湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學 2 0 2 0 年 第 5 9 卷 第 1 3 期 2 0 2 0 年 7 月 湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學 H u b e i A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s V o l 5 9 N o 1 3 J u l 2 0 2 0 楊 林 毅 陳 潞 陳 澤 歷 等 滇 重 樓 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 分 離 物 的 鑒 定 及 全 基 因 組 序 列 分 析 J 湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學 2 0 2 0 5 9 1 3 1 5 4 1 5 7 1 6 2 收 稿 日 期 2 0 1 9 1 0 2 9 基 金 項 目 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目 8 1 8 6 0 7 7 4 作 者 簡 介 楊 林 毅 1 9 9 2 男 河 南 安 陽 人 碩 士 研 究 方 向 為 植 物 病 理 學 電 話 1 3 5 0 3 8 0 4 9 0 2 電 子 信 箱 1 3 5 0 3 8 0 4 9 0 2 1 6 3 c o m 并 列 第 一 作 者 陳 潞 1 9 9 7 女 云 南 昭 通 人 在 讀 碩 士 研 究 生 研 究 方 向 為 植 物 病 理 學 電 話 1 8 3 1 3 9 2 7 9 6 2 電 子 信 箱 9 5 8 6 1 4 5 7 3 q q c o m 通 信 作 者 趙 明 富 1 9 7 5 男 云 南 宣 威 人 副 教 授 博 士 主 要 從 事 植 物 病 理 學 研 究 電 話 1 3 9 8 7 1 3 4 7 6 5 電 子 信 箱 z h a o m i n g f u 1 6 3 c o m 文 國 松 1 9 6 8 男 云 南 曲 靖 人 研 究 員 博 士 主 要 從 事 中 藥 學 研 究 電 話 1 3 9 8 7 1 9 2 0 6 7 電 子 信 箱 w e n g s 1 6 3 c o m 滇 重 樓 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 分 離 物 的 鑒 定 及 全 基 因 組 序 列 分 析 楊 林 毅 a 陳 潞 a 陳 澤 歷 b 飛 進 強 b 王 喆 a 徐 紹 忠 b 趙 明 富 a 文 國 松 b 云 南 農(nóng) 業(yè) 大 學 a 農(nóng) 業(yè) 生 物 多 樣 性 與 病 害 控 制 教 育 部 重 點 實 驗 室 b 農(nóng) 業(yè) 與 生 物 技 術(shù) 學 院 昆 明 6 5 0 2 0 1 摘 要 滇 重 樓 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 是 多 年 生 草 本 植 物 其 藥 用 部 位 為 地 下 根 莖 是 一 種 重 要 的 中 藥 材 為 明 確 侵 染 滇 重 樓 的 病 毒 病 原 對 采 自 云 南 省 曲 靖 市 的 滇 重 樓 進 行 透 射 電 鏡 觀 察 D A S E L I S A 和 R T P C R 技 術(shù) 檢 測 在 透 射 電 鏡 下 觀 察 到 桿 狀 病 毒 粒 子 大 小 為 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 對 采 集 到 的 7 份 病 樣 進 行 D A S E L I S A 檢 測 結(jié) 果 表 明 其 中 5 份 病 樣 呈 陽 性 通 過 R T P C R 技 術(shù) 擴 增 克 隆 獲 得 1 個 全 長 為 6 3 5 7 b p 的 曲 靖 分 離 物 P M M o V Q J 的 全 基 因 組 序 列 將 P M M o V Q J 的 全 基 因 組 序 列 與 國 內(nèi) 外 已 經(jīng) 報 道 的 1 0 個 P M M o V 分 離 物 進 行 同 源 性 分 析 比 對 其 同 源 性 為 9 9 4 2 9 9 8 1 基 于 全 基 因 序 列 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析 表 明 P M M o V Q J 與 韓 國 分 離 物 親 緣 關(guān) 系 密 切 本 研 究 明 確 了 該 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 從 分 子 水 平 鑒 定 該 分 離 物 為 后 續(xù) 滇 重 樓 病 毒 病 的 預 防 提 供 理 論 依 據(jù) 關(guān) 鍵 詞 滇 重 樓 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 P M M o V 鑒 定 序 列 分 析 中 圖 分 類 號 S 4 3 2 4 1 文 獻 標 識 碼 A 文 章 編 號 0 4 3 9 8 1 1 4 2 0 2 0 1 3 0 1 5 4 0 5 D O I 1 0 1 4 