防治措施 成為防治韭菜遲眼蕈蚊急待解決的問(wèn)題 蘇云金芽胞桿菌 Bacillus thuringiensis Bt 屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中 能夠在芽胞中 形成伴胞晶體 也稱為殺蟲(chóng)晶體蛋白 insectidal crystal proteins ICPs 或 內(nèi)毒素 6 Bt 主要是經(jīng)過(guò)蟲(chóng)口 進(jìn)行感染 通過(guò)殺蟲(chóng)蛋白晶體殺死昆蟲(chóng) 一般認(rèn)為其殺蟲(chóng)作用過(guò)程要經(jīng)過(guò)溶解 酶解活化 與受體結(jié)合 插入以及孔洞或離子通道的形成等環(huán)節(jié) 7 最后導(dǎo)致幼蟲(chóng)麻痹死亡或引起敗血癥死亡 8 據(jù)報(bào)道 Bt 還具 有抑制作用的殺菌蛋白或多肽 9 如 Bt entomocidus HD110 產(chǎn)生的 Entomocin 110 能夠有效的抑制單增李 斯特菌 Listeria monocytogenes 10 Bt 對(duì)環(huán)境友好 對(duì)人畜無(wú)害 目前已成為世界上產(chǎn)量最大的微生物農(nóng)藥 被廣泛用于防治農(nóng)業(yè) 森林 果樹(shù)等害蟲(chóng)防治中 11 13 雖然蘇云金芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不高 14 但不同的 Bt 菌株所需營(yíng)養(yǎng)條件不盡相同 不能使用某一特定配方作為所有 Bt 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基 15 17 因此 進(jìn)行 Bt 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條 件的選擇和配比優(yōu)化對(duì)提高菌株發(fā)酵產(chǎn)量極其重要 Bt 菌株 JQD117 是本試驗(yàn)室前期篩選到的一種對(duì)韭蛆具有較強(qiáng)殺蟲(chóng)活性作用的菌株 18 本研究采用單 因素和響應(yīng)面分析法 以發(fā)酵液中活芽胞含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo) 對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與優(yōu)化 以 提高該菌株產(chǎn)生量 從而提高其殺韭蛆效率 為該菌株今后的工業(yè)化生產(chǎn)及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供初 步指導(dǎo) 1 材料與方法 1 1 供試菌株 BtJQD117 菌株保存于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物殺蟲(chóng)劑課題組 1 2 Bt 發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 1 2 1 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件單因素爬坡試驗(yàn) 在初始培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基 大豆餅粉 3 50 棉籽餅粉 1 50 可溶性淀粉 1 50 酵母粉 1 00 CaCO 3 0 20 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 02 K 2 HPO 4 0 05 培養(yǎng)條件 30 接種量 1 250 mL 三角瓶裝液量 100 mL 溫度 30 轉(zhuǎn)速 200 r min 初始 pH 7 0 的基礎(chǔ)上 固定其他因子 對(duì)其中一個(gè)因子的量設(shè)梯度 進(jìn)行振蕩培養(yǎng) 采用平板菌落計(jì)數(shù) 法計(jì)算活芽胞數(shù) 每個(gè)處理重復(fù) 3 次 1 2 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析 在單因素爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上 得到 13 個(gè)因素的最佳值 以最佳值作 為中心點(diǎn) 以 Bt 芽胞產(chǎn)量作為響應(yīng)值 采用 Box Behnken Design BBD 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì) 每個(gè)因素取 1 0 1 三個(gè)水平輸入 Design Expert 響應(yīng)面分析軟件設(shè)計(jì) 13 因素 3 水平響應(yīng)面試驗(yàn) 表 1 分別按照試 驗(yàn)安排進(jìn)行振蕩培養(yǎng) 采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活芽胞數(shù) 將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 獲得回歸方程 最 終確定因素的最佳組合 1 2 3 平板菌落計(jì)數(shù)法 根據(jù)稀釋梯度計(jì)算每毫升發(fā)酵液中活菌數(shù)量 將被測(cè)樣品用無(wú)菌蒸餾水稀釋至 10 7 和 10 8 兩個(gè)稀釋梯度 將稀釋后的待測(cè)樣品定量均勻涂布到滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)平板上 每個(gè)處理重復(fù) 3 次 30 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) 并根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算樣品的活芽胞數(shù) 19 1 2 4 模型驗(yàn)證 用軟件分析得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件進(jìn)行 