植物保護(hù)學(xué)報(bào)Journalof PlantProtection 2021 48 6 1422 1428 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2021 2021897 沃爾巴克氏體感染對(duì)黑腹果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組的影響 陳夢(mèng)巖 王智凝 許鳳貞 馮怡瑋 喻瓊琳 王玉鳳 華 中 師 范 大 學(xué) 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 武 漢430079 摘 要 為 明 確 沃 爾 巴 克 氏 體Wolbachia 對(duì) 果 蠅 神 經(jīng) 行 為 影 響 的 分 子 機(jī) 制 采 取 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 技 術(shù) 對(duì) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體 和 未 感 染 的 黑 腹 果 蠅Drosophila melanogaster 頭 部 樣 本 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 組 裝 注 釋 篩 選 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 間 的 差 異 表 達(dá) 基 因 并 選 擇 差 異 表 達(dá) 基 因 中 差 異 倍 數(shù) 較 大 或 與 神 經(jīng) 行 為 相 關(guān) 的 基 因 進(jìn) 行qPCR 驗(yàn) 證 結(jié) 果 表 明 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體 wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 差 異 表 達(dá) 基 因 有679 個(gè) 差 異 倍 數(shù) 2 P2 P 0 05 were differentially expressed in the heads of wMel Wolbachia infected and uninfected flies of which 566 genes were up regulated and 113 genesweredown regulatedbecauseof wMelWolbachiainfection GOanalysisshowedthatmanyofthe DEGs were related to the metabolism catalysis and binding KEGG analysis showed that the DEGs were mainly enriched in protein digestion and absorption endocrine neuroactive ligand receptor inter actionandhormonesynthesispathways Totally 11DEGswereselectedforqPCRvalidation andthe re sultsofninegeneswereconsistentwithRNAsequencing ThesesuggestedthatWolbachiamightwidely affectgeneexpressionlevelsinthehead andthusinfluencetheneurobehaviorofD melanogaster Keywords Wolbachia Drosophilamelanogaster head transcriptome RNAsequencing 沃 爾 巴 克 氏 體Wolbachia 是 一 種 革 蘭 氏 陰 性 細(xì) 菌 能 感 染65 以 上 的 昆 蟲 Bulman et al 2021 沃 爾 巴 克 氏 體 可 能 是 目 前 世 界 上 分 布 最 廣 豐 度 最 高的共生微生物 已有研究表明沃爾巴克氏體能廣 泛 影 響 宿 主 基 因 的 表 達(dá) He et al 2019 Sigle McGraw 2019 Dou et al 2021 一 些 沃 爾 巴 克 氏 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 32170511 通信作者 Authorforcorrespondence E mail yfengw 收稿日期 2021 09 256 期 陳夢(mèng)巖等 沃爾巴克氏體感染對(duì)黑腹果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組的影響 1423 體 品 系 能 顯 著 縮 短 昆 蟲 宿 主 的 壽 命 抑 制 昆 蟲 體 內(nèi) 病毒等病原體的增殖 誘導(dǎo)昆蟲生殖方式的改變 因 此 可 被 用 于 媒 介 昆 蟲 和 農(nóng) 業(yè) 害 蟲 的 生 物 防 治 Zhengetal 2019 Gongetal 2020 細(xì) 胞 質(zhì) 不 親 和 cytoplasmic incompatibility CI 是 沃 爾 巴 克 氏 體 感 染 昆 蟲 后 引 起 的 最 常 見 表 型 即 感染沃爾巴克氏體的雄性與未感染或感染不同品系 沃爾巴克氏體的雌性交配后 子代不能正常發(fā)育 