0 8 8 j c n k i i s s n 0 4 3 9 8 1 1 4 2 0 2 0 1 3 0 3 5 開 放 科 學 資 源 服 務 標 識 碼 O S I D I d e n t i f i c a t i o n a n d g e n o m e s e q u e n c e a n a l y s i s o f p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s i s o l a t e f r o m P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s Y A N G L i n y i a C H E N L u a C H E N Z e l i b F E I J i n q i a n g b W A N G Z h e a X U S h a o z h o n g b Z H A O M i n g f u a W E N G u o s o n g b a K e y L a b o r a t o r y o f A g r o b i o d i v e r s i t y a n d P e s t M a n a g e m e n t M i n i s t r y o f E d u c a t i o n b C o l l e g e o f A g r o n o m y a n d B i o t e c h n o l o g y Y u n n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K u n m i n g 6 5 0 2 0 1 C h i n a A b s t r a c t P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s i s a p e r e n n i a l h e r b a n d i t s m e d i c i n a l p a r t i s u n d e r g r o u n d r h i z o m e s I t i s a n i m p o r t a n t c h i n e s e m e d i c i n a l m a t e r i a l I n o r d e r t o c l a r i f y t h e v i r a l p a t h o g e n s i n f e c t i n g t h e P a r i s p o l y p h y l l a t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y D A S E L I S A a n d R T P C R t e c h n i q u e s w e r e p e r f o r m e d o n t h e P a r i s p o l y p h y l l a c o l l e c t e d f r o m Q u j i n g Y u n n a n p r o v i n c e B a c u l o v i r u s p a r t i c l e s w e r e o b s e r v e d u n d e r t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d w e r e 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m i n s i z e T h e r e s u l t s o f D A S E L I S A o n 7 s a m p l e s c o l l e c t e d s h o w e d t h a t 5 o f t h e m w e r e p o s i t i v e A w h o l e g e n o m e s e q u e n c e o f a 6 3 5 7 b p Q u j i n g i s o l a t e P M M o V Q J a c c e s s i o n n u m b e r M K 7 8 4 5 6 8 w a s c l o n e d b y R T P C R a m p l i f i c a t i o n T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e o f P M M o V Q J w e r e a n a l y z e d b y h o m o l o g y w i t h 1 0 P M M o V i s o l a t e s r e p o r t e d a t h o m e a n d a b r o a d a n d t h e h o m o l o g y w a s b e t w e e n 9 9 4 2 a n d 9 9 8 1 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s b a s e d o n t h e w h o l e g e n e s e q u e n c e s h o w e d t h a t P M M o V Q J w a s c l o s e l y r e l a t e d t