植物保護(hù)學(xué)報(bào)JournalofPlantProtection 2021 48 6 1380 1386 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2021 2021894 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金 31371941 31572012 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail jiaoxg zhangyoujun 收稿日期 2021 09 22 MEAM1 和MED 兩個(gè)煙粉虱隱種取食對甘藍(lán) 轉(zhuǎn)錄組影響的差異 胡 杰 1 盧靖天 1 付培藝 1 彭 宇 1 焦曉國 1 張友軍 2 1 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢430062 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 北京100081 摘 要 為 綠 色 防 控 煙 粉 虱Bemisia tabaci 提 供 新 策 略 采 用 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析MEAM1 和MED 兩 個(gè) 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 差 異 基 因 表 達(dá) 情 況 并 選 取 差 異 表 達(dá) 基 因 最 多 的 甘 藍(lán) 苯 丙 烷 類 通 路 上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四 個(gè) 基 因 進(jìn) 行 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 測 定 結(jié) 果 顯 示 與 對 照 相 比 MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 差 異 表 達(dá) 基 因 數(shù) 分 別 為693 個(gè) 和1 030 個(gè) GO 功 能 注 釋 和KEGG 富 集 分 析 顯 示 差異表達(dá)基因主要集中在苯丙烷類生物合成 萜類揮發(fā)物合成 芥子油苷合成 類黃酮生物合成 和 植 物 激 素 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 等 與 甘 藍(lán) 抗 蟲 物 質(zhì) 合 成 相 關(guān) 的 通 路 上 雖 然MEAM1 與MED 兩 個(gè) 煙 粉 虱 隱 種 均 能 顯 著 激 活 植 物 激 素 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 和 苯 丙 烷 類 合 成 通 路 調(diào) 控 的 酚 類 物 質(zhì) 合 成 途 徑 但 MED 煙 粉 虱 隱 種 與 甘 藍(lán) 互 作 的 差 異 表 達(dá) 基 因 數(shù) 高 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 甘 藍(lán)12h 后 甘 藍(lán) 苯 丙 烷 通 路 上 游PAL2 C4H 和4CL1 三 個(gè) 基 因 均 顯 著 上 調(diào) 而MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 苯 丙 烷 通 路 上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四 個(gè) 基 因 均 變 化 不 顯 著 這4 個(gè) 差 異 基 因 的 表 達(dá)模式與測序結(jié)果一致 表明測序結(jié)果的可信度高 關(guān)鍵詞 煙粉虱 轉(zhuǎn)錄組分析 基因 苯丙烷合成通路 芥子油苷 實(shí)時(shí)熒光定量PCR DifferencesinthetranscriptomesofBrassicaoleracealeavesinfestedbyMEAM1 andMEDcrypticspeciesoftobaccowhiteflyBemisiatabaci Hu Jie 1 Lu Jingtian 1 Fu Peiyi 1 Peng Yu 1 Jiao Xiaoguo 1 Zhang Youjun 2 1 StateKeyLaboratoryofBiocatalysisandEnzymeEngineering SchoolofLifeSciences HubeiUniversity Wuhan430062 HubeiProvince China 2 InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China Abstract In order to provide a novel strategy for green control of tobacco whitefly Bemisia tabaci transcriptome analysis was used to analyze the differentially expressed genes DEGs of cabbage after being infested by MEAM1 and MED cryptic species of B tabaci Four genes PAL2 C4H 4CL1 and CHIinvolvedinthephenylpropanoidbiosynthesispathwaywiththemostDEGswereselectedforquan titative