園藝學(xué)報(bào) 2016 43 1 89 99 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2015 0584 http www ahs ac cn 89 江蘇省番茄黃化曲葉病毒和褪綠病毒復(fù)合侵染 的分子檢測(cè) 吳淑華 1 李廷芳 1 趙文浩 1 程兆榜 1 郭青云 4 趙統(tǒng)敏 2 余文貴 2 朱葉芹 3 季英華 1 1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地 南京 210014 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 南京 210014 3 江蘇省植物保護(hù)站 南京 210036 4 青海省農(nóng)林科學(xué)院植 物保護(hù)研究所 西寧 810016 摘 要 2014 年對(duì)江蘇地區(qū)的番茄黃化曲葉病進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn) 采自南京溫室大棚的 17份表現(xiàn)矮化 上部葉片上卷 變小 葉緣黃化 下部葉片脈間褪綠 上卷 變厚癥狀的番茄病株樣本中除了感染煙粉 虱傳雙生病毒外 還有一種長(zhǎng)線形病毒 序列分析結(jié)果顯示煙粉虱傳雙生病毒為番茄黃化曲葉病毒 To m a t o yellow leaf curl virus TYLCV 長(zhǎng)線形病毒為番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus ToCV 同時(shí)還對(duì) 發(fā)病棚室中采集的煙粉虱進(jìn)行了兩種病毒的檢測(cè) 結(jié)果兩種病毒在煙粉虱體內(nèi)都有檢測(cè)到 關(guān)鍵詞 番茄黃化曲葉病毒 番茄褪綠病毒 復(fù)合侵染 分子檢測(cè) 中圖分類號(hào) S 641 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2016 01 0089 11 Molecular Identification on Mixed Infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on Tomato in Jiangsu Province WU Shu hua 1 LI Ting fang 1 ZHAO Wen hao 1 CHENG Zhao bang 1 GUO Qing yun 4 ZHAO Tong min 2 YU Wen gui 2 ZHU Ye qin 3 and JI Ying hua 1 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province State Key Laboratory Breeding Base Nanjing 210014 China 2 Institute of Vegetable Crops Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 China 3 Jiangsu Station of Plant Protection Nanjing 210036 China 4 Institute of Plant Protection Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences Xining 810016 China Abstract In 2014 a routine survey of tomato yellow leaf curl disease in Jiangsu Province was carried out Besides whitefly transmitted geminiviruses a whitefly transmitted crinivirus was also detected in 17 tomato samples collected from Nanjing with symptoms of reduced leaf size or leaf curling and yellowing in the upper leaves and interveinal chlorosis and upward rolling and thickening in the lower leaves Sequence analysis showed that the whitefly transmitted geminivirus was an isolate of Tomato yellow leaf curl virus TYLCV and the whitefly transmitted crinivirus was an isolate of Tomato chlorosis virus ToCV The two viruses were also detected in Bemisia tabaci collected from the greenhouses Key words Tomato yellow leaf curl virus Tomato chlorosis virus mixed infection molecular detection 收稿日期 2015 10 30 修回日期 2016 01 08 基金項(xiàng)目 國(guó)家公益性行業(yè) 農(nóng)業(yè) 專項(xiàng) 201303028 