o K o r e a n i s o l a t e s T h i s s t u d y c l a r i f i e s t h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f t h e i s o l a t e a n d i d e n t i f i e s t h e i s o l a t e f r o m t h e m o l e c u l a r l e v e l w h i c h p r o v i d e s a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e p r e v e n t i o n o f t h e s u b s e q u e n t v i r a l d i s e a s e K e y w o r d s P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V i d e n t i f i c a t i o n s e q u e n c e a n a l y s i s第 1 3 期 滇 重 樓 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 又 稱 獨 角 蓮 屬 延 齡 草 科 重 樓 屬 P a r i s 多 年 生 草 本 植 物 其 藥 用 部 位 為 地 下 根 狀 莖 分 布 于 亞 歐 大 陸 溫 帶 和 熱 帶 地 區(qū) 在 中 國 主 要 集 中 在 西 南 地 區(qū) 其 中 以 云 南 省 滇 中 滇 東 和 滇 東 北 滇 西 和 滇 西 北 為 主 1 滇 重 樓 宜 陰 畏 曬 喜 濕 忌 燥 通 常 生 長 在 氣 候 濕 潤 雨 量 適 當 海 拔 1 3 0 0 3 0 0 0 m 的 蔽 陰 處 作 為 一 種 珍 稀 中 草 藥 滇 重 樓 以 根 莖 入 藥 其 主 要 化 學 成 分 為 甾 體 皂 苷 并 含 多 糖 黃 酮 苷 脫 皮 激 素 及 氨 基 酸 具 有 較 強 生 物 活 性 有 抗 微 生 物 鎮(zhèn) 痛 鎮(zhèn) 靜 消 腫 止 血 清 熱 解 毒 涼 肝 定 驚 等 功 效 是 云 南 白 藥 樓 蓮 膠 囊 宮 血 寧 膠 囊 等 云 南 品 牌 中 成 藥 的 主 要 原 料 植 物 之 一 2 由 于 長 期 對 野 生 滇 重 樓 掠 奪 式 的 采 挖 加 之 滇 重 樓 自 然 繁 殖 率 低 生 長 緩 慢 且 周 期 長 野 生 滇 重 樓 出 現(xiàn) 嚴 重 緊 缺 現(xiàn) 象 現(xiàn) 在 已 成 為 云 南 省 3 0 種 稀 缺 瀕 危 天 然 藥 物 之 一 野 生 滇 重 樓 很 少 發(fā) 生 病 蟲 害 然 而 隨 著 滇 重 樓 規(guī) 模 化 人 工 種 植 的 發(fā) 展 及 栽 培 年 限 的 增 加 新 的 病 害 不 斷 出 現(xiàn) 加 之 滇 重 樓 種 植 于 灌 溉 方 便 地 勢 平 坦 且 排 水 良 好 的 酸 性 土 壤 中 土 壤 肥 沃 疏 松 有 機 質(zhì) 和 腐 殖 質(zhì) 含 量 較 高 為 種 植 滇 重 樓 提 供 了 良 好 條 件 但 同 時 也 加 劇 了 病 害 的 發(fā) 生 這 些 病 害 的 發(fā) 生 對 滇 重 樓 的 產(chǎn) 量 和 品 質(zhì) 造 成 不 同 程 度 的 影 響 輕 者 減 產(chǎn) 重 者 絕 收 使 農(nóng) 戶 遭 受 損 失 目 前 報 道 的 滇 重 樓 病 害 多 為 真 菌 性 病 害 包 括 根 腐 病 莖 腐 病 葉 斑 病 葉 枯 病 猝 倒 病 等 和 細 菌 性 病 害 細 菌 性 病 害 主 要 是 細 菌 性 穿 孔 病 3 關(guān) 于 病 毒 病 害 報 道 較 少 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V 屬 于 煙 草 花 葉 病 毒 屬 T o b a m o v i r u s 的 正 義 鏈 R N A 病 毒 基 因 組 R N A 由 6 3 5 6 或 6 3 5 7 個 堿 基 組 成 編 碼 病 毒 復 制 酶 蛋 白 P 1 2 6 和 P 1 8 3 運 動 蛋 白 M P 和 外 殼 蛋 白 1 7 k D a 等 至 少 4 種 蛋 白 是 世 界 范 圍 內(nèi) 造 成 辣 椒 經(jīng) 濟 損 失 的 重 要 病 原 之 一 4 5 P M M o V 可 以 通 過 種 子 和 汁 液 摩 擦 傳 播 帶 毒 種 子 發(fā) 病 植 株 和 病 土 是 重 要 的 侵 染 來 源 在 自 然 條 件 下 病 毒 可 感 染 所 有 辣 椒 品 種 包 括 甜 椒 品 種 和 辣 椒 還 可 以 通 過 機 械 接 種 感 染 茄 科 藜 科 和 莧 科 的 部 分 宿 主 P M M o V 最 早 報 道 于 美 國 辣 椒 6 1 9 9 4 年 在 中 國 新 疆 辣 椒 上 被 首 次 發(fā) 現(xiàn) 7 感 病 辣 椒 葉 片 呈 現(xiàn) 斑 駁 花 葉 扭 曲 或 皺 縮 癥 狀 莖 稈 上 出 現(xiàn) 褐 色 壞 死 斑 果 實 變 小 畸 形 果 面 斑 駁 或 出 現(xiàn) 