real time PCR qRT PCR to verify the reliability of cabbage transcriptome data The results showed that compared with the control the numbers of DEGs in cabbages after being infested by MEAM1 and MED were 693 and 1 030 respectively GO functional annotation and KEGG enrich ment analysis showed that the DEGs were mainly concentrated in the pathways related to the synthesis of insect resistant substances in cabbage such as phenylpropanoid biosynthesis terpenoid biosynthesis glucosinolate biosynthesis flavonoid biosynthesis and plant hormone signal transduction pathway Al 6 期 胡 杰等 MEAM1 和MED 兩個(gè)煙粉虱隱種取食對甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組影響的差異 1381 though the plant hormone signal transduction pathway and phenylpropanoid biosynthesis pathway were significantly activated in both MEAM1 and MED the number of DEGs in cabbage infested by MED was higher than that by MEAM1 After cabbage being infested by MEAM1 for 12 h the three genes PAL2 C4H and 4CL1 upstream of the phenylpropanoid biosynthesis pathway in cabbage were signifi cantly up regulated while PAL2 C4H 4CL1 and CHI in cabbage infested by MED did not change sig nificantly TheexpressionpatternsofthesefourDEGsanalyzedbyqRT PCRwereconsistentwiththose bytranscriptomesequencing indicatingthatthetranscriptomedatawerehighlyreliable Key words Bemisia tabaci transcriptome analysis gene phenylpropanoid biosynthesis pathway glu cosinolates quantitativereal timePCR 在 與 植 食 性 昆 蟲 長 期 協(xié) 同 進(jìn) 化 過 程 中 植 物 形 成 了 一 套 有 效 的 防 御 機(jī) 制 植 物 抗 蟲 防 御 機(jī) 制 通 常 受 植 物 激 素 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 介 導(dǎo) Stahletal 2018 目 前 已知與植物防御機(jī)制有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要有茉 莉 酸 jasmonic acid JA 水 楊 酸 salicylic acid SA 和 乙 烯 這3 種 這 些 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 途 徑 的 末 端 產(chǎn) 物 作 為 信 號(hào) 分 子 激 活 植 物 相 關(guān) 防 御 基 因 的 表 達(dá) 致 使 下 游 次 生 抗 蟲 物 質(zhì) 累 積 和 揮 發(fā) 物 釋 放 從 而 使 植 物 表 現(xiàn) 出 對 害 蟲 的 抗 性 Smith et al 2009 Heil Karban 2010 通 常 認(rèn) 為 刺 吸 式 口 器 害 蟲 侵 染 誘 導(dǎo) 寄 主 植 物 激 活SA 防 御 途 徑 而 咀 嚼 式 口 器 害 蟲 誘 導(dǎo)JA 防 御 途 徑 二 者 通 常 表 現(xiàn) 為 拮 抗 關(guān) 系 Wu Baldwin 2010 甘藍(lán)是一類重要的十字花科作物 其具有多 種 抗 蟲 機(jī) 制 除 具 有 十 字 花 科 作 物 特 有 的 抗 蟲 防 御 體 系 芥 子 油 苷 黑 芥 子 酶 系 統(tǒng) 外 張 凱 鑫 等 2017 苯丙烷通路調(diào)控合成的酚類物質(zhì)也是十字花科作物 一 類 重 要 的 次 生 抗 蟲 物 質(zhì) War et al 2012 Yang et al 2020 煙 粉 虱Bemisia tabaci 隸 屬 半 翅 目 粉 虱 科 其 寄 主 十 分 廣 泛 通 過 直 接 取 食 和 傳 播 病 毒 等 方 式 為 害 大 部 分 蔬 菜 和 園 藝 作 物 Wang et al 2017 煙 粉 虱 是 一 個(gè) 隱 存 種 復(fù) 合 群 包 括30 多 個(gè) 隱 種 其 中 MEAM1 Middle East Asia Minor 1 和MED Medi terranean 