在 胚 胎 早 期 死 亡 Werren et al 2008 目 前 對(duì) 沃 爾 巴克氏體與宿主關(guān)系的研究多集中在其對(duì)宿主生殖 的 影 響 方 面 Beckmann et al 2019 Sicard et al 2021 然而沃爾巴克氏體不僅存在于宿主的生殖系 統(tǒng) 中 而 且 也 廣 泛 存 在 于 宿 主 的 神 經(jīng) 系 統(tǒng) 中 Albert son et al 2013 Pietri et al 2016 但 有 關(guān) 沃 爾 巴 克 氏 體 對(duì) 宿 主 神 經(jīng) 行 為 方 面 的 影 響 研 究 還 很 少 相 關(guān) 分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚 沃爾巴克氏體可通過感染包括大腦在內(nèi)的昆蟲 神經(jīng)系統(tǒng)來影響宿主的攻擊行為 睡眠 學(xué)習(xí)和記憶 能 力 等 Bi et al 2019 Bi Wang 2020 為 了 進(jìn) 一步探討沃爾巴克氏體感染對(duì)昆蟲宿主神經(jīng)行為影 響 的 分 子 機(jī) 制 對(duì) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體 和 未 感 染 的 黑 腹 果 蠅Drosophila melanogaster 頭 部 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 分 析 篩 選 沃 爾 巴 克 氏 體 感 染 導(dǎo) 致 黑 腹 果 蠅 頭 部 差 異 表 達(dá) 的 基 因 并 分 析 差 異 表 達(dá) 基 因 富 集 的 生 物 學(xué) 途 徑 以 期 為 進(jìn) 一 步 研 究 沃 爾 巴 克 氏 體 對(duì) 昆 蟲 宿 主神經(jīng)行為影響的分子機(jī)制提供參考 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 果 蠅 品 系 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 的 黑 腹 果 蠅 品 系 由 澳 大 利 亞Monash 大 學(xué)O NeillSL 教 授 饋 贈(zèng) 于 華 中 師 范 大 學(xué) 動(dòng) 物 發(fā) 育 與 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 室 在 溫 度25 12 h 光 照 和12 h 黑 暗 相 對(duì) 濕 度70 的 培 養(yǎng) 箱 中 用 玉 米 粉 紅 糖 培 養(yǎng) 基 飼 養(yǎng) 將 感 染wMel 品 系 的 黑 腹 果 蠅 用 含 有0 3 mg mL 四 環(huán) 素 的 玉 米 粉 紅 糖 培 養(yǎng) 基 連 續(xù) 喂 養(yǎng)3 代 以 上 用 沃 爾 巴 克 氏 體 表 面 蛋 白 編 碼 基 因wsp 引 物 表1 進(jìn) 行PCR 檢 測(cè) 確保沃爾巴克氏體除凈后 再用不含抗生素的玉 米 粉 紅 糖 培 養(yǎng) 基 飼 養(yǎng)6 代 以 上 以 去 除 四 環(huán) 素 可 能 帶 來 的 影 響 張 維 等 2017 飼 養(yǎng) 條 件 同 上 最 終 獲 得未感染沃爾巴克氏體wMel 的黑腹果蠅 玉 米 粉 紅 糖 培 養(yǎng) 基 玉 米 粉30g 紅 糖30g 酵 母2g 瓊脂2g 和300mL 蒸餾水 試 劑 及 儀 器 TrizolRNA 提 取 試 劑 盒 及 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 M MLV 美 國(guó)Invitrogen 公 司 Oligo Dt 18 引 物 日 本TaKaRa 公 司 熒 光 定 量PCR 試 劑 盒 SYBRGreen qPCRSuperMix 和SYBRPremixExTaq 德 國(guó)QIA GEN 公 司 其 余 試 劑 均 為 國(guó) 產(chǎn) 分 析 純 BGISEQ 500 基 因 測(cè) 序 儀 華 大 基 因 有 限 公 司 CFX Connect OpticsModule 熒光定量PCR 儀 美國(guó)Bio Rad 公司 1 2 方法 1 2 1 黑腹果蠅不同品系的RNA 測(cè)序分析 分 別 解 剖 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 的 4 6 日 齡 黑 腹 果 蠅 頭 部 每 個(gè) 生 物 學(xué) 重 復(fù) 解 剖100 頭 3 個(gè) 生 物 學(xué) 重 復(fù) 采 用TrizolRNA 提 取 試 劑 盒 提 取 供 試 黑 腹 果 蠅 品 系 的RNA 并 委 托 華 大 基 因 有 限 公 司完成測(cè)序 具體操作參照Zhengetal 2019 方法 對(duì) 測(cè) 序 數(shù) 據(jù) 分 析 前 需 去 除 原 始 數(shù) 據(jù) 中 低 質(zhì) 量 接 頭 污 染 以 及 未 知 堿 基N 含 量 過 高 的reads 以 保 證 結(jié)果的可靠性 本研究使用華大基因有限公司自主 研 發(fā) 的 過 濾 軟 件SOAPnuke 進(jìn) 行 過 濾 具 體 標(biāo) 準(zhǔn) 為 去 除 包 含 接 頭 的reads 