第 37 卷 第 10 期 2021 年 10 月 科 技 通 報 BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Vol 37 No 10 Oct 2021 水楊酸誘導草莓葉片灰霉病抗性機理的研究 賈 思 振 謝浩舉 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學 院 農(nóng)學園藝學院 江蘇 句容 212400 摘 要 為探索水楊酸 SA 對草莓灰霉病防治的作用 利用 0 1 2 4 mmol L 1 SA 溶 液 噴灑處理 紅顏 草莓葉片 3 d 后取下葉片 接種灰葡萄孢菌 檢測草莓葉片發(fā)病指數(shù) 抗性相關酶活性和基因相對表達量 結果表明 SA 處 理能夠提高草莓葉片灰霉病的抗病能力 SA 濃度越高效果越明顯 4 mmol L 1 SA 處理時病斑直徑為最小 為 6 2 mm SA 處理也能夠提高抗性相關酶的活性和基因的相對表達量 4 mmol L 1 SA 處理 第 3 天時幾丁質(zhì)酶活性達到 了 2 5 U mg 1 min 1 是 對 照的 1 56 倍 null 1 3 葡聚糖酶的活性在 5 d 時達到了最高值 達到了 74 U mg 1 protein 比 第 1 天 增加了 3 08 倍 是對照的 1 45 倍 水楊酸處理后 抗病先關基因的相對表達量也有相似的變化 提高了 草莓葉片 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull1 基因的相對表達量 關鍵詞 水楊酸 草莓 灰霉病 抗病性 中圖分類號 S432 文獻標識碼 A 文章編號 1001 7119 2021 10 0019 05 DOI 10 13774 j cnki kjtb 2021 10 004 收 稿 日期 2021 02 24 基金項目 2018 年高校 青藍工程 優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)對象 江蘇省青藍工程基金 江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 草莓 產(chǎn)業(yè)技術 體系 JATS 2020 339 作者簡介 賈思振 1982 男 山東濟南人 碩士研究生 副教授 主要從事草莓抗病機制研究 E mail 93327862 qq com nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnull null nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull null null null nullnullnull nullnullnullnull School of Agronomy and Horticulture Jiangsu Vocational College Agriculture and Forestry Jurong Jiangsu 212400 China nullnullnullnullnullnull In order to investigate the effect of salicylic acid SA on the control of strawberry grey mold the leaves of Hongyan strawberry were sprayed with 0 1 2 and 4 mmol L 1 SA solution After 3 days the leaves were taken off and inoculated with Botrytis cinerea The incidence index reactant related enzyme activities and relative gene expression levels of strawberry leaves were detected The results showed that SA treatment could improve the resistance of strawberry leaf grey mould and the higher the SA concentration the more obvious the effect was The spot diameter of 4mmol L 1 SA treatment was the smallest which was 6 2mm SA treatment also increased the activities of resistance related enzymes and the relative expression of genes The chitinase activity reached 2 5 U mg 1 