是 影 響 最 大 的2 個(gè) 外 來 入 侵 煙 粉 虱 隱 種 Pan et al 2011 越 來 越 多 研 究 表 明 煙 粉 虱 能 利 用JA 與SA 通 路 的 拮 抗 關(guān) 系 即 通 過 激 活SA 通 路 來 抑 制 承 擔(dān) 主 要 防 御 任 務(wù) 的JA 通 路 進(jìn) 而 實(shí) 現(xiàn) 對 植 物 防 御 的 操 控 Zarate et al 2006 Xu et al 2019 Zhang et al 2019 該 機(jī) 制 一 定 程 度 上 解 釋 了 MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 在 全 球 的 發(fā) 生 和 擴(kuò) 散 在 我 國 大 部 分 地 區(qū) MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 逐 漸 被 MED 煙 粉 虱 隱 種 取 代 取 代 的 原 因 主 要 歸 于MED 煙 粉 虱 隱 種 對 常 用 殺 蟲 劑 的 抗 性 比MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 的 高 此 外 MED 煙 粉 虱 隱 種 對 寄 主 植 物 的 適 應(yīng) 性 強(qiáng) 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 Yang et al 2020 目 前 甘 藍(lán) 是 少 有 的 適 宜 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 生 長 發(fā) 育 而 不 利 于MED 煙 粉 虱 隱 種 的 寄 主 植 物 El baz et al 2012 Cui et al 2017 闡 明 甘 藍(lán) 對 MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 的 抗 性 差 異 及 其 機(jī) 制 對 煙 粉 虱 的 防 控 具 有 重 要 意 義 近 年 來 轉(zhuǎn) 錄 組 技 術(shù)被廣泛用于與植物抗蟲相關(guān)基因的挖掘和功能驗(yàn) 證 黃欣蒸等 2020 本 研 究 擬 采 用 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 技 術(shù) 分 析MEAM1 和 MED 兩 個(gè) 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 差 異 基 因 表 達(dá) 并 選 取 差 異 表 達(dá) 基 因 最 多 的 甘 藍(lán) 苯 丙 烷 通 路 上PAL2 C4H 4CL1 和CHI 四 個(gè) 基 因 進(jìn) 行 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR quantification real time PCR qRT PCR 測 定 以 驗(yàn) 證 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 結(jié) 果 的 準(zhǔn) 確 性 以 期 為 綠 色 防 控 煙 粉 虱提供新策略 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 昆 蟲 和 植 物 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 由 湖 北 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 植 保 土 肥 研 究 所 提 供 MED 煙 粉 虱 隱 種 由 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 提 供 這2 個(gè) 煙粉虱隱種分別裝入養(yǎng)蟲籠內(nèi) 置于自然光照 溫度 25 1 和 相 對 濕 度50 70 的 溫 室 中 飼 養(yǎng) 用 營 養(yǎng) 生 長 期 的 棉 花 飼 喂 飼 養(yǎng)3 代 后 用 于 分 子 標(biāo) 記 鑒 定 甘 藍(lán) 品 種 為 京 豐1 號(hào) 種 子 購 于 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 將 種 子 播 于 直 徑 15 cm 營 養(yǎng) 缽 中 將 其 置 于 溫 室 內(nèi) 溫 室 控 制 條 件 同 上 待 甘 藍(lán) 苗 長 到6 8 葉 期 后 供 試 棉 花 品 種 為 中 棉 所49 由 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供 試 劑 和 儀 器 Trizol 試 劑 賽 默 飛 世 爾 科 技 中 國 有 限 公 司 cDNA 合 成 試 劑 盒 翌 圣 生 物 科 技 上 海 有 限 公 司 其 他 試 劑 均 為 國 產(chǎn) 分 析 純 Nano Drop2000 微 量 分 光 光 度 計(jì) 賽 默 飛 世 爾 科 技 中 國 有 限 公 司 JXFSTPRP 24 全 自 動(dòng) 樣 品 快 速 研 磨 儀 1382 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 上 海 凈 信 實(shí) 業(yè) 發(fā) 展 有 限 公 司 DYY 6C 型 電 泳 儀 北 京 市 六 一 儀 器 廠 MonadQuickGel6200 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 