凹 陷 壞 死 等 明 顯 病 毒 病 癥 狀 后 期 辣 椒 果 實 外 觀 和 內(nèi) 在 品 質(zhì) 均 顯 著 變 差 到 目 前 為 止 還 沒 有 關(guān) 于 該 病 毒 感 染 滇 重 樓 的 報 道 近 年 來 發(fā) 現(xiàn) 云 南 曲 靖 地 區(qū) 出 現(xiàn) 了 病 毒 性 病 害 本 研 究 采 用 反 轉(zhuǎn) 錄 R T P C R 和 雙 抗 體 夾 心 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法 D A S E L I S A 等 技 術(shù) 對 云 南 省 曲 靖 地 區(qū) 滇 重 樓 的 病 毒 病 進 行 克 隆 和 序 列 分 析 明 確 該 分 離 物 的 親 緣 關(guān) 系 從 分 子 水 平 鑒 定 該 分 離 物 為 后 續(xù) 滇 重 樓 病 毒 病 的 預 防 提 供 理 論 依 據(jù) 1 材 料 與 方 法 1 1 試 驗 材 料 與 主 要 試 劑 本 研 究 在 云 南 省 曲 靖 市 進 行 采 樣 調(diào) 查 采 集 病 樣 具 有 花 葉 斑 駁 和 退 綠 癥 狀 病 樣 于 8 0 保 存 供 試 P M M o V 的 D A S E L I S A 的 檢 測 試 劑 盒 購 自 C r e a t i v e D i a g n o s t i c s 公 司 植 物 總 R N A 提 取 試 劑 盒 O M E G A P l a n t R N A K i t 購 自 昆 明 碩 陽 科 技 公 司 P r i m e S c r i p t T M I s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t 合 成 試 劑 盒 購 自 T a K a R a 生 物 工 程 大 連 有 限 公 司 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 試 劑 盒 購 自 北 京 百 泰 克 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 引 物 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 1 2 電 鏡 觀 察 取 退 綠 癥 狀 明 顯 的 滇 重 樓 病 葉 進 行 病 毒 粒 子 提 純 病 毒 粒 子 提 純 參 照 Z h a o 等 8 描 述 的 方 法 提 純 的 病 毒 粒 子 用 浸 出 法 在 電 子 顯 微 鏡 下 觀 察 用 鋪 有 F o r m v e r 膜 的 電 鏡 銅 網(wǎng) 沾 取 病 毒 粗 提 純 液 用 吸 水 紙 吸 干 加 1 滴 2 磷 鎢 酸 p H 7 0 負 染 1 m i n 然 后 吸 干 待 干 燥 后 用 J E M 1 2 0 0 E X I I 透 射 電 鏡 觀 察 并 用 G A T A N C C D 相 機 拍 照 1 3 血 清 學 檢 測 取 田 間 采 集 到 的 滇 重 樓 疑 似 感 染 病 毒 病 葉 加 入 P B S 緩 沖 液 進 行 研 磨 裂 解 后 采 用 D A S E L I S A 法 進 行 檢 測 檢 測 方 法 按 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V E L I S A K i t D E I A P V 2 2 0 試 劑 盒 說 明 書 進 行 C r e a t i v e D i a g n o s t i c s 以 健 康 滇 重 樓 葉 片 為 陰 性 對 照 以 緩 沖 液 為 空 白 對 照 1 4 滇 重 樓 葉 片 總 R N A 提 取 及 反 轉(zhuǎn) 錄 取 2 份 癥 狀 較 明 顯 的 滇 重 樓 病 葉 以 1 份 健 康 的 滇 重 樓 葉 片 為 對 照 提 取 總 R N A 具 體 方 法 按 照 O M E G A P l a n t R N A k i t 試 劑 盒 說 明 書 進 行 將 提 取 得 到 的 總 R N A 于 8 0 保 存 備 用 提 取 得 到 的 總 R N A 作 為 模 板 用 于 c D N A 第 一 鏈 合 成 總 反 應 體 系 2 0 m L T o t a l R N A 4 m L 下 游 引 物 2 5 m L d N T P M i x t u r e 1 0 m m o l L e a c h 1 m L d d H 2 O 2 5 m L 混 勻 6 5 溫 度 育 5 m i n 置 于 冰 上 急 冷 加 入 5 P r m i n e S c r i p t B u f f e r 4 m L P r i m e S c r i p t T a s e 1 m L R N a s e I n h i b i t o r 4 0 U m L 0 5 m L R N a s e F r e e d H 2 O 4 5 m L 4 2 退 火 9 0 m i n 7 2 終 止 反 應 1 5 m i n 在 4 保 存 條 件 下 進 行 逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應 所 得 c D N A 產(chǎn) 物 用 于 