即 接 頭 污 染 的reads 去 除 未 知 堿 基N 含 量 大 于10 的reads 去 除 低 質(zhì) 量 的 reads 將 質(zhì) 量 值 低 于15 的 堿 基 占 該reads 總 堿 基 數(shù) 的 比 例 大 于50 的reads 定 義 為 低 質(zhì) 量 的reads 過 濾 后 的 高 質(zhì) 量reads 保 存 為FASTQ 格 式 由 于 使 用 的 黑 腹 果 蠅 是 模 式 生 物 有 特 定 的 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫 Flybase4 1 0 http flybase org 可 供 序 列 比 對(duì) 因 此 不 用 進(jìn) 行 拼 接 使 用HISAT2 2 1 0 軟 件 將 高 質(zhì) 量 reads 比 對(duì) 到 Flybase 4 1 0 中 的 參 考 基 因 組 序 列 Kim et al 2015 得 到 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 本 的 基 因 信 息 使 用 Bowtie2 2 2 5 軟 件 Langmead Salzberg 2012 將 高 質(zhì) 量reads 比 對(duì) 到 參 考 基 因 序 列 使 用RSEM1 2 8 軟 件 Li Dewey 2011 計(jì) 算 得 到 所 有 樣 品 中 各 基 因的表達(dá)水平 1 2 2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)和通路分析 用DEGseq2 對(duì) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 的 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 基 因 進(jìn) 行 差 異 表 達(dá) 分 析 Wang et al 2010 差 異 基 因 的 選 擇 標(biāo) 準(zhǔn) 是 差 異 表 達(dá) 倍 數(shù) 大 于 等 于2 且P 0 05 采 用GOseqR 軟 件 對(duì) 差 異 表 達(dá) 基 因 進(jìn) 行GO 功 能 富 集 分 析 應(yīng) 用KOBAS 軟 件 對(duì) 差 異 表 達(dá) 基 因 進(jìn) 行KEGG 通 路 富 集 分 析 Maoetal 2005 富 集 顯 著 性 多 重 比 對(duì) 采 用Ben jamini Hochberg 法計(jì)算矯正的P 值 q 值 1 2 3 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證 利 用Flybase 4 1 0 http flybase org 對(duì) 差 異 表 達(dá) 基 因 進(jìn) 行 功 能 注 釋 篩 選 出 差 異 較 大 或 且 可 能 與 神 經(jīng) 行 為 有 關(guān) 的 基 因 進(jìn) 行 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR quan titativereal timePCR qPCR 驗(yàn) 證 使 用PrimerPre 1424 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 mier5 0 軟 件 設(shè) 計(jì) 待 驗(yàn) 證 的 差 異 表 達(dá) 基 因 編 碼 序 列 的 引 物 表1 引 物 均 由 武 漢 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成 用TrizolRNA 提 取 試 劑 盒 提 取4 6 日 齡 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 總 RNA 在 測(cè) 定RNA 濃 度 后 取1 g 總RNA 樣 品 用 Oligo Dt 18 引 物 及 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶M MLV 合 成cDNA 第 一 鏈 選 用SYBRGreenIIDye 用 熒 光 定 量PCR 儀 進(jìn) 行qPCR 20 L 反 應(yīng) 體 系 SYBR Premix Ex Taq 10 L cDNA 模 板1 L 10 mol L 上 下 游 引 物 各 0 3 L 加ddH 2 O 補(bǔ) 足 至20 L 反 應(yīng) 條 件 95 預(yù) 變 性30 s 95 變 性10 s 57 2 60 0 引 物 不 同 退 火 溫 度 的 選 擇 也 不 同 退 火30 s 72 延 伸20 s 共 40 個(gè) 循 環(huán) 最 后 從55 逐 漸 增 加 到98 每0 2 讀1 s 監(jiān) 測(cè) 每 一 步 的 熒 光 信 號(hào) 以 生 成 熔 解 曲 線 同 時(shí) 用ROX 內(nèi) 參 染 料 校 正 孔 與 孔 之 間 產(chǎn) 生 的 熒 光 信 號(hào) 誤 差 反 應(yīng) 結(jié) 束 后 讀 取Ct 值 并 計(jì) 算 基 因 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量 以rp49 基 因 為 內(nèi) 參 兩 者 的 差 異 表 達(dá) 倍 