莫 納 生 物 科 技 有 限 公 司 CFXConnect 熒 光 定 量 PCR 儀 美 國Bio Rad 公 司 IlluminaHiSeq TM 4000 高 通量測序平臺(tái) 北京百邁客生物科技有限公司 微蟲 籠 外 周 直 徑3 2cm 高1 5cm 的 竹 夾 式 圓 柱 形 塑 料 籠 兩 底 面 粘 孔 徑 為0 075 mm 的 紗 網(wǎng) 自 制 長 35 cm 寬35cm 高35cm 紗 網(wǎng) 孔 徑 為0 125mm 的 養(yǎng)蟲籠 自制 1 2 方法 1 2 1 煙粉虱取食試驗(yàn)及樣品采集 為 保 證 試 驗(yàn) 材 料 的 一 致 性 和 結(jié) 果 的 準(zhǔn) 確 性 選 取 長 勢 一 致 葉 片 總 面 積 大 致 相 等 的6 8 葉 期 甘 藍(lán) 苗 進(jìn) 行 試 驗(yàn) 為 了 防 止 煙 粉 虱 在 葉 片 間 遷 飛 在 每 株 甘 藍(lán) 中 下 部 葉 片 上 夾 上1 個(gè) 微 蟲 籠 用 自 制 吸 蟲 器 隨 機(jī) 吸 取MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 成 蟲 各50 頭 雌 雄 性 比 為1 1 置 于 微 蟲 籠 內(nèi) 在 室 內(nèi) 自 然 條 件 下任其自由取食 以籠中無煙粉虱為對照 每個(gè)處理 重 復(fù)4 次 每 個(gè) 重 復(fù)1 株 甘 藍(lán) 接 種 煙 粉 虱 為 害1 d 后 取 每 株 甘 藍(lán) 中 下 部 未 接 蟲 的 單 片 葉 用 于RNA 提 取 1 2 2 煙粉虱取食后甘藍(lán)葉片RNA 提取和測序 將不同處理的甘藍(lán)葉片迅速置于液氮中利用研 磨 儀 粉 碎 研 磨 按 照Trizol 試 劑 說 明 書 提 取 樣 品 RNA 使 用 微 量 分 光 光 度 計(jì) 和1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 進(jìn) 行RNA 純 度 濃 度 和 完 整 度 檢 測 取1 9 OD 260nm OD 280nm 2 0 完 整 度 較 好 的RNA 樣 品 委 托 北 京 百 邁 客 生 物 科 技 有 限 公 司 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測 定 利 用Illu minaHiSeq TM 4000 高 通 量 測 序 平 臺(tái) 對 測 序 獲 得 的 原 始 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 質(zhì) 量 控 制 即 去 除 原 始 數(shù) 據(jù) 中 含 有 接 頭 的 和 低 質(zhì) 量 的reads 得 到cleandata 經(jīng) 過 測 序 質(zhì) 量 控 制 各 樣 品Q 30 堿 基 百 分 比 均 不 低 于90 表 示 測 序 質(zhì) 量 良 好 能 夠 滿 足 建 庫 要 求 可 用 于 后 續(xù) 試 驗(yàn) 分 析 1 2 3 煙粉虱取食后甘藍(lán)葉片的轉(zhuǎn)錄組差異分析 將cleandata 與 甘 藍(lán) 參 考 基 因 組 ftp ftp ensem blgenomes org pub plants release 45 fasta brassica ol eracea dna 進(jìn) 行 序 列 比 對 獲 得mapped data 對 不 同 處 理 樣 品 的 表 達(dá) 量 進(jìn) 行 差 異 表 達(dá) 分 析 將 倍 數(shù) 變 化 fold change FC 2 且 閾 值 錯(cuò) 誤 發(fā) 現(xiàn) 率 false discovery rate FDR 0 01 作 為 篩 選 差 異 基 因 的 標(biāo) 準(zhǔn) 篩 選 到 的 差 異 基 因 進(jìn) 行GO 功 能 注 釋 和KEGG 通 路 富 集 分 析 GO 功 能 注 釋 是 基 于GO 數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn) 行的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋過程 包括生物學(xué)過程 分子功 能 和 細(xì) 胞 組 分3 個(gè) 方 面 KEGG 通 路 富 集 分 析 可 以 將 差 異 表 達(dá) 基 因 的 通 路 注 釋 分 析 提 供 的 整 合 代 謝 途 徑 包 括 碳 水 化 合 物 核 苷 和 氨 基 酸 等 利 用 GraphPad Prism 8 0 軟 件 繪 制GO 功 能 注 釋 分 類 統(tǒng) 計(jì) 圖 1 2 4 煙 粉 虱 取 食 后 甘 藍(lán) 葉 片 差 異 表 達(dá) 基 因 的 驗(yàn) 證 為 了 驗(yàn) 證 測 序 結(jié) 果 的 準(zhǔn) 確 性 選 取 差 異 表 達(dá) 基 因 最 多 的 甘 藍(lán) 苯 丙 烷 通 路 上PAL2 C4H 4CL1 和 CHI 四 個(gè) 上 游 基 因 進(jìn) 行qRT PCR 測 定 飼 喂 試 驗(yàn) 處 理 試 蟲 數(shù) 量 雌 雄 比 和 取 樣 方 法 同1 2 1 僅 是 煙 粉 虱 取 食12h 后 取 樣 參 照Trizol 試 劑 說 明 書 提 取 甘 藍(lán) 樣 品 總RNA 使 用 微 量 分 光 光 度 計(jì) 和1 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測RNA 的 純 度 和 完 整 性 取2 g 質(zhì) 