P C R 擴 增 采 用 2 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 試 劑 盒 反 應 體 系 參 照 廠 家 說 明 書 擴 增 體 系 5 0 m L 擴 楊 林 毅 等 滇 重 樓 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 分 離 物 的 鑒 定 及 全 基 因 組 序 列 分 析 1 5 5湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學 2 0 2 0 年 增 反 應 體 系 為 2 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 2 5 m L 上 游 引 物 T o b U n i 1 5 m L 下 游 引 物 T o b U n i 2 5 m L c D N A 模 板 2 m L 反 應 條 件 為 9 4 預 變 性 1 m i n 9 4 變 性 3 0 s 5 4 退 火 3 0 s 7 2 延 伸 3 m i n 3 5 個 循 環(huán) 擴 增 7 2 終 止 延 伸 8 m i n 最 后 凝 膠 電 泳 檢 測 1 5 基 因 組 克 隆 及 分 析 根 據(jù) G e n B a n k 中 P M M o V 中 國 分 離 物 P M M o V C N 登 錄 號 A Y 8 5 9 4 9 7 的 基 因 序 列 設 計 3 對 特 異 性 引 物 9 表 1 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 將 P C R 產(chǎn) 物 分 別 進 行 電 泳 并 切 膠 回 收 后 直 接 克 隆 于 載 體 p G E M T E a s y v e c t o r P r o m e g a 總 反 應 體 系 2 R a p i d L i g a t i o n B u f f e r 5 L P G E M T E a s y V e c t o r 1 L 切 膠 回 收 產(chǎn) 物 3 L T 4 D N A L i g a s e 1 L 將 配 制 好 的 連 接 體 系 輕 輕 混 勻 在 室 溫 靜 置 1 h 或 者 4 條 件 下 靜 置 過 夜 用 于 轉(zhuǎn) 化 D H 5 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 感 受 態(tài) 細 胞 D H 5 在 含 5 0 n g L 氨 芐 青 霉 素 的 平 板 上 培 養(yǎng) 過 夜 經(jīng) 藍 白 斑 篩 選 挑 取 藍 斑 對 照 白 斑 進 行 培 養(yǎng) 提 取 質(zhì) 粒 將 篩 選 出 的 含 重 組 質(zhì) 粒 的 陽 性 克 隆 送 至 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 進 行 測 序 采 用 D N A M A N 軟 件 及 B L A S T h t t p w w w N C B I n l m n i h g o v 進 行 序 列 分 析 采 用 M E G A 7 0 軟 件 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 表 1 P M M o V 特 異 性 擴 增 引 物 引 物 名 稱 P M M o V 1 F P M M o V 1 R P M M o V 2 F P M M o V 2 R P M M o V 3 F P M M o V 3 R 序 列 5 3 G T A A A T T T T T C A C A A T T T A A C A A C A A C A A C A C A C C A A A G A T T C G G A G C T C G T A G A G T C G C A G T G A G C T C C T A G C A T A G A G G A C A G A C A T G C G A G G A A A A G C G G T G A T G T C A C T G G G C C G C A C C C G C G G T T C 起 始 位 點 1 2 4 8 2 2 4 5 0 4 4 6 5 4 3 9 5 6 3 5 6 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 滇 重 樓 病 毒 樣 品 田 間 癥 狀 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) 發(fā) 病 滇 重 樓 葉 片 呈 現(xiàn) 退 綠 花 葉 黃 化 或 皺 縮 等 明 顯 的 病 毒 病 癥 狀 圖 1 2 2 電 鏡 觀 察 病 毒 粒 子 形 態(tài) 取 呈 現(xiàn) 退 綠 癥 狀 明 顯 的 滇 重 樓 病 葉 進 行 病 毒 粒 子 提 純 提 純 的 病 毒 粒 子 在 透 射 電 鏡 下 觀 察 到 桿 狀 病 毒 粒 子 大 小 為 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 圖 2 2 3 D A S E L I S A 血 清 學 檢 測 對 采 集 到 的 7 份 