4 次平行驗(yàn)證試驗(yàn) 采用平板 菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活芽胞數(shù) 取得平均值 與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較以驗(yàn)證模型的可靠性 進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果 2 結(jié)果與分析 2 1 單因素爬坡試驗(yàn)結(jié)果 芽胞產(chǎn)量同培養(yǎng)基濃度和發(fā)酵條件的關(guān)系研究表明 Bt 芽胞產(chǎn)量隨著培養(yǎng)基濃度增加呈先增加后減少 第 2 期 宋健等 對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌 JQD117 發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 335 表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平 Table 1 Factors and levels of response surface experiment 水平 Levels 編號(hào) No 試驗(yàn)因子 Factor 1 0 1 A 大豆餅粉 Soybean meal 0 5 1 0 1 5 B 棉籽餅粉 Cotton seed cake meal 1 0 2 0 3 0 C 可溶性淀粉 Soluble starch 1 0 2 0 3 0 D 酵母粉 Yeast extract 0 5 1 5 2 5 E CaCO 3 0 1 0 3 0 F MnSO 4 0 02 0 04 0 06 G K 2 HPO 4 0 02 0 04 0 06 H MgSO 4 0 13 0 18 0 23 J 溫度 Temperature 28 30 32 K 轉(zhuǎn)速 Speed r min 120 150 180 L 裝樣量 Liquid volume in flask mL 30 60 90 M 初始 Initial pH 7 0 7 5 8 0 N 接種量 Inoculation amount 1 0 3 0 5 0 的趨勢(shì) 發(fā)酵培養(yǎng)基各因素的最佳值 棉籽餅粉 2 00 大豆餅粉 1 00 酵母粉 1 50 可溶性淀粉 2 00 CaCO 3 0 30 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 1 K 2 HPO 4 0 04 Bt 芽胞產(chǎn)量隨著發(fā)酵條件的變化呈先增加后 減少的趨勢(shì) 發(fā)酵條件各因素的最佳值 接種量 3 裝液量 60 mL 溫度 30 轉(zhuǎn)速 150 r min 初始 pH 7 59 圖 1 2 2 2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 以芽胞產(chǎn)量為響應(yīng)值 應(yīng)用回歸分析對(duì)方程和各因子進(jìn)行方差分析 表 2 結(jié)果表明回歸方程顯著 性檢測(cè) P 0 0001 說(shuō)明該方程模型屬于極顯著 失擬項(xiàng) P 0 05 失擬項(xiàng)不顯著 回歸方程模型與實(shí)際試 驗(yàn)擬合性較好 實(shí)驗(yàn)誤差小 模型是可行的 數(shù)據(jù)是可信的 證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株 Bt JQD117 的發(fā) 酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件是可行的 具有參考性 各因素對(duì) Bt 芽胞產(chǎn)量的影響次序?yàn)?棉籽餅粉 裝樣 量 K 2 HPO 4 轉(zhuǎn)速 大豆餅粉 溫度 pH 接種量 MnSO 4 酵母粉 CaCO 3 可溶性淀粉 MgSO 4 經(jīng)回歸擬合后 根據(jù)回歸方程 考察擬合相應(yīng)曲面的形狀 通過(guò)分析碳源 氮源 無(wú)機(jī)鹽和發(fā)酵條件等 13 個(gè)因素對(duì)產(chǎn)芽胞量的影響 發(fā)現(xiàn)棉籽餅粉與其他 12 項(xiàng)因素交互作用均顯著 其中 棉籽餅粉和裝樣量對(duì) Bt 的產(chǎn)芽胞量影響最顯著 等高線較其他因素的等高線陡峭 K 2 HPO 4 轉(zhuǎn)速和大豆餅粉次之 圖 3 通過(guò) Design Expect 8 0 軟件分析確定最優(yōu)點(diǎn) 當(dāng) Bt 芽胞產(chǎn)量最大時(shí) 可求得各因素水平 A 1 5 B 3 C 2 94 D 0 5 E 0 496 F 0 021 G 0 035 H 0 215 J 30 85 K 122 23 r min L 30 mL M 7 93 N 1 28 進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)化后得到最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為 大豆餅粉 1 5 棉 籽餅粉 3 可溶性淀粉 2 94 酵母粉 0 5 CaCO 3 0 496 MnSO 4 0 021 K 2 HPO 4 0 035 MgSO 4 0 215 最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度 30 85 轉(zhuǎn)速 122 23 r min 裝量 30 mL 250 mL 三角瓶 起始 pH 7 93 接種量 1 28 在此理論最佳發(fā)酵條件下 回歸方程預(yù)測(cè) Bt JQD117 理論芽胞產(chǎn)量可達(dá)到 6 75 10 9 芽胞 mL 2 3 模型驗(yàn)證結(jié)果 為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可靠性 在上述理論最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行 4 