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目 CX 12 1004 江蘇省 333高層次人才 培養(yǎng)工程科研項(xiàng)目 BRA2013262 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 31572074 通信作者 Author for correspondence E mail zyq jiyinghua Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 90 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 番茄黃化曲葉病毒病是番茄上由雜食性介體煙粉虱 Bemisia tabaci Gennadius 傳播的雙生病 毒 whitefly transmitted geminiviruses WTGs 引發(fā)的一種毀滅性病害 Harrison Robinson 1999 該類病毒隸屬于雙生病毒科 Geminiviridae 菜豆金色花葉病毒屬 Begomovirus 具有孿生顆粒 形態(tài)的單鏈環(huán)狀 DNA 病毒 Fauquet et al 2005 其引起的病害最早于 1939 年在以色列被發(fā)現(xiàn) Cohen Harpaz 1964 隨著雙生病毒在全世界范圍內(nèi)的蔓延 其對(duì)番茄的危害也日益加重 現(xiàn) 已擴(kuò)散到中東 地中海沿岸 非洲 歐洲 美洲 亞洲以及澳大利亞等眾多國(guó)家和地區(qū) Cohen Antignus 1994 Czosnek Laterrot 1997 Polston et al 1999 Accotto et al 2000 2003 Moriones Navas Castillo 2000 Polston et al 2002 Ueda et al 2005 20世紀(jì) 90 年代后 中國(guó)番茄上粉 虱傳雙生病毒在廣西 廣東 云南 江蘇 上海 浙江 安徽 山東 河南 河北 北京 天津 四 川 陜西 吉林 新疆等 10 余個(gè)省市發(fā)生 阮濤 等 2013 田鵬 等 2013 王祥 等 2014 給 當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)造成了巨大的損失 番茄褪綠病毒病是番茄上另一種由煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus ToCV 引發(fā)的嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的病害 該病毒為長(zhǎng)線型病毒科 Closteroviridae 毛形病毒屬 Crinivirus 二分體正義單鏈 RNA ssRNA 病毒 King et al 2011 20 世紀(jì) 90 年代 ToCV 在美國(guó)佛羅里 達(dá)州發(fā)現(xiàn)危害 Wisler et al 1998 給當(dāng)?shù)氐姆焉a(chǎn)造成了慘重的損失 目前 ToCV 至少在世界 20個(gè)國(guó)家和地區(qū)有分布 Bese et al 2011 Fiallo Oliv et al 2011 Navas Castillo et al 2011 Arruabarrena et al 2014 在中國(guó) ToCV 最早于 1998年在臺(tái)灣就有發(fā)生報(bào)道 Tsai et al 2004 近年來(lái)在北京 Zhao et al 2013 2014b 南京 Karwitha et al 2014 和山東 Zhao et al 2014a 等地陸續(xù)出現(xiàn) ToCV 發(fā)生危害 其中在山東省已造成的危害比較大 劉永光 等 2014 2014 年 11 月上旬在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田示范日光溫室大棚進(jìn)行常規(guī)粉虱傳雙生病毒導(dǎo)致 的番茄病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)一些棚室番茄黃化曲葉病癥狀比較嚴(yán)重 表現(xiàn)與以往有所不同 同時(shí)發(fā)病棚 內(nèi)有大量煙粉虱聚集在番茄葉片上 針對(duì)這些癥狀較重的番茄病樣 對(duì)一些可能的粉虱傳病毒進(jìn)行 了分子檢測(cè)與鑒定 發(fā)現(xiàn)這些病樣中不僅含有粉虱傳 DNA病毒 TYLCV 而且還含有一種粉虱傳 RNA病毒 ToCV 同時(shí)在介體煙粉虱體內(nèi)檢測(cè)到了這兩類病毒 暗示了這兩種病毒極有可能已經(jīng) 擴(kuò)散蔓延 生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注 1 材料與方法 1 1 材料 17份番茄病樣和若干煙粉虱樣品于 2014年 11月上旬采自江蘇南京江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研 究所日光溫室大棚 健康對(duì)照為防蟲(chóng)溫室培育的健康番茄葉片 所有樣品均保存于 80 冰箱中備用 RNA 提取試劑 酶 克隆載體及菌株 Trizol Reagent 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimerScript TM RT