量 較 好 且 無 基 因 組 污 染 的 總RNA 按 照cDNA 合 成 試 劑 盒 說 明 書 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成cDNA 利 用Primer Pre mier5 0 軟 件 及NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 序 列 對 這4 個(gè) 基 因 的 引 物 進(jìn) 行 設(shè) 計(jì) 表1 使 用CFX Connect 熒 光 定 量 PCR 儀 進(jìn) 行qRT PCR 擴(kuò) 增 10 L 反 應(yīng) 體 系 20 倍 稀 釋 的cDNA 模 板 液2 L 2 SYBR 預(yù) 混 染 料Ex Taq II 5 L 100 mol L 上 下 游 引 物 各 0 4 L ddH 2 O2 2 L 反 應(yīng) 條 件 95 預(yù) 變 性3min 95 變 性30 s 55 退 火30 s 72 延 伸1 min 40 個(gè) 循 環(huán) 甘 藍(lán)Actin 為 內(nèi) 參 基 因 每 個(gè) 處 理3 次 生 物 學(xué) 重 復(fù) 采 用2 Ct 法 對qRT PCR 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 分 析 獲 得4 個(gè) 基 因的表達(dá)量 表1 本研究設(shè)計(jì)的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測的基因引物 Table1 Sequencesofspecificprimersdesignedandusedforquantitativereal timePCR 基因Gene PAL2 C4H 4CL1 CHI Actin 正向引物Forwardprimer 5 AGTTCACCGATCATCTAACG 3 5 GCCGTTCCTTAGAGGCTACTTG 3 5 GAGGTGTAAAGTGACGGTTGCTC 3 5 CGGAGAACTGTGTGGCGATA 3 5 CTATTGAGCATGGTGTTGTGAGC 3 反向引物Reverseprimer 5 CTAGCTTCATGTACGAGCTT 3 5 CCTCGTTGATCTCTCCCTTCTGTT 3 5 AGCACCAGATTTCACAACCCTAA 3 5 AGAGCGAAGAGGATGGATGC 3 5 TAGCTGGAGAGTTGAAGGTTTCG 3 1 3 數(shù)據(jù)分析 使 用IBM SPSS Statistic 19 0 軟 件 對 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 分 析 采 用 單 因 素 進(jìn) 行 方 差 分 析 應(yīng) 用 Tukey sHSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) 2 結(jié)果與 分析 2 1 煙粉虱取食后甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析 與 對 照 相 比 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 甘 藍(lán) 葉 片1d 后 其差異表達(dá)基因有693 個(gè) 其中467 個(gè)上調(diào) 表 達(dá) 226 個(gè) 下 調(diào) 表 達(dá) MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 甘 藍(lán) 葉 片1d 后 其 差 異 表 達(dá) 基 因 有1030 個(gè) 其 中576 個(gè) 上 調(diào)表達(dá) 454 個(gè)下調(diào)表達(dá) 圖1 2 2 煙粉虱取食后甘藍(lán)差異表達(dá)基因GO 功能注釋 僅列出富集顯著性最可靠且注釋到的差異基因 超 過30 個(gè) 的 通 路 圖2 MED 與MEAM1 煙 粉 虱 隱種取食1d 后 甘藍(lán)差異基因均主要富集到生物學(xué) 過 程 和 細(xì) 胞 組 分 這 兩 大 類 其 中 在 生 物 學(xué) 過 程 中 富 集 到 差 異 基 因 個(gè) 數(shù) 最 多 的 是 細(xì) 胞 過 程 代 謝 過 程 和 單 組 織 過 程 在 細(xì) 胞 組 分 中 富 集 到 差 異 基 因 個(gè) 數(shù) 最 多 的 是 細(xì) 胞 和 細(xì) 胞 組 分 分 子 功 能 中 富 集 到 差 異 基 因 最 多 的 是 催 化 活 性 和 結(jié) 合 圖2 在 所 有GO 條 目 中 MED 煙 粉 虱 取 食1 d 后 甘 藍(lán) 富 集 到 的 差 異 基 因均 要多 于MEAM1 取食1d 后的 甘藍(lán) 圖2 由此 可 見 與MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 相 比 MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 能 夠 引 起 甘 藍(lán) 響 應(yīng) 的 程 度 更 高 二 者 誘 導(dǎo)甘藍(lán)產(chǎn)生的防御響應(yīng)水平差別較大 圖1 MEAM1 和MED 煙粉虱隱種取食后 甘藍(lán)葉片差異表達(dá)基因數(shù) Fig 1 No ofdifferentiallyexpressedgenesofcabbageinfest edbyMEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 