植物保護(hù)學(xué)報(bào)Journalof PlantProtection 2021 48 6 1496 1507 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2021 2021905 沼澤紅假單胞菌PSB 06 菌劑對(duì)番茄褪綠病的防效 及其作用機(jī)制 張煜琦 1 劉 勇 2 陳應(yīng)鳳 3 曾 軍 4 賀東方 5 方守國(guó) 1 1 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 湖北 荊州434025 2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 長(zhǎng)沙410125 3 四川綿陽(yáng)市綿蔬種業(yè)有限 公司 綿 陽(yáng)621100 4 新 疆 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 微 生 物 應(yīng) 用 研 究 所 烏 魯 木 齊830091 5 廣 東 乾 農(nóng) 農(nóng) 業(yè) 科 技 發(fā) 展 有 限 公 司 廣 州510000 摘 要 為 明 確 沼 澤 紅 假 單 胞 菌Rhodopseudomonas palustris PSB 06 菌 劑 對(duì) 番 茄 褪 綠 病 毒 tomato chlorosisvirus ToCV 的 抑 制 作 用 連 續(xù)3 年 在 田 間 進(jìn) 行 沼 澤 紅 假 單 胞 菌PSB 06 菌 劑 對(duì)ToCV 的 藥 效 試 驗(yàn) 并 在 室 內(nèi) 研 究 其 抗 病 毒 的 作 用 機(jī) 制 田 間 試 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示 PSB 06 菌 劑 處 理 能 降 低ToCV 的 發(fā) 生 植 株 發(fā) 病 率 均 低 于50 均 顯 著 低 于 清 水 和 氨 基 寡 糖 素 處 理 室 內(nèi) 試 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示 PSB 06 菌 劑 處 理 能 抑 制 病 毒 傳 播 噴 施PSB 06 菌 劑 后 的 感 病 番 茄 的SA 含 量 達(dá)532 67mg g PI II 和NPR1 基 因 表 達(dá) 量 也 相 對(duì) 上 升 同 時(shí) 健 康 番 茄 與 感 病 番 茄 的 葉 綠 素 含 量 均 明 顯 升 高 經(jīng)PSB 06 噴 施 后 番 茄 植 株 上 的 煙 粉 虱Bemisiatabaci 生 存 數(shù) 量 降 低 蛋 白 組 學(xué) 分 析 結(jié) 果 表 明 PSB 06 處 理 促 使 植 物 代 謝 及 防 御 的 相 關(guān) 蛋 白 均 上 調(diào) 表 明 沼 澤 紅 假 單 胞 菌PSB 06 菌 劑 能 增 強(qiáng) 植 物 免 疫 和 防 御 煙 粉 虱 的 能 力 從而有效地控制ToCV 的發(fā)生及傳播 關(guān)鍵詞 番茄褪綠病毒 煙粉虱 沼澤紅假單胞菌 蛋白組學(xué) ControlefficacyandmechanismoffungicideRhodopseudomonaspalustrisPSB 06 ontomatochlorosisvirus Zhang Yuqi 1 Liu Yong 2 Chen Yingfeng 3 Zeng Jun 4 He Dongfang 5 Fang Shouguo 1 1 CollegeofAgriculture YantzeUniversity Jingzhou434025 HubeiProvince China 2 HunanInstituteofPlant Protection Changsha410125 HunanProvince China 3 SichuanMianyangMianshuSeedIndustryCo Ltd Mianyang621100 SichuanProvince China 4 InstituteofMicrobiologicalApplications XinjiangAcademy ofAgriculturalSciences Urumqi830091 XinjiangUygurAutonomousRegion China 5 GuangdongQiannong AgriculturalScienceandTechnologyDevelopmentCo Ltd Guangzhou510000 GuangdongProvince China Abstract In order to clarify the inhibitory effect of Rhodopseudomonas palustris PSB 06 on tomato chlorosis virus ToCV the efficacy of fungicide PSB 06 onToCVwas evaluated in field for three con secutive years and its antivirus mechanism was studied in laboratory Field test results showed that the disease index was lower than 50 for PSB 06 treatment which was significantly lower than water and