數(shù) 采用2 Ct 法計(jì)算 每種樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù) 表1 本試驗(yàn)所用引物信息 Table1 Informationofprimersusedinthisstudy 基因 Gene wsp CG13794 CG13321 CG2977 CG30473 CG5017 CG42643 CG13524 CG32475 CG33508 crebB rut rp49 正向引物序列 5 3 Forwardprimersequence 5 3 TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC TGGTTCTTCATGCGTTCGGA AGGTCCTTGTCGGTGATCAC TCAAGTTCGATCTCACGCGT ACTACGCTGTCATCCGCTT AGGACCAGACCAAAACCGA CTCTGCAGCGCGACATTTAC CCAAGCAATTCTGCGATCCG AACATAACGGGGAGCTACGG GGTCGAAAGGGTCTGGTCTG TCGGGAGTCATACAGACAGCA ATCGTGTTCGTGGTCTTCCTC CGGTTACGGATCGAACAAGC 反向引物序列 5 3 Reverseprimersequence 5 3 AAAAATTAAACGCTACTCCA TGCGGTAGCACTGGACAAAT CTATCCACGTCTCGGGCTG TGTTGATGACCGGAGACACA CACTTCACCCGACTGCTGT GGAATCACGCGCTCCTTTAG CTCAGCCAAAAGTTGGGCAC AGGGTATCCTCGCACTCCTT ATCCGTACACAGGGTTTGGT AAATCCAGTTTGCCACGCAC CACGGAAAGGTTGGAGGG TAGACCGTTAGACTTATGTGC CTTGCGCTTCTTGGAGGAGA 退火溫度 Annealing temperature 58 1 59 9 59 3 59 7 58 6 58 4 59 9 59 9 59 5 60 0 57 2 57 6 57 4 片段大小 Fragmentsize bp 610 239 243 168 186 160 151 115 167 182 246 107 150 1 3 數(shù)據(jù)分析 采 用GraphpadPrism5 01 軟 件 對(duì) 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用t 檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn) 2 結(jié)果與分析 2 1 感染wMel 和未感染果蠅頭部的差異表達(dá)基因 對(duì) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 的 黑 腹 果 蠅頭部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 去除接頭序列 模糊序列以 及低質(zhì)量序列之后 共檢測(cè)到13597 個(gè)基因 表明黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 充 足 且 質(zhì) 量 可 靠 可 進(jìn) 行 后 續(xù) 分 析 在 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 的 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 間 共 發(fā) 現(xiàn) 差 異 表 達(dá) 基 因 差 異 表 達(dá) 倍 數(shù) 2 且P 0 05 679 個(gè) 其 中 因 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 而 發(fā) 生 上 調(diào) 表 達(dá) 的 基 因 有566 個(gè) 發(fā) 生 下 調(diào) 表達(dá)的基因有113 個(gè) 圖1 2 2 感 染wMel 和 未 感 染 果 蠅 差 異 表 達(dá) 基 因GO 分 析 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 差 異 表 達(dá) 基 因 的GO 功 能 主 要 富 集 在 生 物 過 程 細(xì) 胞 組 分 和 分 子 功 能3 個(gè) 部 分 在 生 物 過 程 中 富 集 到 代 謝 過 程 的 差 異 表 達(dá) 基 因 最 多 其 次 是 細(xì) 胞 過 程 再 次 是 多 細(xì) 胞 生 物 過 程 在 細(xì) 胞 組 分 中 富 集 的 基 因 都 與 細(xì) 胞 和 細(xì) 胞 膜 組 分 相 關(guān) 在 分 子 功 能 中 富 集 的 基 因 大 多 都 具 有 催 化 活 性 和 結(jié) 合 功 能 還 有一些具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性 圖2 圖1 感染沃爾巴克氏體和未感染黑腹果蠅頭部 基因表達(dá)比較的火山圖 Fig 1 Volcanoplotshowingcomparisonofgeneexpressions betweentheheadsofWolbachia infectedanduninfected Drosophilamelanogaster6 