1 細(xì) 胞 過 程 2 代 謝 過 程 3 單 組 織 過 程 4 生 物 調(diào) 節(jié) 5 刺 激 響 應(yīng) 6 發(fā) 育 過 程 7 多 細(xì) 胞 生 物 過 程 8 細(xì) 胞 組 成 或 生 物 發(fā) 生 9 定 位 10 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 11 繁 殖 過 程 12 多 組 織 過 程 13 細(xì) 胞 14 細(xì) 胞 組 分 15 細(xì) 胞 器 16 膜 17 膜 組 分 18 大 分 子 復(fù) 合 體 19 胞 外 區(qū) 20 細(xì) 胞 連 接 21 共 質(zhì) 體 22 結(jié) 合 23 催 化 活 性 24 結(jié) 合 25 核 酸 結(jié) 合 轉(zhuǎn) 錄 因 子 活 性 26 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 活 性 1 Cellularprocess 2 metabolicprocess 3 single organismprocess 4 bio logicalregulation 5 responsetostimulus 6 developmentalprocess 7 multicellularorganismalprocess 8 cellularcompo nent organization or biogenesis 9 localization 10 signaling 11 reproductive process 12 multi organism process 13 cell 14 cell part 15 organelle 16 membrane 17 membrane part 18 macromolecular complex 19 extracellular region 20 celljunction 21 symplast 22 binding 23 catalyticactivity 24 binding 25 nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivi ty 26 transporteractivity 圖2 MEAM1 和MED 煙粉虱隱種取食后甘藍(lán)葉片差異表達(dá)基因的GO 功能注釋 Fig 2 GOfunctionalcategoriesofdifferentiallyexpressedgenesinthecabbageleavesinfestedbyMEAM1and MEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 2 3 煙 粉 虱 取 食 后 甘 藍(lán) 差 異 表 達(dá) 基 因 的KEGG 分 析 KEGG 富 集 分 析 結(jié) 果 顯 示 MEAM1 和MED 煙 粉虱隱種取食后甘藍(lán)葉片差異表達(dá)基因分別富集到 84 條 和87 條 通 路 上 其 中 與 作 物 抗 蟲 性 密 切 相 關(guān) 的 通 路 有 苯 丙 烷 類 生 物 合 成 途 徑 芥 子 油 苷 生 物 合 成 途徑 類黃酮生物合成途徑 萜類揮發(fā)物生物合成途 6 期 胡 杰等 MEAM1 和MED 兩個(gè)煙粉虱隱種取食對甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組影響的差異 1383徑 和 植 物 激 素 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 與 對 照 相 比 MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 均 引 起 這 些 抗 蟲 通 路 部 分 標(biāo) 記 基 因 上 調(diào) MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán)注釋到與抗蟲防御相關(guān)通路上的差異表達(dá)基因數(shù) 要 遠(yuǎn) 多 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 表 明MED 煙 粉虱隱種誘導(dǎo)甘藍(lán)的防御響應(yīng)更明顯 表2 表2 MEAM1 和MED 煙粉虱隱種取食后甘藍(lán)葉片抗蟲防御相關(guān)差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析 Table2 KEGGenrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinvolvedintheplantdefensepathwayincabbagesinfestedby MEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 路徑編號(hào) PathwayID ko00900 ko00940 ko00966 ko04075 ko00941 通路描述 Pathwaydescription 萜類揮發(fā)物生物合成途徑Terpenoidbackbonebiosynthesis 苯丙烷類生物合成途徑Phenylpropanoidbiosynthesis 芥子油苷生物合成途徑Glucosinolatebiosynthesis 植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑Planthormonesignaltransduction 類黃酮生物合成途徑Flavonoidbiosynthesis 差異表達(dá)基因數(shù)目 No