amino oligosaccharide treatments The PSB 06 treatment could inhibit the spread of virus The SAcon tent of infected tomato increased to 532 67 mg g after spraying with PSB 06 compared to less than that in control water treatment the expression levels of PI II and NPR1 genes were also increased and the chlorophyll content increased significantly in both healthy and infected tomatoes after PSB 06 treat ment The number of Bemisia tabaci the vector of ToCV on tomato plants decreased after spraying withPSB 06 ProteomicanalysisshowedthatPSB 06treatmentpromotedtheup regulationofproteinsre latedtometabolismanddefense Theresultsindicatedthat R palustrisPSB 06couldenhancetheability 基 金 項(xiàng) 目 國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 32030088 財(cái) 務(wù) 部 和 農(nóng) 業(yè) 農(nóng) 村 部 國(guó) 家 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 產(chǎn) 業(yè) 技 術(shù) 體 系 CARS 23 D 02 新 疆 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 科 技 創(chuàng) 新 重 點(diǎn) 培育專項(xiàng) xjkcpy 2020005 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail haoasliu sg fang 收稿日期 2021 09 066 期 張煜琦等 沼澤紅假單胞菌PSB 06 菌劑對(duì)番茄褪綠病的防效及其作用機(jī)制 1497 of plant immunity and defense against B tabaci thus effectively control the occurrence and transmis sionofToCV Keywords tomatochlorosisvirus ToCV Bemisiatabaci Rhodopseudomonaspalustris proteomic 番 茄 褪 綠 病 毒 tomato chlorosis virus ToCV 屬 于 長(zhǎng) 線 形 病 毒 科 毛 形 病 毒 屬Crinivirus 對(duì) 全 世 界 范 圍 內(nèi) 的 番 茄 生 產(chǎn) 及 品 質(zhì) 造 成 了 嚴(yán) 重 影 響 Duffus et al 1996 在 巴 西 突 尼 斯 等 國(guó) 家 均 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 了 ToCV Barbosa et al 2010 Gharsallah et al 2015 ToCV 首 次 發(fā) 生 在 我 國(guó) 臺(tái) 灣 省 近 年 來(lái) 在20 多 個(gè) 省 均 有 報(bào) 道 發(fā) 病 區(qū) 的 發(fā) 病 率 高 于50 番 茄 產(chǎn) 量 降 低 60 單 價(jià) 降 低50 造 成 了 嚴(yán) 重 的 經(jīng) 濟(jì) 損 失 周 濤 等 2014 魏 可 可 等 2018 迄 今 為 止 尚 無(wú) 對(duì) ToCV 有高 效抗 性或 耐受 性的 商業(yè) 番茄 品種 ToCV 主 要 是 由 煙 粉 虱Bemisia tabaci 傳 播 李 嬌 嬌 等 2018 因此目前防治措施大都是依賴化學(xué)防治降低 其介體種群數(shù)量來(lái)降低病毒擴(kuò)散 煙粉虱具有抗藥 性 強(qiáng) 為 害 性 大 入 侵 性 強(qiáng) 田 間 擴(kuò) 散 能 力 強(qiáng) 適 應(yīng) 性 強(qiáng) 等 特 點(diǎn) 對(duì) 其 防 控 也 十 分 有 難 度 國(guó) 家 進(jìn) 等 2017 近年來(lái) 生物防治因其高效無(wú)污染的特點(diǎn) 受到 了 越 來(lái) 越 多 的 關(guān) 注 找 到 高 效 防 治ToCV 的 生 物 制 劑對(duì)我國(guó)番茄生產(chǎn)以及農(nóng)業(yè)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展都有重 要 意 義 王 杰 和 王 開(kāi) 運(yùn) 2011 發(fā) 現(xiàn) 香 菇 多 糖 水 劑 可 以 用 于 防 治 水 稻 條 紋 葉 枯 病 煙 草 病 毒 病 及 番 茄 病 毒 病 姚 鑫 2016 發(fā) 現(xiàn) 殼 寡 糖 水 劑 可 用 