期 陳夢(mèng)巖等 沃爾巴克氏體感染對(duì)黑腹果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組的影響 1425 圖2 感染沃爾巴克氏體和未感染黑腹果蠅頭部差異表達(dá)基因的GO 功能注釋分析 Fig 2 GOanalysisofdifferentiallyexpressedgenesintheheadsofWolbachia infectedanduninfectedDrosophilamelanogaster 2 3 感 染wMel 和 未 感 染 果 蠅 差 異 表 達(dá) 基 因KEGG 分 析 KEGG 通 路 分 析 顯 示 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和未感染黑腹果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因顯著富 集 到 多 個(gè) 通 路 上 富 集 程 度 最 高 的20 個(gè) 通 路 中 蛋 白 消 化 與 吸 收 通 路 包 含 的 差 異 表 達(dá) 基 因 最 多 此 外 還 發(fā) 現(xiàn) 一 些 差 異 表 達(dá) 基 因 涉 及 內(nèi) 分 泌 神 經(jīng) 活 性 配 體 受 體 互 作 激 素 合 成 淀 粉 和 糖 代 謝 以 及 氨 基 酸 代謝等通路 圖3 圖3 感染沃爾巴克氏體和未感染黑腹果蠅頭部差異表達(dá)基因富集程度最高的20 個(gè)KEGG 通路 Fig 3 The20mostenrichedKEGGpathwaysbasedonthedifferentiallyexpressedgenesintheheadsofWolbachia infected anduninfectedDrosophilamelanogaster1426 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 2 4 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的qPCR 驗(yàn)證 為 了 驗(yàn) 證 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 結(jié) 果 的 準(zhǔn) 確 性 篩 選 了11 個(gè) 差 異 表 達(dá) 倍 數(shù) 較 大 或 且 可 能 與 神 經(jīng) 行 為 相 關(guān) 的 基 因 表2 采 用qPCR 方 法 進(jìn) 行 進(jìn) 一 步 驗(yàn) 證 結(jié) 果 顯 示 除 了CG42643 和CG32475 之 外 其 余9 個(gè) 差 異 表 達(dá) 基 因 的 變 化 趨 勢(shì) 與RNA 測(cè) 序 結(jié) 果 一 致 其 中 CG13794 CG13321 CG2977 和 CG30473 這 4 個(gè) 基 因 在 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 黑 腹 果 蠅 頭 部 顯 著 上 調(diào) 表 達(dá) CG13794 基 因 表 達(dá) 水 平 上 調(diào) 最 多 約 是 未 感 染 黑 腹 果 蠅 的15 倍 而CG5017 CG42643 CG13524 CG32475 CG33508 crebB 和rut 這7 個(gè) 基 因 在 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 黑 腹 果 蠅 頭 部 顯 著 下 調(diào)表達(dá) 圖4 表2 基于RNA 測(cè)序結(jié)果選擇用于qPCR 驗(yàn)證的感染沃爾巴克氏體和未感染黑腹果蠅頭部的差異表達(dá)基因 Table2 DifferentiallyexpressedgenesselectedforqPCRvalidationbasedonRNAsequencingintheheads ofWolbachia infectedanduninfectedDrosophilamelanogaster 選擇依據(jù) Selectioncriterion 差異倍數(shù)大且可能與神經(jīng)行為相關(guān) Largedifferencesinexpressionand possiblyrelatedtoneurobehavior 可能與神經(jīng)行為相關(guān) Possiblyrelatedtoneurobehavior 與學(xué)習(xí)記憶相關(guān) Relatedtolearningandmemory 基因 Gene CG13794 CG13321 CG2977 CG33508 CG32475 CG30473 CG42643 CG13524 crebB rut CG5017 差異倍數(shù) Foldchange 4 25 3 24 2 39 0 14 1 79 1 63 1 45 0 46 0 84 0 98 0 55 生物功能 Biologicalfunction 神經(jīng)遞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性 Neurotransmittertransmembranetransporteractivity 神經(jīng)遞質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性Ganglionmothercell 