次重復(fù)平行驗(yàn)證試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn) Bt JQD117 菌株實(shí)際芽胞產(chǎn)量平均值為 5 97 10 9 個(gè) mL 與模型預(yù)測(cè)值 6 75 10 9 個(gè) mL 無(wú)顯著差異 這證明了方程 模型數(shù)據(jù)的可靠性 證明響應(yīng)面分析法優(yōu)化 Bt 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是有效的 相比于初始培養(yǎng)基的芽 胞產(chǎn)量 2 5 10 9 個(gè) mL 優(yōu)化后的工藝發(fā)酵水平提高 138 8 3 討論 在微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化起著至關(guān)重要的作用 其不僅對(duì)發(fā)酵水平的提高有著舉 336 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 40 80 120 160 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 A 0 100 200 300 400 500 1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 100 200 300 400 0 80 1 20 1 60 2 00 2 40 100 200 300 400 500 600 0 60 0 90 1 20 1 50 1 80 0 20 40 60 80 100 0 05 0 08 0 10 0 18 0 20 0 50 100 150 200 0 01 0 02 0 03 0 04 0 05 10 20 30 40 50 60 0 05 0 10 0 20 0 30 0 50 0 100 200 300 400 500 0 01 0 02 0 03 0 04 0 05 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber 0 00 0 B 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber C 活芽胞數(shù) L ivi ng bact erium n u mber D 活芽胞數(shù) L ivi ng bact erium n u mber E 活芽胞數(shù) Li vin g b a ct eri u m nu mb er F 活芽胞數(shù) Li vin g b a ct eri u m nu mb er G 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber H 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber 濃度 Concentration濃度 Concentration A 大豆粉 Soybean meal B 棉籽粉 Cotton seed cake meal C 可溶性淀粉 Soluble starch D 酵母粉 Yeast extract E 碳酸鈣 CaCO3 F 硫酸 錳 MnSO 4 G 磷酸氫二鉀 K 2 HPO 4 H 硫酸鎂 MgSO 4 圖 1 發(fā)酵培養(yǎng)基各成分不同濃度對(duì) Bt 產(chǎn)芽胞量的影響 Fig 1 Effect of different concentration of components in fermentation medium on the number of Bt spores 足輕重的作用 而且也是決定該微生物能否成功商業(yè)化的關(guān)鍵所在 由于微生物發(fā)酵過(guò)程是十分復(fù)雜 高 度非線性和非結(jié)構(gòu)化的 建立一個(gè)準(zhǔn)確適合的模型指導(dǎo)其發(fā)酵過(guò)程存在著許多困難 20 因而選擇合理的試 驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化十分關(guān)鍵 響應(yīng)面分析法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù) 采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因 素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系 通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù) 解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方 法 相較于傳統(tǒng)利用回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化 不僅克服了后者不能排除交互作用混雜 影響的缺點(diǎn) 而且同時(shí)對(duì)試驗(yàn)各單因子及其交互作用做評(píng)價(jià) 建立連續(xù)變量曲面模型 能快速準(zhǔn)確地確定 各發(fā)酵條件的最優(yōu)值 相較于同類研究中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)最優(yōu)發(fā)酵條件篩選更加精確 優(yōu)化后的發(fā)酵水平 提升也更加明顯 Sumant 等 21 利用響應(yīng)面分析法對(duì)一株產(chǎn)堿性蛋白酶的芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化 使其堿性蛋白 酶產(chǎn)量提高了 2 6 倍 周虓等 22 將單因子優(yōu)化與響應(yīng)面結(jié)合 優(yōu)化了產(chǎn)耐高溫蛋白酶 Bt FZ62 的發(fā)酵培養(yǎng) 基 發(fā)酵水平比初始設(shè)計(jì)提高了 3 22 倍 鄭毅等 23 將二水平 Plackett Burman 設(shè)計(jì)與響應(yīng)面相結(jié)合優(yōu)化了 產(chǎn)耐高溫蛋白酶 Bt FS140 的發(fā)酵培養(yǎng)基 FS140 