于 辣 椒 疫 病 的 防 治 光 合 細(xì) 菌 photosynthetic bacteria PSB 是 一 種 新 型 的 生 物 農(nóng) 藥 能 夠 促 進(jìn) 植 物 生 長(zhǎng) 并 防 控 植 物病毒病 吳永強(qiáng)和宋鴻遇 1991 一些研究表明 PSB 的 生 長(zhǎng) 與 水 稻 產(chǎn) 量 之 間 存 在 正 相 關(guān) 施 用PSB 可 使 谷 物 產(chǎn) 量 提 高21 29 Kobayashi Haque 1971 Harada et al 2005 Zhang et al 2020 發(fā) 現(xiàn) 沼 澤 紅 假 單 胞 菌Photosynthetic bacteria GJ 22 與 殺 菌劑克露聯(lián)合使用能對(duì)馬鈴薯晚疫病具有高效防治 作 用 此 外 Zhaietal 2021 報(bào) 道GJ 22 對(duì) 煙 草 花 葉 病 毒 同 樣 有 防 治 效 果 并 且 指 出GJ 22 分 泌 的 胞 外 多糖是其生 物防治能力 的 主 要 有 效 成 分 但 目 前 有 關(guān) 沼 澤 紅 假 單 胞 菌 對(duì) 番 茄 褪 綠 病 毒 病 的 防 效 還 未 報(bào) 道 為 了 明 確 沼 澤 紅 假 單 胞 菌PSB 06 菌 劑 對(duì)ToCV 的 抑 制 作 用 本 研 究 采 用 田 間 和 室 內(nèi) 試 驗(yàn) 相 結(jié) 合 的 方 式 連 續(xù)3 年 在 田 間 進(jìn) 行 沼 澤 紅 假 單 胞 菌PSB 06 菌 劑 對(duì)ToCV 的 藥 效 試 驗(yàn) 并 在 室 內(nèi) 從 病 毒 傳 播 植 物 防 御 激 素 葉 綠 素 煙 粉 虱 行 為 和 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 等 方 面 研 究 其 抗 病 毒 的 作 用 機(jī) 制 以 期 為 今后番茄褪綠病毒病的防控提供新的技術(shù)和 方向 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 作 物 昆 蟲(chóng) 供 試 番 茄 品 種 為 鉆 紅 美 娜 由 湖 南 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 研 究 所 提 供 室 內(nèi) 供 試 番 茄 種 植 在 直 徑15 cm 花 盆 中 置 于 長(zhǎng) 寬 高 為60 cm 40cm 80cm 的 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 內(nèi) 外 面 用 尼 龍 網(wǎng) 包 裹 透 光 性能良好 飼養(yǎng)期間不接觸任何農(nóng)藥及昆蟲(chóng) 煙草品 種 為 三 生 煙 由 湖 南 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 植 物 保 護(hù) 研 究 所 提 供 煙 粉 虱 品 種 均 為Q 型 煙 粉 虱 由 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 張 友 軍 研 究 員 課 題 組 饋 贈(zèng) 飼 養(yǎng) 在 番 茄 上 每 隔1 個(gè) 月 進(jìn) 行 煙 粉 虱 生 物 型 鑒 定 羅 晨 等 2002 確 保 試 驗(yàn) 所 用 的 煙 粉 虱 均 為Q 型 煙 粉 虱 供 試 菌 劑 藥 劑 沼 澤 紅 假 單 胞 菌PSB 06 菌 劑 湖 南 艾 格 里 生 物 有 限 公 司 稀 釋500 倍 后 備 用 5 氨 基 寡 糖 素 amino oligosaccharin 海 南 正 業(yè) 有 限 公司 稀釋500 倍備用 試 劑 及 儀 器 Phanta Max Super Fidelity DNA Polymerase AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試 劑 盒 南 京 諾 唯 贊 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 植 物 RNA 提 取 試 劑 盒 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ThermoScientificPierceBCA 試 劑 盒 賽 默 飛 世 爾 科 技 中國(guó) 有限公司 茉莉酸和水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京華 爾 博 科 技 有 限 責(zé) 任 公 司 其 他 試 劑 均 為 國(guó) 產(chǎn) 分 析 純 Mastercycler nexus X2 PCR 擴(kuò) 增 儀 德 國(guó) 艾 本 德 股 份 公 司 compEAct 電 泳 儀 德 國(guó) 耶 拿 分 析 儀 器 股 份 公 司 LCMS 8060NX 超 高 效 液 相 色 譜 儀 島 津 企 業(yè) 管 理 中 國(guó) 有 限 公 司 Agilent 5977B 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 儀 安 捷 倫 科 技 中 國(guó) 有 限 公 司 CFX384Touch 熒 光 定 量PCR 儀 美 國(guó) 伯 樂(lè) 公 司 OK Y10 植 物 營(yíng) 養(yǎng) 測(cè) 