Master Mix LA Ta q 酶和克隆載體 pMD 18T購(gòu)自大連寶生生物公 司 TaKaRa Axygen DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司 大腸桿菌 DH5 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司 1 2 引物合成 合成煙粉虱傳雙生病毒簡(jiǎn)并引物 PA P B Deng et al 1994 擴(kuò)增雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白 保守區(qū)域 目的片段約 500 bp 用于粉虱傳雙生病毒引起的番茄黃化曲葉病病原檢測(cè) PA 5 TAA 吳淑華 李廷芳 趙文浩 程兆榜 郭青云 趙統(tǒng)敏 余文貴 朱葉芹 季英華 江蘇省番茄黃化曲葉病毒和褪綠病毒復(fù)合侵染的分子檢測(cè) 園藝學(xué)報(bào) 2016 43 1 89 99 91 TATTACGKGWKGVCCSC 3 PB 5 TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA 3 合成番茄褪綠病毒特異 引物 TOHsp1F TOHsp1R Louro et al 2000 擴(kuò)增該病毒 HSP70 熱激蛋白保守區(qū)域 目的片段約 440 bp 用于粉虱傳番茄褪綠病毒引起的番茄褪綠病毒病的病原檢測(cè) TOHsp1F 5 GCTTCCGAAA CTCCGTCTTG 3 TOHsp1R 5 TGTCCAAAGTACCGCCACC 3 所有引物均委托英濰捷 上海 貿(mào)易有限公司合成 1 3 番茄病樣總DNA提取和PCR擴(kuò)增 番茄病樣總 DNA提取采用 CTAB 法 Harrison et al 1997a 20 保存?zhèn)溆?以健康番茄 葉片總 DNA作為陰性對(duì)照 PCR 反應(yīng)體系為 在 25 L 反應(yīng)體系中 加入 10 buffer 2 5 L MgCl 2 25 mmol L 1 1 5 L dNTP 各 2 5 mmol L 1 2 0 L DNA 1 0 L PA P B 引物各 1 0 L ddH 2 O 15 8 L LA Ta q 酶 0 2 L PCR 擴(kuò)增條件為 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 45 s 55 退火 45 s 72 延伸 50 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增結(jié)束后 取 5 L PCR 產(chǎn)物于 1 0 瓊脂糖 凝膠電泳中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 并用培清 JS 680D全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果 1 4 番茄病樣總RNA提取和RT PCR擴(kuò)增 番茄總 RNA的提取 取 0 05 0 1 g 病葉置于已滅菌的 2 mL進(jìn)口離心管中 加液氮迅速充分 研磨成粉狀 加入 1 mL Trizol Reagent混合 室溫放置 5 min 加 200 L氯仿 異戊醇 24 1 手 搖劇烈振蕩 15 s 室溫放置 2 3 min 后 4 12 000 r min 1 離心 15 min 取上清液至 1 5 mL 離 心管中 加等體積的冰異丙醇 顛倒混勻 20 冰箱放置 20 min以上 4 12 000 r min 1 離 心 10 min 后棄上清液 用 l mL 75 乙醇 0 1 DEPC 水配制 洗沉淀 2 次 每次洗滌后 4 5 000 r min 1 離心 5 min 棄上清液 超凈臺(tái)中風(fēng)干 將 RNA溶于 35 L 0 1 DEPC 水中 檢測(cè) RNA的 含量和質(zhì)量后 20 保存?zhèn)溆?同時(shí)提取健康番茄葉片總 RNA作為陰性對(duì)照 cDNA 合成 以提純總 RNA為模板 用 PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成病毒的 cDNA第 1條鏈 番茄 RT 反應(yīng)體系 在 10 L反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入 5 PrimeScript TM RT Master Mix buffer 2 0 L 加入含 500 ng 體積的 RNA 用 RNase Free ddH 2 O 補(bǔ)足到 10 L 輕輕混合 37 15 min 85 5 s 反應(yīng)結(jié)束后 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于 20 冰箱中保存?zhèn)溆?PCR 擴(kuò)增體系 25 L 10 緩沖液 2 5 L MgCl 2 1 5 L dNTP 2 0 L cDNA產(chǎn)物 1 0 L TOHsp1F TOHsp1R 引物各 1 0 L ddH 2 O 15 8 L LA Ta q 酶 0 2 L PCR 擴(kuò)增條件為 95 預(yù)變性 5 min 95 變性 45 s 53 退火 45 s 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增結(jié)束后 取 5 0 L PCR 產(chǎn)物 于 1 0 瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 并用培清 JS 680D全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果 1 5 煙粉虱總DNA 總RNA提取和PCR RT PCR擴(kuò)增 采用氯仿 異戊醇法提取單頭煙粉虱總 DNA 周志湘 等 2007 20 保存 用于 PCR 擴(kuò) 增 煙粉虱總 RNA的提取采用 Trizol 法 李潔 等 2015 略作改動(dòng) 即用無(wú)菌牙簽挑取 10 頭煙 粉虱于已滅菌的 2 mL進(jìn)口離心管中 液氮充分研磨后 加入 1 mL Trizol Reagent混合 室溫放置 10 min 其他步驟相同 提取煙粉虱總 RNA 20 保存 用于 RT PCR 擴(kuò)增 1 6 PCR產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1 瓊脂糖凝膠電泳 由 Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化 回收產(chǎn)物連 接 pMD18 T 載體 熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 挑選陽(yáng)性克隆 進(jìn)行序列測(cè)定 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 92 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 1 7 序列分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 序列測(cè)定委托南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成 測(cè)序結(jié)果利用軟件 DNAStar 進(jìn)行拼 接及序列同源性分析 序列多重比對(duì) 聚類分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用 MEGA6 軟件的鄰近法 Neighbor joining 完成 進(jìn)化樹(shù)的可信度使用 1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證 本研究中所涉及的菜豆金色花葉病毒屬序列信息見(jiàn)表 1 毛形病毒屬序列信息見(jiàn)表 2 表 1 本試驗(yàn)中所涉及的菜豆金色花葉病毒屬病毒序列信息 Table 1 Information of Begomovirus mentioned in this paper 病毒 Virus 序列號(hào) Accession No 中國(guó)木瓜曲葉病毒 Papaya leaf curl China virus PaLCuCNV EU874386 中國(guó)番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl China virus ToLCCNV AJ558118 廣東番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl Guangdong virus ToLCGdV AY602165 廣西番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl Guangxi virus ToLCGxV AM236784 海南番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl Hainan virus ToLCHaiV KF150142 臺(tái)灣番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl Taiwan virus ToLCTV JQ867093 番茄曲葉病毒 Tomato leaf curl virus ToLCV S53251 阿薩爾基亞番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl Axarquia virus TYLCAxV AY227892 中國(guó)番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl China virus TYLCCNV AJ319675 馬拉加番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl Malaga virus TYLCMaV AF271234 撒丁島番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl Sardinia virus TYLCSV X61153 中國(guó)上海番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Shanghai China Shangai 2005 TYLCV Sha AM282874 中國(guó)江蘇番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Jiangsu China Jiangsu 2007 TYLCV JS GU111505 伊朗布什爾番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Boushehr Iran Genaveh 29 2006 