min 1 at the 3rd day after 4mmol L 1 SA treatment which was 1 56 times that of the control The activity of null 1 3 glucanase reached the peak value on day 5 reaching 74 U mg 1 protein which was 3 08 times higher than that on day 1 and 1 45 times higher than that of control After treatment with salicylic acid the relative expression levels of resistance pregenes also changed similarly and the relative expression levels of nullnull null nullnullnull nullnull 1 were increased nullnullnullnullnullnull salicylic acid strawberry grey mould disease resistance 20 科 技 通 報 第 37 卷 草莓 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull 是一種兼具營養(yǎng) 和觀賞價值的水果 具有結果早 周期短 見效快的優(yōu) 點 目前草莓的栽培多采用設施栽培 但設施空間封 閉 通風透氣性差 病害發(fā)生嚴重 其中灰霉病是影響 草莓產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一 灰霉病由灰葡萄 孢菌 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 引起 在草莓采收前和采收后 都容易發(fā)病 病株率達 20 30 嚴重時可達 90 以上 給草莓生產(chǎn)種植業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失 1 3 目 前 灰霉病的防治主要方法 有農(nóng)業(yè)防治 化學防治 生物學防治等 而無論以那種方法進行灰霉病防治 都需要耗費大量的人力和物力 4 而 且 灰霉病菌能 夠在植物殘體中潛伏很長時間 導致人工防治效果不 佳 殺菌劑的長期使用也會引起耐藥性 另外 農(nóng)藥 殘留對環(huán)境的污染也日益加重 直接威脅著人類的健 康 因此 深入解析草莓對灰霉病的抗病以及調(diào)控機 制 對防治草莓灰霉病有重要的意義 水楊酸 salicylic acid SA 是植物體內(nèi)含量較低 的一種內(nèi)源酚類物質(zhì) 與植物局部抗性和系統(tǒng)獲得 性抗性的形成密切相關 植物受病原菌侵染后都會 大量積累 SA 外源 SA 處理可增強植物對病原物的 廣譜抗病性 SA 可誘導 ROS 爆發(fā) 調(diào)節(jié)抗氧化酶 的活性 提高植物抗性反應 SA 可通過抑制過氧化 氫酶 CAT 抗壞血酸氧化酶 APX 等活性氧降解 酶類的活性 使細胞內(nèi)積累適量 H 2 O 2 以提 高植物 抗性 Chen 等證明當 SA 存在時 CAT 活性被抑制 了近 80 H 2 O 2 含 量 顯著增加 激活依賴于氧化還 原的一類轉(zhuǎn)錄因子以及植物防衛(wèi)反應基因的表達 SA 在誘導水稻 黃瓜 番茄 棉花等提高抗病性的同 時 還會誘導苯丙氨酸解氨酶 幾丁質(zhì)酶和 null 1 3 葡聚糖酶等抗病性酶活性的提高 5 6 SA 在 植 物 體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑已經(jīng)清晰 植物體內(nèi) SA 首先 與 SA 結合蛋白結合形成 SA 2 SABP 復 合 體 復合 體將信息傳遞給胞內(nèi)第二信使如 H 2 O 2 等 信 號 通 過自我反饋機制放大后在胞內(nèi)轉(zhuǎn)導引發(fā)過敏反應 同時引起胞內(nèi)氧化還原態(tài)改變 激活抗病相關轉(zhuǎn)錄 因子 最終誘導抗病相關基因表達使植株產(chǎn)生抗 性 7 目前 SA 誘導的植株抗病信號轉(zhuǎn)導分子機 制 的研究主要集中在擬南芥 水稻等模式植物 在草莓 中的研究較少 null 材料 和方法 null null 實 驗 材料 本實驗于 2016 年 9 月 2017 年 5 月在江蘇農(nóng) 林職業(yè)技術學院實訓基地進行 試驗所用草莓品種 為 紅顏 供試灰葡萄孢菌 nullnull null null nullnullnull nullnull 由鎮(zhèn) 江市農(nóng)科院惠贈 病菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培 