定 儀 鄭州歐柯奇儀器制造有限公司 1 2 方法 1 2 1 ToCV 的防控及調(diào)查方法 田間番茄育苗于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 試 驗(yàn) 基 地 大 棚 內(nèi) 育 苗 時(shí) 間 在2018 年 2019 年 和 2020 年 的3 月 上 旬 待 番 茄 苗 長(zhǎng) 至3 4 片 真 葉 將 健 康Q 型 煙 粉 虱 接 種 至 感 染ToCV 煙 草 上 獲 毒48 h 后 轉(zhuǎn)移到健康番茄植株上48h 進(jìn)行傳毒 然后移走 全 部 煙 粉 虱 每 天 觀 察 及 時(shí) 去 除 蟲(chóng) 卵 和 若 蟲(chóng) 接 毒 15 d 后 移 栽 到 大 田 每 壟 寬1 m 長(zhǎng)30 m 每 壟 約1498 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 180 株 番 茄 2 株 番 茄 植 株 種 植 間 隔 約30cm 45 d 后 隨 機(jī) 取 樣 調(diào) 查 田 間 移 栽 番 茄 的 發(fā) 病 情 況 每 年 共 采 集60 片 葉 片 根 據(jù) 病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 計(jì) 算 病 情 指 數(shù) 統(tǒng) 計(jì)ToCV 發(fā) 病 率 并 從 田 間 試 驗(yàn) 植 株 上 隨 機(jī) 取 葉 片 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 檢 測(cè)ToCV 以 明 確 田 間 的 實(shí) 際 發(fā) 病 情 況 病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 為0 9 級(jí) 劉 勇 2018 0 級(jí) 無(wú) 癥 狀 1 級(jí) 輕 度 矮 化 葉 片 面 積 低 于 正 常 葉 面 積 的80 部 分 老 葉 褪 綠 大 部 分 葉 片 不 表 現(xiàn) 癥 狀 3 級(jí) 中 部 葉 片 花 葉 老 葉 褪 綠 數(shù) 量 達(dá) 到 葉 片 總 數(shù)30 株 高 低 于 健 株80 葉 片 面 積 低 于 正 常 葉 面 積70 5 級(jí) 中 部 葉 片 花 葉 僅 余 葉 脈 為 綠 色 株 高 低 于 健 株70 葉 片 面 積 低 于 正 常 葉 面 積50 7 級(jí) 僅 余 葉 脈 為 綠 色 葉 片 面 積 低 于 正 常 葉 面 積40 葉 片 脆 植 株 明 顯 矮 化 株 高 低 于 健 株60 9 級(jí) 僅 余 葉 脈 為 綠 色 葉 片 脆 植 株 嚴(yán) 重 矮 化 葉 片 面 積 低 于 正 常 葉 面 積30 株 高 低 于 健 株1 3 經(jīng) 過(guò) 檢 測(cè) 發(fā) 現(xiàn)2018 年 2019 年 及2020 年 發(fā) 病 率 均 高 達(dá)95 因 此進(jìn)行了防控藥效試驗(yàn) 在 上 述 大 田 中 進(jìn) 行 防 控 藥 效 試 驗(yàn) 設(shè)置3 個(gè)處 理 清 水 噴 施 PSB 06 菌 劑 噴 施 氨 基 寡 糖 素 噴 施 將 藥 劑 于 接 毒 后1 3d 初 花 期 每 株1 2 個(gè) 花 蕾 盛 花 期 每 株 有4 5 朵 盛 開(kāi) 的 花 分 別 噴 施1 次 共 計(jì) 噴 施 3 次 第1 次 平 均 每 株 噴 施 藥 液15 20 mL 第2 次 平 均 每 株 噴 施 藥 液80 100 mL 第3 次 平 均 每 株 噴 施 藥 液150 200 mL 每 壟 為1 個(gè) 小 區(qū) 重 復(fù)4 次 各 小 區(qū) 隨 機(jī) 分 布 每 個(gè) 小 區(qū) 隨 機(jī) 調(diào) 查6 個(gè) 點(diǎn) 每 點(diǎn) 查 10 株 每 個(gè) 小 區(qū) 共 調(diào) 查60 株 以 株 為 單 位 記 錄 調(diào) 查 總 株 數(shù) 各 級(jí) 病 株 數(shù) 或 明 顯 枯 萎 死 亡 的 植 株 發(fā) 病 率 發(fā) 病 株 數(shù) 調(diào) 查 株 數(shù) 100 病 情 指 數(shù) 發(fā) 病 株 數(shù) 該 病 等 級(jí) 值 調(diào) 查 總 株 數(shù) 最 高 等 級(jí) 值 100 相 對(duì) 防 效 對(duì) 照 病 情 指 數(shù) 處 理 病 情 指 數(shù) 對(duì) 照病情指數(shù) 100 1 2 2 ToCV 的檢測(cè) 參 照 植 物RNA 提 取 試 劑 盒 操 作 說(shuō) 明 提 取 試 驗(yàn) 田 間 采 集 的 番 茄 葉 片 的 總RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成 第 一 鏈 cDNA 使 用 的ToCV HSP70 基 因 特 異 性 引 物ToCV 3R 5 AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC 3 和 ToCV 3F 5 GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCA GT 3 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng) 