神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元Gliaandneuron 鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Sodiumiontransmembranetransport G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路 Gprotein coupledreceptorsignalingpathway 氣味結(jié)合蛋白51aOdorant bindingprotein51a 離子型受體75b Ionotropicreceptor75b 氣味結(jié)合蛋白58cOdorant bindingprotein58c 環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白B Cyclic AMPresponseelementbindingproteinB 膜結(jié)合Ca 2 鈣調(diào)蛋白激活的腺苷酸環(huán)化酶 Membrane boundCa 2 calmodulin activatedadenylylcyclase thatisresponsibleforsynthesisofcAMP Nap 家族的核小體組裝因子 與長(zhǎng)期記憶形成有關(guān) Nucleosome assembly factor of the Nap family involved in long termmemoryformation 差 異 表 達(dá) 倍 數(shù) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體 黑 腹 果 蠅 中 基 因 表 達(dá) 水 平 未 感 染 黑 腹 果 蠅 中 基 因 表 達(dá) 水 平 Foldchange expression levelinWolbachia infectedDrosophilamelanogaster expressionlevelinuninfectedD melanogaster 圖4 感染沃爾巴克氏體和未感染黑腹果蠅頭部RNA 測(cè)序中差異表達(dá)基因的qPCR 驗(yàn)證結(jié)果 Fig 4 ResultsofqPCRvalidationofdifferentiallyexpressedgenesidentifiedbyRNAsequencingintheheadsofWolbachia infectedanduninfectedDrosophilamelanogaster 圖 中 數(shù) 據(jù) 為 平 均 數(shù) 標(biāo) 準(zhǔn) 誤 和 分 別 表 示 經(jīng)t 檢 驗(yàn) 法 檢 驗(yàn) 在P 0 05 P 0 01 和P 0 001 水 平 差 異 顯 著 Data are mean SE or indicatessignificantdifferenceatP 0 05 P 0 01orP 0 001levelbyttest respectively 3 討論 目 前 關(guān) 于 沃 爾 巴 克 氏 體 對(duì) 宿 主 影 響 的 研 究 主 要 集 中 在 其 介 導(dǎo) 宿 主 繁 殖 的 調(diào) 控 機(jī) 制 如 引 起 昆 蟲 宿 主 產(chǎn) 生 精 卵 細(xì) 胞 質(zhì) 不 親 和 Beckmannetal 2019 Biwotetal 2020 沃 爾 巴 克 氏 體 也 可 以 通 過 多 種 方 式 對(duì) 宿 主 的 免 疫 產(chǎn) 生 影 響 抑 制 宿 主 體 內(nèi) 病 原 生 物 如 病 毒 的 增 殖 Hedgesetal 2008 Gongetal 6 期 陳夢(mèng)巖等 沃爾巴克氏體感染對(duì)黑腹果蠅頭部轉(zhuǎn)錄組的影響 1427 2020 因此已經(jīng)被用于媒介昆蟲如蚊蟲的生物防治 Zheng et al 2019 并 可 望 被 用 于 農(nóng) 業(yè) 害 蟲 的 防 治 然 而 沃 爾 巴 克 氏 體 不 僅 存 在 于 宿 主 的 生 殖 系 統(tǒng) 中 而 且 也 廣 泛 存 在 于 宿 主 的 神 經(jīng) 系 統(tǒng) 中 Albert son et al 2013 Pietri et al 2016 因 此 有 可 能 對(duì) 宿 主 的 神 經(jīng) 行 為 也 產(chǎn) 生 影 響 本 課 題 組 前 期 研 究 發(fā) 現(xiàn) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和wRi 品 系 均 能 顯 著 提 高 其 自 然 宿 主 黑 腹 果 蠅 和 擬 果 蠅D simulans 的 學(xué) 習(xí) 記 憶 能 力 Bi et al 2019 已 有 研 究 表 明 沃 爾 巴 克 氏 體 能 廣 泛 影 響 宿 主 基 因 的 表 達(dá) He et al 2019 Douetal 2021 為 了 探 索 沃 爾 巴 克 氏 體 提 高 果 蠅 學(xué) 習(xí) 記 憶 能 力 的 分 子 機(jī) 制 本 研 究 對(duì) 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 和 未 感 染 黑 腹 果 蠅 頭 部 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 