ofdifferentiallyexpressedgenes MEAM1 取食甘藍(lán) MEAM1 infestedcabbages 1 12 2 11 3 MED 取食甘藍(lán) MED infestedcabbages 2 17 3 19 2 2 4 煙粉虱取食后甘藍(lán)葉片差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食12 h 后 甘 藍(lán) 葉 片 苯 丙 烷 通 路 上 PAL2 F 2 6 37 223 P 0 001 圖3 A C4H F 2 6 19 676 P 0 002 圖 3 B 和 4CL1 F 2 6 26 146 P 0 001 圖3 C 3 個(gè) 上 游 基 因 的 相 對 表 達(dá) 量 均 較 對 照 顯 著 上 調(diào) 而CHI 基 因 F 2 6 0 550 P 0 604 圖3 D 相 對 表 達(dá) 量 較 對 照 無 顯 著 變 化 相 反 MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食12 h 后 甘 藍(lán) 葉 片 苯 丙 烷 通 路 上4 個(gè) 基 因 的 相 對 表 達(dá) 量 均 較 對 照 無 顯 著 變 化 且 這4 個(gè) 差 異 基 因 的qRT PCR 結(jié) 果 與 測 序 結(jié) 果 一致 圖3 表明測序結(jié)果可信度高 圖3 MEAM1 和MED 煙粉虱隱種取食后誘導(dǎo)甘藍(lán)葉片苯丙烷通路相關(guān)基因PAL2 A C4H B 4CL1 C 和CHI D 的表達(dá) Fig 3 RelativeexpressionlevelsofPAL2 A C4H B 4CL1 C andCHI D genesinvolvedinthephenylpropanoidpathwayin cabbageleavesinfestedbyMEAM1andMEDcrypticspeciesofBemisiatabaci 圖 中 數(shù) 據(jù) 均 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 誤 同 色 柱 上 不 同 小 寫 字 母 表 示 經(jīng)Tukey s HSD 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 水 平 差 異 顯 著 Data are mean SE DifferentlowercaselettersonthesamebarsindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyTukey sHSDtest 1384 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷3 討論 本 研 究 通 過 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 分 析 發(fā) 現(xiàn) MEAM1 和 MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 均 能 誘 導(dǎo) 甘 藍(lán) 產(chǎn) 生 防 御 響 應(yīng) 主要體現(xiàn)在有較多的差異表達(dá)基因被注釋到苯丙烷 通 路 控 制 的 多 酚 合 成 類 黃 酮 合 成 和 萜 類 揮 發(fā) 物 合 成等與植物抗蟲機(jī)制相關(guān)的調(diào)控通路上 目前普遍 認(rèn) 為 刺 吸 式 口 器 害 蟲 取 食 能 激 活 寄 主 植 物SA 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 而 有 效 抑 制JA 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 兩 者 通 常 表 現(xiàn) 為 拮 抗 關(guān) 系 Zhang et al 2009 但 是 本 研 究 發(fā) 現(xiàn)MEAM1 和MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 均 能 導(dǎo) 致JA 信 號(hào) 通 路 上 的 部 分 關(guān) 鍵 標(biāo) 記 基 因 上 調(diào) 而SA 信 號(hào) 通 路 標(biāo) 記 基 因 無 顯 著 變 化 Florencio Ortiz et al 2020 研 究 結(jié) 果 也 發(fā) 現(xiàn) 刺 吸 式 害 蟲 蚜 蟲 取 食 辣 椒 后 其 葉 片 內(nèi)JA 含 量 在 各 個(gè) 時(shí) 間 點(diǎn) 均 顯 著 上 調(diào) 而 SA 含 量 無 明 顯 變 化 Kantetal 2008 研 究 發(fā) 現(xiàn) 有 些 二 斑 葉 螨Tetranychus urticae 品 系 的 取 食 甚 至 能 同 時(shí) 抑 制JA 與SA 信 號(hào) 通 路 Maronetal 2019 認(rèn) 為害蟲取食所誘導(dǎo)的寄主植物防御信號(hào)通路具有害 蟲 種 的 特 異 性 和 寄 主 植 物 種 的 特 異 性 由 此 可 見 JA 與SA 信 號(hào) 通 路 的 運(yùn) 作 機(jī) 制 十 分 復(fù) 雜 受 多 種 因 素 的 影 響 尚 無 普 遍 適 用 的 模 式 苯 丙 烷 類 合 成 通 路調(diào)控合成的酚類物質(zhì)是一類重要的植物次生抗蟲 代 謝 產(chǎn) 物 Dixon et al 2002 War et al 2012 本 研 究 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 