所 有 引 物 均 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 50 mL 反 應(yīng) 體 系 cDNA 2 mL 上 下 游 引 物 各2 mL dNTPs Mix 1 mL Phanta Max Super Fidelity DNAPolymerase 1 mL 2 Phanta Max Buffera 25 mL ddH 2 O 17 mL PCR 反 應(yīng) 程 序 95 預(yù) 變 性5 min 95 變 性30 s 60 退 火45 s 72 延 伸1 min 循 環(huán)30 個(gè) 72 延 伸10 min PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2 0 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照 1 2 3 PSB 06 處 理 對(duì) 嫁 接 番 茄 中ToCV 表 達(dá) 量 的 影 響 采 用 貼 接 法 進(jìn) 行 嫁 接 傳 毒 從 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 取 含 韌 皮 部 組 織 的 莖 段 分 別 嫁 接 至30 株 健 康 番 茄 幼 苗 上 將 健 康 番 茄 的 莖 段 嫁 接 至 健 康 番 茄幼苗上作對(duì)照 經(jīng)檢測(cè)嫁接成功后分別對(duì)嫁接番 茄 的 葉 片 噴 施PSB 06 菌 劑 和 清 水 對(duì) 照 每 株 番 茄 均 勻 噴 施 至 葉 片 均 勻 鋪 滿1 2mL 菌 劑 或 清 水 且 無(wú) 水 滴 滴 下 共 噴 施3 次 每 隔7d 噴 施1 次 分 別 在 噴 施22 23 25 28 d 時(shí) 取0 2 0 3 g 嫁 接 后 番 茄 頂 端 的 葉 片 按1 2 2 中 方 法 提 取RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成cD NA 以Actin 和UBI 作 為 內(nèi) 參 基 因 引 物 為Actin F 5 GGAAAAGCTTGCCTATGTGG 3 Actin R 5 CCTGCAGCTTCCATACCAAT 3 和 UBI F 5 TC GTAAGG AGTGCCCTAATGCTGA 3 UBI R 5 CAATCGCCTCCAGCCTTGTTGTAA 3 以 cD NA 為 模 板 引 物ToCV 2F 5 ATGGAGAACAGT GCCGTTGC 3 ToCV 2R 5 TTAGCAACCAGTT ATCGATGC 3 進(jìn) 行 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR quantita tive real time PCR RT qPCR 測(cè) 定 25 L 體 系 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 12 5 L 正 反 向 引 物 各0 75 L cDNA1 0 L 加ddH 2 O 補(bǔ) 充 至 25 L RT qPCR 擴(kuò) 增 程 序 95 預(yù) 變 性5min 95 變 性10s 60 退 火40s 40 個(gè) 循 環(huán) 然 后PCR 產(chǎn) 物 加 熱 至95 維 持15 s 冷 卻 至60 維 持1 min 再 加 熱 至95 維 持30s 最 后 降 溫 至60 維 持15s 以 此 測(cè) 定 熔 解 曲 線 以 不 加 模 板cDNA 的 擴(kuò) 增 反 應(yīng) 作 陰 性 對(duì) 照 每 個(gè) 樣 品 至 少3 次 技 術(shù) 重 復(fù) 3 次 生 物 重 復(fù) 反 應(yīng) 結(jié) 束 后 采 集 目 的 基 因 和 內(nèi) 參 基 因 的Ct 值 使 用 2 Ct 法 計(jì) 算 目 的 基 因 的 相 對(duì) 表 達(dá) 水 平 每 個(gè) 處 理 檢測(cè)9 株番茄 1 2 4 對(duì)植物激素含量及基因表達(dá)量的影響 取 健 康 和 感 染ToCV20d 的 番 茄 植 株 各9 株 分 別 噴 施 約1 2 mLPSB 06 菌 劑 和 清 水 對(duì) 照 以 噴 施 的 時(shí) 間 記 為0 d 分 別 取 噴 施1 6 d 后 的 健 康 和 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 部 分 葉 片 為 樣 品 進(jìn) 行RT qP CR 反 應(yīng) 檢 測(cè) 茉 莉 酸 jasmonic acid JA 水 楊 酸 salicylic acid SA 下 游 基 因 PI II F 5 CCTATTCAAGATGTCCCCGTTC 3 R 5 GGGCA ATCCAGAAGATGG 3 和 NPR1 F 5 ATATAG AATTCCTGCTCCAAAGGATCGGTTA 3 R 5 AT ATACTCGAGCAGACAAGTCATCAGCATCCA 3 6 期 張煜琦等 沼澤紅假單胞菌PSB 06 菌劑對(duì)番茄褪綠病的防效及其作用機(jī)制 1499 的 基 因 表 達(dá) 量 變 化 反 應(yīng) 程 序 和 體 系 同1 2 3 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)3 次 