養(yǎng)基 PDA null null nullnull 在草莓抗灰霉病中的作用機制 1 2 1 灰霉病病原菌的培養(yǎng) 將供試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 PDA 上 20 黑暗條件下培養(yǎng) 14 d 后備用 1 2 2 灰霉病接種草莓處理 2016 年 2 月 挑選生長健壯 無病蟲害 長勢 一致植株的第 3 片完整葉片 噴灑 0 1 2 4 mmol L 1 SA 溶 液 直 到滴水為宜 每 24 h 處理 1 次 每 個葉片共處理 2 次 每個處理 10 個重復 3 d 后 將葉片取下 帶回實驗室接種灰霉病菌 處理前將 試驗用具在酒精燈灼燒滅菌后 用接種針在葉片 主脈附近扎 2 個小孔 并用打孔器在灰霉病菌培 養(yǎng)基上打孔 后用挑針挑取覆蓋在葉片小孔上 每個處理以空白培養(yǎng)基做對照 將處理過的葉片 放入培養(yǎng)皿中 下鋪無菌濕潤濾紙保濕 放入 25 培養(yǎng) 光照時間 12 h 每天觀察草莓葉片的變化 并拍照 處理 5 d 后 取樣置于液氮中保存 進行抗 性相關指標測定 1 2 3 抗性相關酶活性測定 多酚氧化酶 PPO 活性檢測參見參照余朝閣 2007 的試驗方法進行 null 1 3 葡聚糖酶 null 1 3 glucanase 和幾丁質(zhì) 酶 chitinase 活性測定 取 0 5 g 葉片加 5 mL 0 1 mol L 1 的 乙 酸 乙酸鈉緩沖液研磨 4 條件下 10000 r min 離心 10 min 提取粗酶液 在波長 585 nm 處比色測定 N 乙酰葡萄糖胺量 以每秒分解膠 狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1 10 9 mol N 乙酰葡萄糖胺量為一 個 酶 活力單位 U 單位為 U mg 1 protein null 1 3 葡 聚 糖酶活性利用 DNS 試劑測定以生成還原糖的 量來表示 單位為 U mg 1 protein 1 2 4 抗性相關基因表達測定 灰 霉 病處理后 記錄草莓果實病情指數(shù)變化 根據(jù) SGN 和 NCBI 上已公布的草莓病程相關蛋白 1 nullnull 1 null 1 3 葡聚糖酶基因 nullnullnull 幾丁質(zhì) 酶基因 nullnull null 基因片段的序列設計引物 采用 Real time PCR 儀進行抗病基因和水楊酸應答基因 表達量及草莓果實處理前后的基因表達差異 Real time 反應體系 3 nullg 總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 100 nullL cDNA 草莓 Actin 基因用做內(nèi)參 反應程序如下 總 體系為 20 nullL 包括 10 nullL SYBR Premix Ex Taq 第 10 期 賈 思振等 水楊酸誘導草莓葉片灰霉病抗性機理的研究 21 TaKaRa 0 4 nullL 上游 引物 10 nullm 0 4 nullL 下游 引物 10 nullm 和 2 nullL cDNA 混合物放置于 Bio Rad iQ 熒光定量 PCR 儀中反應 95 循環(huán) 2 min 94 變性 20 s 56 復性 20 s 72 延伸 30 s 共 40 個循環(huán) 從 60 到 95 每隔 0 5 溶解 30 s 共 71 個循環(huán) 表 null 相關基因引物設計 Table 1 Primer design of related genes 基因 名稱 引物序列 nullnullnull F 5 ACT CCG AAG AGA CCA AAT GGA G 3 R5 GGCTGT TTG GGG GAG AAG A 3 nullnull null F 5 TCG ATC TTT CAA TGG GTT TGG 3 R 5 CAG TGG TTT CGT GAG AGG TTTG 3 nullnull 1 F 5 TCACATTATGGCGACTGCAAC 3 R 5 TCTCTCCCACCCACAGGTTC 3 圖 null 不同濃度水楊酸處理對草莓葉片灰霉病的影響 Fig 1 Effects of different concentrations of salicylic acid on grey mould in strawberry leaves null 結 果 與分析 null null 不同濃度水楊酸對草莓葉片灰霉病的影響 由 圖 1 可 以看出 接種灰霉病菌后 草莓葉片隨 著處理時間的延長發(fā)病情況逐漸加重 第 5 d 時達 到最大值 病斑直徑達到了 18 3 mm 水楊酸處理 后葉片的發(fā)病狀況得到明顯抑制 1 mmol L 1 SA 處 理 時 病斑直徑與對照相比沒有明顯減弱 隨著 