鑒 定 出679 個(gè) 差 異 表 達(dá) 基 因 進(jìn) 一 步 支 持 沃 爾 巴 克 氏 體 改 變 宿 主 基 因 表 達(dá) 的 能 力 另 外 還 篩 選 了 11 個(gè) 差 異 表 達(dá) 基 因 進(jìn) 行qPCR 驗(yàn) 證 發(fā) 現(xiàn)CG13794 基 因 在 感 染 沃 爾 巴 克 氏 體wMel 黑 腹 果 蠅 頭 部 上 調(diào) 15 倍 CG13794 基 因 屬 于 鈉 氯 依 賴 性 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白SLC 溶 質(zhì) 載 體 家 族 6 家 族 的 一 個(gè) 亞 家 族 具 有 傳 遞 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 活 性 作 用 Romero Calder net al 2007 但 目 前 還 沒 有 關(guān) 于CG13794 基 因 在 果 蠅神經(jīng)行為方面的功能研究報(bào)道 由于神經(jīng)行為的 形 成 離 不 開 興 奮 的 傳 遞 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 傳 遞 以 及 突 觸 的 形 成 因 此 推 測(cè) 沃 爾 巴 克 氏 體 感 染 可 能 會(huì) 增 強(qiáng) 果 蠅 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 的 傳 遞 從 而 增 強(qiáng) 果 蠅 的 學(xué) 習(xí) 記 憶 能 力 或 其 他 行 為 后 續(xù) 將 購 買 或 構(gòu) 建CG13794 基 因 敲 降 或過表達(dá)果蠅以進(jìn)一步研究該基因在神經(jīng)行為發(fā)育 過程中的功能 本 課 題 組 前 期 研 究 顯 示 感 染wRi 品 系 的 擬 果 蠅嗅覺反應(yīng)顯著增高 表現(xiàn)為尋找食物的時(shí)間縮短 對(duì) 氣 味 更 敏 感 同 時(shí) 其 體 內(nèi) 嗅 覺 受 體 基 因or83b 的 表達(dá)水平在嗅覺反應(yīng)快的果蠅中顯著高于嗅覺反應(yīng) 慢 的 果 蠅 表 明 沃 爾 巴 克 氏 體 可 能 通 過 調(diào) 節(jié) 宿 主 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 從 而 提 高 了 宿 主 的 嗅 覺 反 應(yīng) 能 力 Peng Wang 2009 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 編 碼 氣 味 結(jié) 合 蛋 白51a odorant binding protein 51a Obp51a 的 CG30473 基 因 在 感 染wMel 的 黑 腹 果 蠅 頭 部 也 呈 顯 著上調(diào)表達(dá) 推測(cè)沃爾巴克氏體可能通過調(diào)節(jié)宿主 嗅覺相關(guān)基因的表達(dá) 從而提高其嗅覺反應(yīng)能力 因 而也在糖獎(jiǎng)勵(lì)的嗅覺學(xué)習(xí)記憶檢測(cè)過程中表現(xiàn)為學(xué) 習(xí)記憶能力的提高 Bietal 2019 creb B 基 因 編 碼 環(huán) 磷 酸 腺 苷 cyclic adenosine monophosphate cAMP 反 應(yīng) 元 件 結(jié) 合 蛋 白B 該 蛋 白 在 記 憶 形 成 中 起 關(guān) 鍵 作 用 對(duì) 突 觸 可 塑 性 具 有 重 要 意 義 在 進(jìn) 化 上 非 常 保 守 Zhangetal 2015 rut 基 因 編 碼 鈣 鈣 調(diào) 蛋 白 依 賴 性 腺 苷 酸 環(huán) 化 酶 并 與 果 蠅 的 記 憶 形 成 有 關(guān) Kacsohetal 2015 本 研 究 通 過RNA 測(cè) 序 和qPCR 分 析 都 發(fā) 現(xiàn) 這2 個(gè) 基 因 的 表 達(dá) 水 平 在 感 染wMel 的 黑 腹 果 蠅 頭 部 顯 著 下 調(diào) 表 達(dá) 此 外 編 碼 另 一 種 嗅 覺 結(jié) 合 蛋 白Obp58c 的CG13524 基 因 也 在 感 染wMel 黑 腹 果 蠅 頭 部 顯 著 下 調(diào) 表 達(dá) 推 測(cè) 這3 個(gè) 基 因 在 沃 爾 巴 克 氏 體 介 導(dǎo) 的 果 蠅 神 經(jīng) 行 為 反 應(yīng) 改 變 過 程 中 發(fā) 揮 著 特 定 作 用 但 具 體 作 用 及 其介導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索 感染沃爾巴克氏體的許多宿主都是農(nóng)業(yè)害蟲和 媒 介 昆 蟲 已 有 研 究 表 明 可 以 利 用 沃 爾 巴 克 氏 體 來 防 治 害 蟲 如 褐 飛 虱Nilaparvata lugens Gong et al 2020 該 蟲 是 水 稻 的 主 要 害 蟲 之 一 既 能 直 接 刺 吸 植 株 導(dǎo) 致 水 稻 倒 伏 也 能 傳 播 水 稻 病 毒 嚴(yán) 重 為害水稻等農(nóng)作物生產(chǎn) 采用胚胎顯微注射技術(shù)將 沃 爾 巴 克 氏 體 的wStri 