根據(jù)基因表達(dá)量變化趨勢(shì) 選取噴施2d 后的葉 片 提 取 植 物 激 素 并 用 超 高 效 液 相 色 譜 和 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 進(jìn) 行 分 析 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)3 次 基 于 植 物 激 素JA 和 SA 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu) 建MWDB Metwaredatabase 植物激素 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 對(duì) 質(zhì) 譜 檢 測(cè) 的 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 定 性 分 析 利 用 三 重 四 級(jí) 桿 質(zhì) 譜 的 多 反 應(yīng) 監(jiān) 測(cè) 模 式 multiple reaction monitoring MRM 分 析 獲 得 不 同 樣 本 的 激 素 質(zhì) 譜 分 析 數(shù) 據(jù) 后 對(duì) 所 有 目 標(biāo) 物 的 色 譜 峰 進(jìn) 行 積 分 通 過(guò) 內(nèi) 標(biāo) 法 進(jìn) 行 定 量 分 析 1 2 5 PSB 06 菌劑對(duì)番茄葉綠素含量的影響 分 別 取 健 康 和 感 染ToCV 20 d 的 番 茄 植 株 各 9 株 分 別 噴 施1 2 mLPSB 06 菌 劑 和 清 水 對(duì) 照 以 噴 施 的 時(shí) 間 記 為0 d 分 別 取 噴 施1 6 d 后 的 健 康 和 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 部 分 葉 片 為 樣 品 使 用 葉綠素測(cè)定儀檢測(cè)番茄植株體內(nèi)葉綠素的變化 先 進(jìn) 行 校 準(zhǔn) 壓 頭 不 夾 樣 品 2 個(gè)LED 燈 依 次 發(fā) 光 被 接 收 的 光 轉(zhuǎn) 換 成 電 信 號(hào) 計(jì) 算 光 強(qiáng) 度 的 比 率 然 后 進(jìn) 行 測(cè) 量 壓 頭 夾 住 樣 品 葉 片 后 2 個(gè)LED 燈 再 次 發(fā) 光 通過(guò)葉片傳輸?shù)墓獯虻浇邮掌魃?被轉(zhuǎn)換成電信 號(hào) 計(jì) 算 傳 輸 光 的 強(qiáng) 度 比 率 計(jì) 算SPAD 測(cè) 量 值 表 示夾住的樣品葉片當(dāng)前葉綠素相對(duì)含量 1 2 6 PSB 06 處理對(duì)煙粉虱選擇性的影響 分 別 對(duì)1 株 感 染ToCV20d 的 番 茄 植 株 噴 施1 2 mL 的PSB 06 菌 劑 和 清 水 對(duì) 照 放 入 長(zhǎng)60cm 寬 40cm 高80 cm 的 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 中 兩 者 間 隔20 cm 每 個(gè) 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 為1 個(gè) 重 復(fù) 重 復(fù)9 次 將 裝 有 約100 頭Q 型 煙 粉 虱 的 離 心 管 放 入 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 的 中 間 部 位 離 心 管 距 2 株 帶 毒 番 茄 植 株 的 距 離 相 等 約10cm 打 開(kāi) 離 心 管 的 蓋 子 讓 煙 粉 虱 自 由 爬 出 離 心 管 選 擇 分 別 于 24 48 和72 h 后 調(diào) 查 每 株 植 株 上 煙 粉 虱 的 數(shù) 量 調(diào) 查時(shí)在溫室微弱的光線下進(jìn)行 防止煙粉虱的逃逸 1 2 7 PSB 06 處 理 對(duì) 煙 粉 虱 產(chǎn) 卵 率 及 生 存 情 況 的 影 響 PSB 06 菌 劑 和 清 水 對(duì) 照 分 別 噴 施3 株 感 染 ToCV20 d 的 番 茄 植 株 每 株 噴 施1 2 mL 噴 施3 d 后 放 入 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 中 每 株 番 茄 選 取5 片 葉 片 在 葉 片 上 放 置 直 徑5cm 微 蟲(chóng) 籠 在 每 個(gè) 微 蟲(chóng) 籠 中 裝20 頭 經(jīng)2h 饑 餓 處 理 的 煙 粉 虱 每 株 番 茄 植 物 為1 個(gè) 重 復(fù) 重 復(fù)3 次 記 錄 噴 施 后 第3 4 5 6 天 煙 粉 虱 的 數(shù) 量 記 錄 生 存 情況 PSB 06 菌劑 和清 水 對(duì)照 分別 噴施3 株感 染 ToCV 的 番 茄 植 株 每 株 噴 施1 2 mL 3 d 后 放 入 養(yǎng) 蟲(chóng) 籠 中 在 葉 片 微 蟲(chóng) 籠 中 放 入20 頭 羽 化 第3 天 的 煙 粉 虱 記 錄 噴 施 后 第3 6 天葉片上的產(chǎn)卵量 1 2 8 PSB 06 菌 劑 處 理 后 番 茄 植 株 的 蛋 白 組 學(xué) 分 析 對(duì) 不 同 處 理 后 的 番 茄 植 株 進(jìn) 行 蛋 白 組 學(xué) 分 析 共 設(shè)4 