SA 濃度的增加 病斑直徑逐漸變小 其中 4 mmol L 1 SA 處 理 時最明顯 病斑直徑為 6 2 mm 表 null 不同濃度水楊酸處理草莓葉片病斑直徑 Table 2 Diameter of strawberry leaf spots treated with different concentrations of salicylic acid SA 濃 度 CK 1 mmol L 1 2 mmol L 1 4 mmol L 1 病斑 直徑 mm 18 3 20 5 12 7 6 2 null null nullnull 對草莓葉片抗病相關酶活性的影響 如 圖 2 所 示 SA 處理提高了草莓葉片幾丁質(zhì) 酶 null 1 3 葡聚糖酶和多酚氧化酶活性 SA 處理 后 幾丁質(zhì)酶的活性逐漸提高 在第 3 天達到最大 隨著處理時間的延長 幾丁質(zhì)酶的活性逐漸減弱 但 是高濃度的 SA 處理下 幾丁質(zhì)酶的活性也高于對 照 其中 4 mmol L 1 SA 處 理 活性最高 在第 3 天時 達到了 2 5 U mg 1 min 1 比 第 1 天 增加了 2 33 倍 是對照的 1 56 倍 SA 處理后 null 1 3 葡聚糖 酶的活性逐漸提高 在第 5 天時達到了最高值 4 mmol L 1 SA 處理的葉片仍然處于最高值 達 到 了 74 U mg 1 protein 比第 1 天 增加了 3 08 倍 是對照 的 1 45 倍 多酚氧化酶的活性變化趨勢與幾丁質(zhì) 酶相似 在處理的第 3 天時達到了最大值 后逐漸降 低 其中在第 5 天時降低 但是 SA 處理的葉片多酚 氧化酶的活性仍然高于對照 null null nullnull 對草莓葉片抗病相關基因表達的調(diào)控 作用 由圖 3 所示 SA 處理的草莓葉片均提高了草莓 葉片病程相關蛋白 nullnull 1 幾丁質(zhì)酶 nullnull null 和 22 科 技 通 報 第 37 卷 圖 null 不同濃度水楊酸處理對草莓葉片 抗病相關酶活性的影響 Fig 2 Effects of different concentrations of salicylic acid treatment on activities of disease resistance related enzymes in strawberry leaves null 1 3 葡 聚 糖酶 nullnullnull 基因的相對表達量 變化 趨勢相似 接種灰霉病后 在第 2 天時各處理 nullnull1 基因相對表達量都增加了 2 倍以上 SA 處理顯著提 高了 nullnull 1 基因的相對表達量 其中 4 mmol L 1 SA 處理的表達量是對照的 7 54 倍 隨著 處理時間的延 長 nullnull 1 基因的相對表達量逐漸降低 第 5 天時達 到了最低值 幾丁質(zhì)酶基因的相對表達量變化也有 相似趨勢 但是基因相對表達量變化較小 2 mmol L 1 SA 和 4 mmol L 1 SA 處理具有相似效果 兩 者 之 間差異不顯著 在處理第 2 天時 4 mmol L 1 SA 處 理 的 nullnull null 基因的相對表達量是對照的 1 78 倍 nullnullnull 的變化趨勢與 nullnull 1 的變化相似 SA 處理 后 nullnullnull 的變化較大 處理第 3 天 4 mmol L 1 SA 處理的相對表達量是對照的 5 85 倍 后 對 照處理時 間的延長 nullnullnull 相對表達量逐漸降低 但仍然維 持著較高的水平 null 討 論 研 究 表明 水楊酸與抗病性具有一定關系 植物 圖 null 不同濃度水楊酸處理對草莓葉片抗 病相關基因相對表達量的影響 Fig 3 Effects of different concentrations of salicylic acid treatment on relative expression levels of disease resistance related genes in strawberry leaves 受到病原菌侵染后都會大 量 積累 SA SA 誘導許多 病程相關蛋白的表達 對病原菌侵染的抗性也相應 增加 8 外 源 SA 可 增強番茄處理葉及其上位非處 理葉抗灰霉病能力 提高苯丙氨酸解氨酶 PAL 過 氧化物酶 POD 和 PPO 等防御酶活性 PPO 在植 物抗病過程中起重要作用 Jia 等通過過表達草莓的 nullnull null 1 基因 推遲了真菌的侵染過程 并且導致病 原菌相關 PAL 過氧化物歧化酶 SOD POD 幾丁 質(zhì)酶基因的上調(diào)表達 9 PPO 抗病機制主要是參 與植物的次生代謝 產(chǎn)生一些毒性物質(zhì) 直 接 毒殺病 原菌 如 O 醌等 10 真菌病害的大多數(shù)絲狀真 菌在生長過程中 菌絲頂端同時合成幾丁質(zhì)和 null 