甘 藍(lán) 被MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食12h 后 苯 丙 烷 通 路 多 酚 合 成 3 個(gè) 相 關(guān) 基 因 表 達(dá) 顯 著 上 調(diào) 而 甘 藍(lán) 被MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 苯 丙 烷 通 路 上4 個(gè) 基 因 與 未 被 取 食 的 甘 藍(lán) 均 沒 有 顯 著 變 化 可 見 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 誘 導(dǎo) 甘 藍(lán) 總 酚 的 累 積 使 寄 主 質(zhì) 量 惡 化 導(dǎo) 致MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 回 避 在前期取食過的甘藍(lán)上取食和產(chǎn)卵 未發(fā)表數(shù)據(jù) 甘 藍(lán) 對MEAM1 和MED 煙 粉 虱 的 抗 性 存 在 明 顯 差 異 如 相 較 于MED 煙 粉 虱 隱 種 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 在 甘 藍(lán) 上 存 活 率 和 生 殖 率 更 高 發(fā) 育 歷 期 也 更 短 Cui et al 2017 Liu et al 2012 通 過 刺 探 電 位 技 術(shù) 發(fā) 現(xiàn) MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 比MED 煙 粉 虱 隱 種 更 適 于 在 甘 藍(lán) 上 取 食 本 研 究 的GO 功 能 注 釋 圖 顯 示 在 所 有GO 條 目 中MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 差 異 表 達(dá) 基 因 數(shù) 要 顯 著 多 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 的 KEGG 富 集 分 析 還 發(fā) 現(xiàn)MED 煙 粉 虱 隱 種 取食后甘藍(lán)注釋到與抗蟲防御相關(guān)的通路上的差異 表 達(dá) 基 因 數(shù) 量 要 遠(yuǎn) 多 于MEAM1 取 食 后 的 由 此 可 見MEAM1 與MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 誘 導(dǎo) 甘 藍(lán) 產(chǎn) 生 的 防 御 響 應(yīng) 水 平 差 異 較 大 且 相 較 于MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 MED 煙 粉 虱 隱 種 取 食 引 起 甘 藍(lán) 響 應(yīng) 的 水 平 更 高 證 明 了 甘 藍(lán) 作 為 寄 主 植 物 對MED 煙 粉 虱 的 抗 性 強(qiáng) 于 對MEAM1 煙 粉 虱 的 抗 性 Cui et al 2017 也 報(bào) 道MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 比MED 煙 粉 虱 隱 種 能 夠更好地操控甘藍(lán)寄主營養(yǎng)物質(zhì)含量和誘導(dǎo)防御響 應(yīng) 與 本 研 究 結(jié) 果 一 致 而 關(guān) 于2 個(gè) 煙 粉 虱 隱 種 取 食 后 甘 藍(lán) 抗 性 存 在 差 異 的 原 因 有 多 種 合 理 解 釋 行 為 學(xué) 觀 點(diǎn) 認(rèn) 為 在 取 食 甘 藍(lán) 時(shí)MEAM1 和MED 兩 個(gè) 煙 粉 虱 隱 種 口 針 刺 探 行 為 的 差 異 使 得MED 煙 粉 虱 隱 種 更 易 與 芥 子 油 苷 黑 芥 子 酶 系 統(tǒng) 催 化 水 解 產(chǎn) 生的異硫氰酸酯 硫氰酸酯和腈類等有毒產(chǎn)物接觸 進(jìn) 而 導(dǎo) 致 甘 藍(lán) 對 MED 煙 粉 虱 隱 種 抗 性 高 于 MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 Huetal 2020 代 謝 觀 點(diǎn) 認(rèn) 為MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 體 內(nèi) 的 脫 硫 酯 酶 活 性 強(qiáng) 于 MED 煙 粉 虱 隱 種 能 將 甘 藍(lán) 的 芥 子 油 苷 高 效 轉(zhuǎn) 化 為 無 毒 的 產(chǎn) 物 Ren et al 2021 此 外 MEAM1 煙 粉 虱隱種能通過轉(zhuǎn)葡萄糖基作用來代謝脂肪族和吲哚 族 芥 子 油 苷 降 低 其 被 黑 芥 子 酶 活 化 的 中 毒 風(fēng) 險(xiǎn) Malkaetal 2020 MED 煙 粉 虱 隱 種 是 否 有 類 似 解 毒 機(jī) 制 以 及MEAM1 煙 粉 虱 隱 種 的 轉(zhuǎn) 葡 萄 糖 基 作 用 是 否 強(qiáng) 于MED 煙 粉 虱 隱 種 還 需 進(jìn) 一 步 研 究 相 反 Yangetal 2020 和Lietal 2021 研 究 結(jié) 果 表 明 甘 藍(lán) 芥 子 油 苷 的 種 類 和 含 量 對 煙 粉 虱 的 取 食 和 產(chǎn) 卵 無 顯 著 影 響 煙 粉 虱 的 取 食 和 產(chǎn) 卵 選 擇 性 可 能 受不同基因型甘藍(lán)