最終發(fā)酵產(chǎn)酶水平達(dá) 918 91 U mL 楊梅等 24 應(yīng)用上述方 法對(duì) Bt LLB19 的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化 較初始培養(yǎng)基芽胞產(chǎn)量提高了 24 6 陳宇熹等 15 應(yīng)用此法優(yōu)化了 第 2 期 宋健等 對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌 JQD117 發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 337 0 50 100 150 200 250 0 30 0 50 1 00 3 00 5 00 接種量 Inoculation amount 活芽胞數(shù) Liv i n g bacteriu m number N 0 20 40 60 80 100 120 28 29 30 31 32 0 20 40 60 80 100 120 120 150 180 210 240 0 10 20 30 40 50 60 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 250 6 06 57 07 58 0 溫度 Temperature 轉(zhuǎn)速 Speed r min 裝樣量 Liquid volume in flask mL pH 活芽胞數(shù) Liv i n g bacteriu m number J 活芽胞數(shù) Liv i n g bacteriu m number K 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber L 活芽胞數(shù) L ivi ng bacterium n u mber M J 溫度 Temperature K 轉(zhuǎn)速 Speed L 裝樣量 Liquid volume in flask M 酸堿度 pH N 接種量 Inoculation amount 圖 2 不同發(fā)酵條件對(duì) Bt 產(chǎn)芽胞量的影響 Fig 2 Effect of different flask fermentation conditions on the number of Bt spores 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 90 84 78 72 66 60 54 48 42 36 30 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 1 8 0 1 7 4 1 6 2 1 5 6 1 5 0 1 4 4 1 3 8 1 3 2 1 2 6 1 2 0 1 6 8 10 15 20 25 30 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 5 7 9 11 13 15 10 15 20 25 30 活芽胞數(shù) Liv ing bacterium n u mber 活芽胞數(shù) Liv ing bacterium n u mber 活芽胞數(shù) L ivi ng bact eri u m nu mb er 活芽胞數(shù) L ivi ng bact eri u m nu mb er L mL B B K r min G B A B A 大豆粉 Soybean meal B 棉籽粉 Cotton seed cake meal G 磷酸氫二鉀 K 2 HPO 4 K 轉(zhuǎn)速 Speed L 裝樣量 Liquid volume in flask 圖 3 二因素交互影響 Bt 產(chǎn)芽胞量等高線圖 Fig 3 Contour chart of two factors interaction affects Bt spores 338 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析 Table 2 Analysis of variance of regression equation in response surface test 來(lái)源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 顯著性 Significance Model 2000000 104 19216 75 3 35 0 0001 A 5377 07 1 5377 07 0 94 0 3352 Ns B 902000 1 902000 156 99 0 0001 C 124 9 1 124 9 0 022 0 883 Ns D 349 82 1 349 82 0 061 0 8055 Ns E 301 44 1 301 44 0 052 0 8192 Ns F 475 22 1 475 22 0 083 0 7741 Ns G 28641 85 1 28641 85 4 99 0 0275 H 41 1 41 7 14 10 3 0 9328 Ns J 1750 41 1 1750 41 0 3 0 5819 Ns K 21024 69 1 21024 69 3 66 0 0582 Ns L 38319 76 1 38319 76 6 67 0 011 M 777 13 1 777 13 0 14 0 7136 Ns N 685 27 1 685 27 0 12 0 7304 Ns AB 12647 26 1 12647 26 2 2 0 1405 Ns AC 1200 97 1 1200 97 0 21 0 6483 Ns AD 163 2 1 163 2 0 028 0 8664 Ns AE 37 02 1 37 02 6 45 10 3 0 9361 Ns AF 10258 13 1 10258 13 1 79 0 184 Ns AG 1121 84 1 1121 84 0 2 0 6593 Ns AH 12304 49 1 12304 49 2 14 0 146 Ns AJ 660 03 1 660 03 0 11 0 7352 Ns AK 812 85 1 812 85 0 14 0 7074 Ns AL 4535 69 1 4535 69 0 79 0 376 Ns AM 11027 63 1 11027 