個(gè) 處 理 健 康 番 茄 噴 施 清 水 健 康 番 茄 噴 施 PSB 06 菌 劑 感 染ToCV 番 茄 噴 施 清 水 和 感 染ToCV 番茄噴施PSB 06 菌劑 每個(gè)處理重復(fù)3 次 噴 施3 d 后 提 取 各 處 理 番 茄 樣 品 的 總 蛋 白 使 用Thermo Scientific Pierce BCA 試 劑 盒 進(jìn) 行 蛋 白 定 量 使 用BCA 試 劑 盒 配 制BCA 工 作 液 和 不 同 質(zhì) 量 濃 度 的 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 質(zhì) 溶 液 各 樣 品 均 取 2 L 和 ddH 2 O 18 L 混 合 加 入200 LBCA 工 作 液 振 蕩 混 勻 37 反 應(yīng)30 min 在562 nm 處 讀 取 吸 光 度 取 蛋 白 樣 品100 g 用 蛋 白 裂 解 液 補(bǔ) 充 到90 L 將 樣 品 送 至 上 海 美 吉 生 物 醫(yī) 藥 科 技 有 限 公 司 采 用 同 位 素 標(biāo) 記 相 對(duì) 和 絕 對(duì) 定 量 isobaric tags for relative andabsolutequantitation iTRAQ 技 術(shù) 進(jìn) 行 分 析 將 差 異 閾 值 設(shè) 為 1 2 倍 或 0 83 倍 篩 選 差 異 蛋 白 選 擇GO http ge neontology org 對(duì) 差 異 蛋 白 進(jìn) 行 功 能 聚 類 分 析 采 用KEGG http www genome jp kegg 通 路 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 對(duì)差異蛋白涉及的代謝通路進(jìn)行分析 1 3 數(shù)據(jù)分析 試 驗(yàn) 使 用SPSS20 0 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 分 析 使 用 單 因 素 方 差 分 析 使 用 獨(dú) 立 樣 本t 檢 驗(yàn) 法 和LSD 法 進(jìn) 行 差 異顯著性檢驗(yàn) 2 結(jié)果與分析 2 1 PSB 06 菌劑對(duì)ToCV 的防效 2018 2020 的 數(shù) 據(jù) 表 明PSB 06 菌 劑 對(duì)ToCV 的 相 對(duì) 防 效 較 好 分 別 為 82 46 74 47 和 76 46 高 于 氨 基 寡 糖 素 的 相 對(duì) 防 效 分 別 為 42 44 48 23 和45 75 圖1 A 2018 2020 清 水 處 理 的 發(fā) 病 率 最 高 分 別 為 99 47 99 58 和99 65 氨 基 寡 糖 素 處 理 的 發(fā) 病 率 分 別 為70 63 68 01 和61 45 PSB 06 菌 劑 處 理 的 發(fā) 病 率 最 低 分 別 為 47 41 42 33 和 47 03 PSB 06 處 理 的 發(fā) 病 率 顯 著 低 于 其 他2 個(gè) 處理 圖1 B 2018 2020 的 病 情 指 數(shù) 結(jié) 果 表 明 清 水 處 理 的 平 均 病 情 指 數(shù) 最 高 分 別 為59 05 56 94 和50 67 5 氨 基 寡 糖 素 處 理 的 平 均 病 情 指 數(shù) 分 別 為33 99 29 47 和27 49 PSB 06 菌 劑 處 理 的 平 均 病 情 指 數(shù) 最 低 分別為10 41 14 54 和11 93 圖1 C 2 2 PSB 06 處理對(duì)嫁接番茄中的病毒傳播的影響 結(jié) 果 表 明 經(jīng)PSB 06 菌 劑 噴 施3 次 后 在 第22 1500 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 23 25 和28 天 嫁 接 帶 毒 番 茄 植 株 中 的 病 毒 相 對(duì) 含 量始終顯著低于清水處理的嫁接帶毒番茄植株中的 病毒相對(duì)含量 且在處理23d 達(dá)到最高帶毒量 隨后 病毒量逐漸降低 圖1 2018 2020 年不同處理的ToCV 發(fā)病情況指標(biāo) Fig 1Incidencereferenceindexofdifferenttreatmentsin2018 2020 圖 中 數(shù) 據(jù) 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 差 同 年 不 同 小 寫 字 母 表 示 經(jīng)t 檢 驗(yàn) 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 水 平 差 異 顯 著 Datearemean SD Differ entlowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyttest 2 3 PSB 06 菌劑處理對(duì)番茄和煙粉虱的影響 2 3 1 PSB 06 菌 劑 處 理 后 對(duì) 番 茄JA 和SA 含 量 的 影 響 在 健 康 植 物 中 番 茄 葉 片 中 的JA 含 量 約 為 71 87 mg g 噴 施PSB 06 菌 劑 后 番 茄 葉 片 中 的JA 含 量 較 對(duì) 照 升 高 為104 33mg g 在 感 染ToCV 的 番 茄 葉 片 中 番 茄 葉 片 中 的JA 含 量 