病 樣 進 行 D A S E L I S A 檢 測 結(jié) 果 表 明 其 中 5 份 病 樣 呈 陽 性 表 2 圖 1 田 間 滇 重 樓 病 葉 癥 狀 圖 2 滇 重 樓 病 葉 中 提 純 得 到 的 桿 狀 病 毒 粒 子 表 2 滇 重 樓 病 葉 D A S E L I S A 檢 測 結(jié) 果 O D 值 種 類 樣 品 對 照 S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 陽 性 陰 性 空 白 O D 4 0 5 1 6 2 2 1 5 7 3 1 5 7 9 1 5 6 9 1 5 6 6 1 5 6 2 0 0 9 1 0 0 8 3 2 4 P M M o V Q J R T P C R 擴 增 結(jié) 果 采 用 P M M o V 特 異 性 引 物 分 別 為 P M M o V 1 F P M M o V 1 R P M M o V 2 F P M M o V 2 R P M M o V 3 F 和 P M M o V 3 R 以 反 轉(zhuǎn) 錄 的 c D N A 為 模 板 進 行 擴 增 得 到 3 段 單 一 的 P C R 產(chǎn) 物 2 5 P M M o V Q J 的 全 基 因 組 測 序 對 3 段 單 一 的 擴 增 產(chǎn) 物 進 行 測 序 通 過 D N A M A N 軟 件 拼 接 獲 得 P M M o V Q J 登 錄 號 M K 7 8 4 5 6 8 的 基 因 組 序 列 全 長 為 6 3 5 7 b p P M M o V Q J 的 全 基 因 組 序 列 包 含 1 8 8 0 個 堿 基 A 1 5 2 6 個 堿 基 G 1 7 7 9 個 堿 基 T 和 1 1 7 2 個 堿 基 C 這 4 種 堿 基 在 P M M o V Q J 的 全 基 因 組 序 列 中 所 占 的 百 分 比 依 次 為 2 9 5 7 2 4 0 1 2 7 9 8 和 1 5 6第 1 3 期 下 轉(zhuǎn) 第 1 6 2 頁 1 8 4 4 5 非 編 碼 區(qū) 5 U T R 和 3 非 編 碼 區(qū) 3 U T R 分 別 含 有 6 9 和 1 9 9 個 堿 基 P M M o V Q J 有 4 個 開 放 閱 讀 框 架 編 碼 4 個 蛋 白 分 別 為 1 2 6 k D a 蛋 白 7 0 3 4 2 3 n t 1 8 3 k D a 蛋 白 7 0 4 9 0 8 n t 2 8 k D a 蛋 白 4 9 0 9 5 6 8 2 n t 和 1 7 k D a 蛋 白 5 6 8 5 6 1 5 8 n t 第 一 個 開 放 閱 讀 框 編 碼 的 蛋 白 與 病 毒 復 制 相 關(guān) 同 時 第 一 個 開 放 閱 讀 框 與 第 二 個 開 放 閱 讀 框 共 同 編 碼 一 個 與 病 毒 復 制 相 關(guān) 的 蛋 白 第 三 個 開 放 閱 讀 框 編 碼 的 蛋 白 與 病 毒 移 動 有 關(guān) 第 四 個 開 放 閱 讀 框 編 碼 的 蛋 白 為 病 毒 衣 殼 蛋 白 2 6 P M M o V Q J 與 其 他 不 同 分 離 物 的 基 因 同 源 性 比 對 從 G e n B a n k 中 選 取 1 0 個 P M M o V 分 離 物 采 用 D N A M E N 軟 件 對 P M M o V Q J 的 基 因 全 序 列 與 上 述 基 因 全 序 列 進 行 同 源 性 比 對 由 表 3 可 知 P M M o V Q J 與 選 取 的 1 0 個 P M M o V 分 離 物 核 苷 酸 的 序 列 同 源 性 為 9 9 4 2 9 9 8 1 同 源 性 較 高 P M M o V Q J 與 韓 國 分 離 物 P M M o V R P 的 同 源 性 為 9 9 8 1 與 韓 國 分 離 物 P M M o V L S 的 同 源 性 為 9 9 6 7 與 日 本 分 離 物 P M M o V J 的 同 源 性 為 9 9 6 4 與 日 本 分 離 物 P M M o V C 的 同 源 性 為 9 9 6 2 與 中 國 葫 蘆 島 分 離 物 P M M o V H u l u d a o 的 同 源 性 為 9 9 5 8 與 西 班 牙 分 離 物 P M M o V S 日 本 分 離 物 P M M o V 登 錄 號 A B 1 1 3 1 1 6 日 本 分 離 物 P M M o V 登 錄 號 A B 1 1 3 1 1 7 韓 國 分 離 物 P M M o V J 4 7 中 國 湖 南 分 離 物 P M M o V H N 1 的 同 源 性 分 別 為 9 9 5 4 9 9 5 1 9 9 4 8 9 9 4 5 和 9 9 4 2 表 3 P M M o V Q J 核 苷 酸 序 列 同 源 性 比 較 G e n B a n k 登 錄 號 K R 1 0 8 2 0 6 K R 1 0 8 2 0 7 A B 0 0 0 7 0 9 A B 0 6 9 8 5 3 M G 5 1 5 7 2 5 M 8 1 4 1 3 A B 1 1 3 1 1 6 A B 1 1 3 1 1 7 K X 3 9 9 3 8 9 K P 3 4 5 8 9 9 病 毒 分 離 物 P M M o V R P P