63 1 92 0 1685 Ns AN 25 03 1 25 03 4 36 10 3 0 9475 Ns BC 6819 95 1 6819 95 1 19 0 2781 Ns BD 2243 44 1 2243 44 0 39 0 5332 Ns BE 4567 39 1 4567 39 0 8 0 3743 Ns BF 11 65 1 11 65 2 03 10 3 0 9641 Ns BG 4885 66 1 4885 66 0 85 0 3583 Ns BH 2340 99 1 2340 99 0 41 0 5244 Ns BJ 39 25 1 39 25 6 84 10 3 0 9343 Ns BK 450 53 1 450 53 0 078 0 7799 Ns BL 30698 08 1 30698 08 5 35 0 0226 BM 27612 47 1 27612 47 4 81 0 0303 BN 457 43 1 457 43 0 08 0 7783 Ns CD 2133 19 1 2133 19 0 37 0 5434 Ns CE 3261 27 1 3261 27 0 57 0 4526 Ns CF 605 78 1 605 78 0 11 0 7459 Ns 第 2 期 宋健等 對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌 JQD117 發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 339 續(xù)表 2 來(lái)源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 顯著性 Significance CG 717 26 1 717 26 0 12 0 7244 Ns CH 5820 13 1 5820 13 1 01 0 3162 Ns CJ 186 2 1 186 2 0 032 0 8574 Ns CK 9 8 1 9 8 1 71 10 3 0 9671 Ns CL 424 35 1 424 35 0 074 0 7862 Ns CM 895 91 1 895 91 0 16 0 6936 Ns CN 14075 45 1 14075 45 2 45 0 1202 Ns DE 2529 74 1 2529 74 0 44 0 5082 Ns DF 7124 63 1 7124 63 1 24 0 2677 Ns DG 1526 66 1 1526 66 0 27 0 6071 Ns DH 783 49 1 783 49 0 14 0 7125 Ns DJ 2968 54 1 2968 54 0 52 0 4736 Ns DK 2057 45 1 2057 45 0 36 0 5506 Ns DL 1136 81 1 1136 81 0 2 0 6572 Ns DM 17925 76 1 17925 76 3 12 0 0799 Ns DN 19484 37 1 19484 37 3 39 0 068 EF 978 15 1 978 15 0 17 0 6806 Ns EG 36 15 1 36 15 6 30 10 3 0 9369 Ns EH 23 3 1 23 3 4 06 10 3 0 9493 Ns EJ 2313 7 1 2313 7 0 4 0 5268 Ns EK 789 63 1 789 63 0 14 0 7115 Ns EL 37453 11 1 37453 11 6 52 0 012 EM 6582 06 1 6582 06 1 15 0 2866 Ns EN 25 03 1 25 03 4 36 10 3 0 9475 Ns FG 42758 38 1 42758 38 7 45 0 0074 FH 6633 29 1 6633 29 1 16 0 2847 Ns FJ 1491 31 1 1491 31 0 26 0 6113 Ns FK 1125 28 1 1125 28 0 2 0 6588 Ns FL 16372 36 1 16372 36 2 85 0 094 Ns FM 4715 42 1 4715 42 0 82 0 3667 Ns FN 11181 85 1 11181 85 1 95 0 1656 Ns GH 4864 92 1 4864 92 0 85 0 3593 Ns GJ 2558 84 1 2558 84 0 45 0 5058 Ns GK 110 57 1 110 57 0 019 0 8899 Ns GL 23687 94 1 23687 94 4 13 0 0446 GM 25391 87 1 25391 87 4 42 0 0377 GN 9 32 1 9 32 1 62 10 3 0 9679 Ns HJ 721 05 1 721 05 0 13 0 7237 Ns HK 5386 09 1 5386 09 0 94 0 3348 Ns HL 6565 05 1 6565 05 1 14 0 2872 Ns HM 29743 1 29743 5 18 0 0247 340 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 38 卷 續(xù)表 2 來(lái)源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 顯著性 Significance HN 49 33 1 49 33 8 59 10 3 0 9263 Ns JK 29531 18 1 29531 18 5 14 0 0252 JL 11431 35 1 11431 35 1 99 0 161 Ns JM 513 59 1 513 59 0 089 0 7654 Ns JN 2405 23 1 2405 23 0 42 0 5188 Ns KL 4394 06 1 4394 06 0 77 0 3835 Ns KM 6916 83 1 6916 83 1 2 0 2747 Ns KN 3384 04 1 3384 04 0 59 0 4443 Ns LM 32241 49 1 32241 49 5 61 0 0195 LN 409 56 1 409 56 0 071 0 7899 Ns MN 9449 69 1 9449 69 1 65 0 2021 Ns A 2 18877 9 1 18877 9 3 29 0 0724 Ns B 2 318000 1 318000 55 