1 3 葡 聚 糖 交聯(lián)形成幾丁質(zhì) 葡聚糖或其他多糖 菌 絲頂端暴露的幾丁質(zhì)鏈會被幾丁質(zhì)酶和 null 1 3 葡 聚糖酶所水解 11 因 此 幾 丁質(zhì)酶和 null 1 3 葡聚 糖酶被認為是植物真菌病害防御的關鍵酶 它們在 抗菌 抑菌中起著重要作用 甚至能夠直接殺死真 菌 李琳琳 12 等 研究番茄抗灰霉病時發(fā)現(xiàn) SA 能 夠 提高番茄幼苗抗灰霉病能力 SA 處理誘導了幾丁 第 10 期 賈 思振等 水楊酸誘導草莓葉片灰霉病抗性機理的研究 23 質(zhì)酶 及 null 1 3 葡聚糖酶等抗性相關酶活性的提 高 本研究結果表明 草莓葉片受到灰霉病的侵染 后 PPO CHI GLU 這 3 種酶的活性都急劇上升 這 說明體內(nèi)抗病系統(tǒng)得到了誘導 抗病相關酶的被激 活 活性增強 我們通過檢測處理后葉片的相關基 因表達量時發(fā)現(xiàn) 灰霉病處理后 nullnull 1 nullnull null 和 nullnullnull 3 個基因的表達量迅速升高 也說明了灰霉 病侵染后植物抗病系統(tǒng)得到了激活 酶活性顯著提 高 水楊酸處理的草莓葉片 nullnull null nullnullnull 基因相 對表達量明顯的高于對照 并且隨著濃度的增加活 性增加比較明顯 在處理第 3 d 4 mmol L 1 SA 處 理 的葉片相對表達 量達到最大值 隨著受侵染時間的 延長 這些基因的表達量下降 這可能由于時間延 長 植物受傷害的程度變大 導致整個葉片受到了嚴 重的傷害 但是 SA 處理的葉片仍然高于對照 說明 SA 能夠提高草莓葉片的抗灰霉病能力 這些表明 SA 誘導的抗病性促進抗病相關酶及基因表達 綜上所述 外源施用 SA 影響草莓葉片抗氧化 酶系統(tǒng) 促進了抗病相關基因的表達 增加抗氧化酶 活性 激活了草莓抗灰霉病的防御途徑 降低了草莓 葉片灰霉病的病情指數(shù) 提高了抗病相關酶活性及 其基因表達水平 參考文獻 1 Williamson B Tudzynski B Tudzynski P nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull the cause of grey mould disease Mol Plant Pathol 2007 8 561 580 2 Dean R Van Kan JA Pretorius ZA nullnull nullnullnull The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology Mol Plant Pothol 2012 13 414 443 3 Lewers KS Luo YG Vinyard BT Evaluating strawberry breeding selections for postharvest fruit decay Euphytica 2012 186 539 555 4 肖 長 坤 高葦 夏冰 等 設施栽培草莓灰霉病發(fā)生 規(guī)律及其綜合防治 中國植保導刊 2012 32 24 26 5 張智慧 聶燕芳 何磊 等 外源水楊酸誘導水稻相關 防御酶活性及內(nèi)源水楊酸含量的變化 J 華中農(nóng)業(yè) 大學學報 2010 29 5 541 545 6 陳貴 華 張少英 外源 SA 對甜菜幼苗細胞壁 HRGP 和木質(zhì)素含量的影響 J 作物雜志 2012 2 36 38 7 Yan S Dong X Perception of the plant immune signal salicylic acid Current Opinion in Plant Biology 2014 20 64 68 8 丁 麗 娜 楊國興 植物抗病機制及信號轉(zhuǎn)導的研究進 展 J 生物技術通報 2016 32 10 109 117 9 Jia H F Zhao P C Wang B J nullnull nullnull Overexpres sion of polyphenol oxidase gene in strawberry fruit delays the fungus infection process Plant Mol Biol Rep 2016 34 3 592 606 10 代 麗 宮 長榮 史霖 等 植物多酚氧化酶研究綜述 J 植物生理科學 2017 23 6 312 317 11 許 夢 秋 鐘增明 龔琰 等 幾丁質(zhì)酶在植物病害生物 防治中的應用 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2010 5 122 123 12 李琳琳 李天來 姜國斌 等 外源 Ca 2 對 水 楊酸誘導 番茄抗灰霉病的增效機制 J 應用生態(tài)學報 2015 26 11 3497 3502