M M o V L S P M M o V J P M M o V C P M M o V H u l u d a o P M M o V S P M M o V P M M o V P M M o V J 4 7 P M M o V H N 1 來 源 韓 國 韓 國 日 本 日 本 中 國 葫 蘆 島 西 班 牙 日 本 日 本 韓 國 中 國 湖 南 核 苷 酸 序 列 同 源 性 9 9 8 1 9 9 6 7 9 9 6 4 9 9 6 2 9 9 5 8 9 9 5 4 9 9 5 1 9 9 4 8 9 9 4 5 9 9 4 2 2 7 系 統(tǒng) 進 化 樹 分 析 將 P M M o V Q J 的 基 因 全 序 列 與 上 述 1 0 個 P M M o V 分 離 物 進 行 比 對 后 通 過 M E G A 7 0 軟 件 采 用 N e i g h b o r J o i n i n g 聚 類 分 析 方 法 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進 化 樹 圖 3 結(jié) 果 表 明 將 所 有 P M M o V 分 離 物 聚 集 在 一 起 形 成 兩 大 支 系 群 體 P M M o V Q J 與 中 國 葫 蘆 島 分 離 物 P M M o V H u l u d a o 韓 國 分 離 物 P M M o V L S 和 韓 國 分 離 物 P M M o V R P 這 3 個 P M M o V 分 離 物 聚 為 1 個 支 系 與 其 他 7 個 不 同 地 區(qū) 的 P M M o V 分 離 物 分 屬 不 同 支 系 但 親 緣 關(guān) 系 相 對 較 近 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 0 0 0 7 0 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 0 6 9 8 5 3 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 1 1 3 1 1 6 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 1 1 3 1 1 7 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M 8 1 4 1 3 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K X 3 9 9 3 8 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M N 2 6 7 8 9 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M G 5 1 5 7 2 5 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K R 1 0 8 2 0 7 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s Q J P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K R 1 0 8 2 0 6 9 2 9 5 9 8 9 5 1 0 0 7 2 5 5 6 1 2 圖 3 不 同 來 源 的 P M M o V 分 離 物 的 全 基 因 組 序 列 系 統(tǒng) 進 化 樹 3 小 結(jié) 與 討 論 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 引 起 辣 椒 植 株 矮 化 葉 片 輕 微 退 綠 果 實 變 小 畸 形 斑 駁 有 時 果 實 上 出 現(xiàn) 凹 陷 壞 死 區(qū) 域 其 發(fā) 病 癥 狀 與 煙 草 花 葉 病 毒 T M V 和 辣 椒 脈 斑 駁 病 毒 C h i V M V 相 似 難 以 通 過 癥 狀 特 點 對 病 毒 進 行 鑒 定 P M M o V 侵 染 的 相 關(guān) 報 道 主 要 集 中 在 華 北 及 華 中 地 區(qū) 新 疆 貴 州 東 北 和 浙 江 等 地 也 相 繼 檢 測 出 P M M o V 1 0 1 5 并 提 出 了 一 些 分 子 檢 測 方 法 然 而 P M M o V 對 云 南 滇 重 樓 的 侵 染 還 沒 有 過 報 道 本 研 究 對 云 南 省 曲 靖 市 采 集 到 的 7 份 滇 重 樓 病 樣 進 行 透 射 電 鏡 觀 察 D A S E L I S A 和 R T P C R 技 術(shù) 檢 測 并 測 序 確 定 P M M o V 對 滇 重 樓 的 侵 染 用 浸 出 法 在 透 射 電 鏡 下 觀 察 到 桿 狀 病 毒 粒 子 大 小 為 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 通 過 D A S E L I S A 檢 測 結(jié) 果 表 明 其 中 5 份 病 樣 呈 陽 性 經(jīng) 過 R T P C R 技 術(shù) 檢 測 并 克 隆 測 序 獲 得 P M M o V 的 全 基 因 組 序 列 命 名