32 0 0001 C 2 3188 96 1 3188 96 0 56 0 4577 Ns D 2 3 75 1 3 75 6 53 10 4 0 9797 Ns E 2 578 08 1 578 08 0 1 0 7516 Ns F 2 99 54 1 99 54 0 017 0 8955 Ns G 2 719 73 1 719 73 0 13 0 724 Ns H 2 1567 47 1 1567 47 0 27 0 6024 Ns J 2 6031 91 1 6031 91 1 05 0 3076 Ns K 2 2 49 1 2 49 4 34 10 4 0 9834 Ns L 2 401 09 1 401 09 0 07 0 792 Ns M 2 2677 22 1 2677 22 0 47 0 4961 Ns N 2 689 25 1 689 25 0 12 0 7296 Ns 殘差 Residual 660000 115 5742 37 失擬項(xiàng) Lack of fit 632000 104 6077 24 2 36 0 0576 Ns 純誤差 Pure error 28339 82 11 2576 35 總和 Cor Total 2660000 219 注 差異顯著 P 0 05 差異極顯著 P 0 001 Ns 不顯著 Note and indicated significant difference at 0 05 and 0 01 level Ns indicated there was no significant difference 高效殺蚊 Bt BRC LLP29 的發(fā)酵培養(yǎng)基 張群林等 25 采用此法優(yōu)化了 Bt BRC ZQL3 的發(fā)酵培養(yǎng)基 比初始 發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢水平提高了 60 66 成飛雪等 16 采用此法優(yōu)化了 Bt YC 10 的發(fā)酵培養(yǎng)基 比優(yōu)化前提高 了 29 5 李姝江等 26 利用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽胞桿菌 ZJ20 發(fā)酵參數(shù) 菌落數(shù)達(dá) 769 10 7 CFU mL 比 優(yōu)化前提高了 17 71 倍 本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的方法 優(yōu)化出 Bt JQD117 菌株最佳 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件 大豆餅粉 1 5 棉籽餅粉 3 可溶性淀粉 2 94 酵母粉 0 5 CaCO 3 0 496 MnSO 4 0 021 K 2 HPO 4 0 035 MgSO 4 0 215 最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度 30 85 轉(zhuǎn)速 122 23 r min 裝量 30 mL 250 mL 三角瓶 起始 pH 7 93 接種量 1 28 優(yōu)化后發(fā)酵理論芽胞產(chǎn)量達(dá)到 6 75 10 9 個(gè) mL 驗(yàn)證后實(shí)際為 5 97 10 9 個(gè) mL 產(chǎn)生此情況的原因可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中 隨著細(xì)菌的 生長(zhǎng)和芽胞數(shù)量的逐漸增加 影響了發(fā)酵 pH 和氧氣濃度變化 造成最終芽胞產(chǎn)量的變化 但兩者無(wú)顯著 性差異 說(shuō)明利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行 Bt 菌株 JQD117 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是合理可靠的 優(yōu)化后發(fā)酵水平相 比于初始培養(yǎng)基的芽胞產(chǎn)量 2 5 10 9 個(gè) mL 提高了 38 8 第 2 期 宋健等 對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌 JQD117 發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 341 目前 有關(guān) Bt 培養(yǎng)優(yōu)化方面的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道 基本都以發(fā)酵液中菌體濃度或活芽胞產(chǎn)量作 為評(píng)價(jià)指標(biāo) 本文在 Bt 培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究中 也是以發(fā)酵液中活芽胞產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行衡量的 該方法簡(jiǎn)便 快捷 易操作 同時(shí) Bt 菌株在發(fā)酵過(guò)程中芽胞的產(chǎn)生與晶體蛋白含量具有一定的相關(guān)性 因此在今后菌株的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中以及對(duì)該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用 參 考 文 獻(xiàn) 1 王哲 鐘濤 劉培斌 等 韭菜遲眼蕈蚊發(fā)生規(guī)律及防治方法研究進(jìn)展 J 環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào) 2017 39 6 1397 1406 2 Zhang P Zhao Y H Wang Q H et al Lethal and sublethal effects of the chitin synthesis inhibitor chlorfluazuron on Bradysia odoriphaga Yang and Zhang Diptera Sciaridae J Pesticide Biochemistry and