TYLCV Bou GU076454 伊朗沙赫爾番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Iran Iran Iranshahr 1998 TYLCV IR AJ132711 伊朗凱諾番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Kahnooj Iran Kahnooj 2007 TYLCV Kah EU635776 伊朗科曼番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Kerman Iran Hormozgan 32 2006 TYLCV Ker GU076442 以色列米爾德番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Mild Israel 1993 TYLCV Mld X76319 阿曼番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus Oman Oman Al batinah 22 2005 TYLCV OM FJ956700 云南番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl Yunnan virus TYLCYnV KC686705 表 2 本試驗(yàn)中所涉及的毛形病毒屬序列信息 Table 2 Information of Crinivirus mentioned in this paper 病毒 Virus 序列號(hào) Accession No 分離物 Isolate 國(guó)家 Country 番茄褪綠病毒 Tomato chlorosis virus ToCV KJ815045 南京 Nanjing 中國(guó) China AY903448 佛羅里達(dá) Florida 美國(guó) America DQ136146 AT80 99 西班牙 Spain KP114533 JJ3 韓國(guó) Korea KP114528 YG 韓國(guó) Korea KP114525 IS17 韓國(guó) Korea KC887999 北京 Beijing 中國(guó) China KP137099 HS 韓國(guó) Korea JQ952601 Br2 巴西 Brazil KP114537 HP 韓國(guó) Korea KP114536 JN1 韓國(guó) Korea KC709510 山東壽光 Shouguang Shandong 中國(guó) China KP114534 JJ5 韓國(guó) Korea KP114529 IS29 韓國(guó) Korea EU284744 Gr 535 希臘 Greece KP137101 JJ 韓國(guó) Korea KJ740257 AT80 99 IC 西班牙 Spain 番茄侵染性褪綠病毒 Tomato infectious chlorosis virus TICV FJ815441 CA 美國(guó) America 蠶豆黃癥病毒 Bean yellow disorder virus BnYDV EU191905 Bn 03 西班牙 Spain 甜菜偽黃化病毒 Beet pseudo yellows virus BPYV AY330919 Maryland 美國(guó) America 黑莓黃化病毒 Blackberry yellow vein associated virus BYVaV AY776335 South Carolina 美國(guó) America 葫蘆黃色矮化失調(diào)病毒 Cucurbit yellow stunting disorder virus CYSDVAJ439690 Spain 西班牙 Spain 萵苣褪綠病毒 Lettuce chlorosis virus LCV FJ380119 California 美國(guó) America 萵苣侵染性黃化病毒 Lettuce infectious yellows virus LIYV U15441 California 92 美國(guó) America 草莓灰白癥相關(guān)病毒 Strawberry pallidosis associated virus SpaV AY488138 M1 美國(guó) America 甘薯萎黃矮縮病毒 Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV AJ428555 EA Uganda 烏干達(dá) Uganda吳淑華 李廷芳 趙文浩 程兆榜 郭青云 趙統(tǒng)敏 余文貴 朱葉芹 季英華 江蘇省番茄黃化曲葉病毒和褪綠病毒復(fù)合侵染的分子檢測(cè) 園藝學(xué)報(bào) 2016 43 1 89 99 93 2 結(jié)果與分析 2 1 田間病株癥狀 圖 1 病樣的田間癥狀 Fig 1 Symptoms of the virus infected tomato 棚中番茄病株表現(xiàn)整株矮縮 坐果很少 上部葉片黃化 變小 葉緣上卷 增厚皺縮 下部葉片類似營(yíng)養(yǎng)失調(diào)的缺素癥狀 葉脈間褪 綠黃化 葉片變厚 葉緣上卷 老葉脈間壞死 變脆易碎 圖 1 該病癥狀較之前報(bào)道的由 TYLCV 導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病癥狀重 但二 者也很難區(qū)分 在調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)病重的棚室里 