品 系 轉(zhuǎn) 入 褐 飛 虱 發(fā) 現(xiàn) 感 染 wStri 的褐 飛虱 表現(xiàn) 出很 強(qiáng)的CI 表型 如果 在野 外釋 放 感 染 雄 性 與 野 外 未 感 染 雌 性 交 配 后 胚 胎 不 能 發(fā) 育 則 可 降 低 害 蟲 的 數(shù) 量 另 一 方 面wStri 還 可 以 顯 著 抑 制 褐 飛 虱 體 內(nèi) 的 水 稻 矮 縮 病 毒 ricedwarfvirus RDV Gong et al 2020 該 研 究 可 為 農(nóng) 業(yè) 害 蟲 的 生 物 防 治 提 供 一 個(gè) 新 的 環(huán) 境 友 好 型 策 略 此 外 利 用 沃 爾 巴 克 氏 體 控 制 蚊 蟲 的 研 究 已 經(jīng) 轉(zhuǎn) 入 應(yīng) 用 階 段 在 澳 大 利 亞 Bourtzis et al 2014 Rohde et al 2019 美 國(guó) Mains et al 2019 意 大 利 Caputo et al 2020 法 屬 波 利 尼 西 亞 Bourtzis et al 2014 越 南 以 及 中 國(guó) 限 于 廣 東 省 廣 州 市 Bourtzisetal 2014 Zheng et al 2019 已 經(jīng) 批 準(zhǔn) 田 間 釋 放 攜 帶 沃 爾 巴 克 氏 體 的 蚊 蟲 用 于 消 滅 登 革 熱 病 等 蚊 媒 病 Caputo et al 2020 田 間 試 驗(yàn) 表 明 這 種 方 法 可 顯 著 降 低 當(dāng) 地 蚊 蟲 的 數(shù) 量 Mainsetal 2019 有 效 控 制 了 如 登 革 熱 等 蚊 媒 病 的 發(fā) 生 Zheng et al 2019 因 此 本 研 究 具 有 重 要 的 生 態(tài) 學(xué) 意 義 和 潛 在 的 應(yīng) 用 價(jià) 值 不 僅 可 為 更 好 地 了 解 胞 內(nèi) 共 生 菌 與 宿 主 相 互 作 用 的 機(jī) 制 研 究 提 供 基 礎(chǔ) 也 可 為 害 蟲 的 生 物防治研究提供新的思路 參 考 文 獻(xiàn) References Albertson R Tan V Leads RR Reyes M Sullivan W Casper Lindley C 2013 Mapping Wolbachia distributions in the adult Dro sophilabrain CellularMicrobiology 15 9 1527 1544 Beckmann JF Bonneau M Chen HL Hochstrasser M Poinsot D Mer ot H Weill M Sicard M Charlat S 2019 The toxin antidote model of cytoplasmic incompatibility genetics and evo 1428 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 48 卷 lutionaryimplications TrendsinGenetics 35 3 175 185 Bi J WangYF 2020 The effect of the endosymbiont Wolbachia on the behaviorofinsecthosts InsectScience 27 5 846 858 BiJ ZhengY WangRF AiH HaynesPR BrownlieJC YuXQ Wang YF 2019 Wolbachiainfectionmayimprovelearningandmemory capacity of Drosophila by altering host gene expression through miRNA InsectBiochemistryandMolecularBiology 106 47 54 Biwot JC Zhang HB Liu C Qiao JX Yu XQ Wang YF 2020 Wolbachia induced expression of Kenny gene in testes affects male fertility in Drosophila melanogaster Insect Science 27 5 869 882 Bourtzis K Dobson SL Xi ZY Rasgon JL Calvitti M Moreira LA Bossin HC Moretti R Baton LA Hughes GL et al 2014 Har nessing mosquito Wolbachia symbiosis for vector and disease control ActaTropica 132 S 150 163 Bulman CA Chappell L Gunderson E Vogel I Beerntsen B Slatko BE Sullivan W Sakanari JA 2021 The eagle effect in the Wolbachia wormsymbiosis Parasites Vectors 14 1 118 Caputo B Moretti R Manica M Serini P Lampazzi E Bonanni M FabbriG PichlerV dellaTorreA CalvittiM 2020 Abacterium against the