約 為92 27 mg g 噴 施PSB 06 菌 劑 后 JA 含 量 為95 10mg g 圖2 A 無(wú) 論 是 健 康 還 是 感 病 番 茄 噴 施PSB 06 菌 劑 后 番 茄 葉 片 中 的JA 含 量 均 較 對(duì) 照 升 高 圖2 B 噴 施 PSB 06 菌 劑 后 的 感 病 番 茄SA 的 含 量 達(dá)532 67mg g Water H 健 康 番 茄 噴 施 清 水 Water V 感 染ToCV 番 茄 噴 施 清 水 PSB H 健 康 番 茄 噴 施PSB 06 菌 劑 PSB V 感 染 ToCV 番 茄 噴 施PSB 06 菌 劑 Water H Healthytomatosprayedbywater Water V ToCV infectedsprayedbywater PSB H healthytomatosprayedbyPSB 06 PSB V ToCV infectedsprayedbyPSB 06 圖2 不同處理的植物激素JA A 和SA B 含量 Fig 2 ContentsofplanthormonesJA A andSA B intomatoleavesafterdifferenttreatments 圖 中 數(shù) 據(jù) 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 差 不 同 小 寫 字 母 表 示 經(jīng)LSD 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 水 平 差 異 顯 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 2 3 2 PSB 06 菌劑對(duì)基因表達(dá)量的影響 結(jié) 果 表 明 在 感 病 番 茄 中 NPR1 的 表 達(dá) 量 高 于 對(duì) 照 在1 6d 內(nèi) 逐 漸 升 高 在 第2 天 表 達(dá) 量 最 低 圖 3 A PI II 的 表 達(dá) 量 要 低 于 對(duì) 照 在1 6d 內(nèi)PI II 表 達(dá) 量 逐 漸 降 低 在 第2 天PI II 表 達(dá) 量 最 高 圖3 B 在 健 康 番 茄 中 NPR1 表 達(dá) 量 高 于 對(duì) 照 在1 6 d 內(nèi) NPR1 表 達(dá) 量 逐 漸 升 高 圖3 C PI II 表 達(dá) 量 低 于 對(duì) 照 在1 6d 內(nèi) PIII 表達(dá)量逐漸升高 圖3 D 2 3 3 PSB 06 菌劑對(duì)番茄葉綠素含量的影響 在 健 康 番 茄 中 使 用PSB 06 菌 劑 后 番 茄 葉 片 中 的 葉 綠 素 含 量 相 比 對(duì) 照 均 有 顯 著 提 升 圖4 A 在 感 染ToCV 番 茄 中 使 用PSB 06 菌 劑 后 番 茄 葉 片中的葉綠素含量相比對(duì)照同樣有明顯提升 不同 于 健 康 番 茄 在 感 染ToCV 番 茄 中 葉 片 中 葉 綠 素 含 量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì) 圖4 B 6 期 張煜琦等 沼澤紅假單胞菌PSB 06 菌劑對(duì)番茄褪綠病的防效及其作用機(jī)制 1501 圖3 感病番茄 A B 和健康番茄 C D 不同處理下植物激素相關(guān)基因表達(dá)量 Fig 3 TherelativegeneexpressionofplanthormonesinToCV infectedplants A B andhealthyplants C D afterdifferenttreatments 圖 中 數(shù) 據(jù) 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 差 不 同 小 寫 字 母 表 示 經(jīng)LSD 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 水 平 差 異 顯 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 圖4 PSB 06 對(duì)健康番茄 A 感病番茄 B 葉綠素含量的影響 Fig 4 EffectsofPSB 06treatmentonchlorophyllofhealthyplants A andToCV infectedplants B 圖 中 數(shù) 據(jù) 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 差 不 同 小 寫 字 母 表 示 經(jīng)LSD 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 水 平 差 異 顯 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 2 3 4 PSB 06 處理對(duì)煙粉虱選擇性的影響 在24 72h Q 型 煙 粉 虱 均 偏 好 取 食 清 水 處 理 的 番 茄 植 株 PSB 06 菌 劑 處 理 對(duì) 煙 粉 虱 有 顯 著 的 驅(qū) 避 作用 圖5 2 3 5 PSB 06 處理對(duì)煙粉虱產(chǎn)卵及生存的影響 PSB 06 處 理 后 的 番 茄 植 株 上 煙 粉 虱 的 產(chǎn) 卵 數(shù) 量 受 到 一 定 影 響 在 第3 天 最 為 明 顯 第5 天 往 后 與 對(duì) 照 之 間 無(wú) 顯 著 差 異