番茄葉片常常聚集大量的煙粉虱 因此對(duì)一些 番茄上常見(jiàn)的粉虱傳病毒進(jìn)行了檢測(cè) 2 2 番茄病樣中病毒檢測(cè) 2 2 1 粉虱傳雙生病毒的分子檢測(cè)和序列分析 以田間采集的 17份番茄樣品總 DNA為模 板 利用粉虱傳雙生病毒的簡(jiǎn)并引物 PA P B 進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增 所有番茄樣品均擴(kuò)增到 1 條約 500 bp 大小的條帶 圖 2 A 初步證明番茄病樣均 含有粉虱傳雙生病毒 隨機(jī)抽選番茄樣品 N14t 2 N14t 13 和 N14t 15 圖 2 A 中相應(yīng)的 2 13 和 15 進(jìn)行目的片段回收 克隆和測(cè)序 DNAstar 軟件分析結(jié)果顯示目的片段均由 541 個(gè)堿基組成 分離物間序列同源性高達(dá) 99 1 以上 BLAST分析結(jié)果顯示克隆序列與番茄黃化曲葉病毒的同源性 最高 99 聚類分析結(jié)果也顯示 克隆到的 3 個(gè)分離物都聚類到 TYLCV 分支中 與之前報(bào)道 的江蘇分離物 XH2 有較近的親緣關(guān)系 圖 3 暗示了番茄樣品中檢測(cè)到的粉虱傳病毒為 TYLCV 2 2 2 粉虱 傳長(zhǎng)線形病 毒的分子檢 測(cè)和序列分 析 以田間采集的 17份番茄樣品總 RNA為模板進(jìn)行 RT PCR擴(kuò)增 結(jié)果顯示 引物 TOHsp1F TOHsp1R 從所有番茄樣品中均擴(kuò)增到 1 條約 440 bp大小的條帶 圖 2 B 同樣抽選番茄樣品 N14t 2 N14t 13 和 N14t 15 與粉虱傳雙生病毒抽樣一致 進(jìn)行目的條帶回收 克隆和序列測(cè)序 DNAstar軟件分析 結(jié)果顯示目的片段均由 439個(gè)堿基組成 分離物間序列同源性高達(dá) 99 3 以上 BLAST 分析結(jié)果顯 示克隆序列與番茄褪綠病毒的同源性最高 99 對(duì)其進(jìn)行聚類分析結(jié)果也顯示 克隆到的 3 個(gè) 分離物都聚類到 ToCV 的分支中 圖 4 暗示了番茄樣品中檢測(cè)到的粉虱傳 RNA病毒為 ToCV 圖 2 番茄樣品中粉虱傳雙生病毒的 PCR 檢測(cè) A 和長(zhǎng)線形病毒的 RT PCR 檢測(cè) B M 3 Marker CK 陰性對(duì)照 1 17 番茄病樣 N14t 1 N14t 17 Fig 2 PCR detection of virus by whitefly transmitted Geminiviruses A and RT PCR detection of Crinivirus B in diseased tomato plants M 3 Marker CK Negative control 1 17 Tomato samples N14t 1 N14t 17 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 94 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 圖 3 根據(jù)病毒核苷酸序列一致性重建的雙生病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 各支上的數(shù)字是 1 000次 bootstrap 自導(dǎo)復(fù)制的置信度 從番茄樣品中擴(kuò)增的序列 從煙粉虱中擴(kuò)增的序列 Fig 3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Geminiviruses The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively Sequence amplified from tomato Sequence amplified from whitefly 圖 4 根據(jù)病毒核苷酸序列一致性重建的毛形病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 各支上的數(shù)字是 1 000次 bootstrap 自導(dǎo)復(fù)制的置信度 從番茄樣品中擴(kuò)增的序列 從煙粉虱中擴(kuò)增的序列 Fig 4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Crinivirus The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively Sequence amplified from tomato Sequence amplified from whitefly 吳淑華 李廷芳 趙文浩 程兆榜 郭青云 趙統(tǒng)敏 余文貴 朱葉芹 季英華 江蘇省番茄黃化曲葉病毒和褪綠病毒復(fù)合侵染的分子檢測(cè) 園藝學(xué)報(bào) 2016 43 1 89 99 95 2 3 煙粉虱中病毒檢測(cè) 2 3 1 雙生 病毒的分子 檢測(cè)和序列 分析 從田間發(fā)病棚室采集的煙粉虱群體中隨機(jī)抽樣 40頭 氯仿 異戊醇法提取單頭煙粉虱的總 DNA 做模板 利用粉虱傳雙生病毒簡(jiǎn)并引物 PA P B 對(duì)煙粉虱體內(nèi)雙生病毒進(jìn)行 PCR 檢測(cè) 部分樣品的 檢測(cè)結(jié)果顯示有 12 頭煙粉虱樣品擴(kuò)增到 1 條約 500 bp 大小的條帶 圖 5 隨機(jī)抽選煙粉虱樣品 N14wD 5 N14wD 7 和 N14wD 15 圖 5 中相應(yīng)的 5 7 和 15 的 PCR 產(chǎn)物目的片段進(jìn)行回收 克 隆和測(cè)序 DNAstar 軟件分析結(jié)果表明目的片段均由 541 個(gè)堿基組成 分離物間序列同源性高達(dá) 98 3 以上 BLAST 分析結(jié)果顯示克隆序列與番茄黃化曲葉病毒的同源性最高 99 對(duì)其進(jìn)行 聚類分析結(jié)果也顯示 克隆到的 3 個(gè)分離物都聚類到 TYLCV 的分支中 與之前報(bào)道的江蘇分離物 XH2 有較近的親緣關(guān)系 圖 3 暗示了煙粉虱樣品中檢測(cè)到的粉虱傳病毒為 TYLCV 圖 5 煙粉虱體內(nèi)雙生病毒的 PCR 檢測(cè) 單頭 M 3 Marker CK 陰性對(duì)照 1 15 煙粉虱樣品 N14wD 1 N14wD 15 Fig 5 PCR detection of Geminiviruses in whitefly 1 whitelfy sample M 3 Marker CK Negative control 1 15 Whitefly samples N14wD 1 N14wD 15 2 3 2 長(zhǎng)線 形病毒的分 子檢測(cè)和序 列分析 由于單頭煙粉虱 RNA提取存在困難 選擇從田間發(fā)病棚室采集的煙粉虱群體里隨機(jī)選取 10 頭 煙粉虱作為一份樣本 共取 15 份樣本分別提取總 RNA 進(jìn)行 RT PCR 擴(kuò)增 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示 用特異引物 TOHsp1F TOHsp1R 均能從 15份樣品中擴(kuò)增到一條約 440 bp 大小的條帶 圖 6 隨機(jī) 抽選樣品 N14wR 2 N14wR 9 和 N14wR 14 圖 6 中相應(yīng)的 2 9 和 14 的 PCR產(chǎn)物目的片段進(jìn)行 回收 克隆和測(cè)序 DNAstar軟件分析結(jié)果表明目的片段均由 439個(gè)堿基組成 分離物間序列同源 性高達(dá) 99 5 以上 BLAST 分析結(jié)果顯示克隆序列與番茄褪綠病毒的同源性最高 99 對(duì)其進(jìn) 行聚類分析結(jié)果也顯示 克隆到的 3 個(gè)分離物都聚類到 ToCV 的分支中 圖 4 暗示了煙粉虱樣品 中檢測(cè)到的粉虱傳 RNA病毒為 ToCV 圖 6 煙粉虱體內(nèi)番茄褪綠病毒的 RT PCR 檢測(cè) 10 頭 樣 M 3 Marker CK 陰性對(duì)照 1 15 煙粉虱樣品 N14wR 1 N14wR 15 Fig 6 RT PCR detection of ToCV in whitefly 10 whiteflies sample M 3 Marker CK Negative control 1 15 Whitefly samples N14wR 1 N14wR 15 3 討論 鑒于番茄黃化曲葉病毒病的危害 本實(shí)驗(yàn)室自 2007年來(lái)一直關(guān)注該病的發(fā)生及病原種群動(dòng)態(tài) 雖然中國(guó)番茄黃化曲葉病的病原有多種 主要是粉虱傳雙生病毒 如番茄黃化曲葉病毒 中國(guó)番木 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 96 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 瓜曲葉病毒 中國(guó)臺(tái)灣番茄曲葉病毒等 而在江蘇 導(dǎo)致番茄黃化曲葉病毒的粉虱傳雙生病毒則主 要是番茄黃化曲葉病毒 之前未見(jiàn)到其他病毒侵染番茄導(dǎo)致番茄黃化曲葉病的報(bào)道 季英華 等 2008 本研究的結(jié)果表明 2014 年底從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室大棚采集自然發(fā)病 的番茄黃化曲葉病樣中檢測(cè)到粉虱傳病毒有兩種 TYLCV和 ToCV 該結(jié)果暗示了南京地區(qū)發(fā)生的 這種新的番茄黃化曲葉病可能是由兩種病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致 而 TYLCV 和 ToCV 復(fù)合侵染番茄危害 在江蘇尚屬首次報(bào)道 ToCV 是一種煙粉虱傳 RNA病毒 近年來(lái)該病毒在中國(guó)山東 河北 北京和天津等省市發(fā)生 尤其在山東呈爆發(fā)之勢(shì) 已給當(dāng)?shù)胤焉a(chǎn)造成嚴(yán)重危害 經(jīng)濟(jì)損失慘重 劉永光 等 2014 周濤 等 2014 江蘇于 2014 年出現(xiàn) ToCV 本氏煙 報(bào)道 Karwitha et al 2014 生產(chǎn)上尚未見(jiàn)到該 病危害報(bào)道 國(guó)外研究顯示 ToCV 可以與多種植物病毒發(fā)生復(fù)合侵染 如 Tomato spotted wilt virus TSWV Tomato torrado virus ToTV Pepino mosaic virus PMV 等 Garcia Cano et al 2006 Davino et al 2008 Alfaro Fernandez et al 2010 2006 2007年 Martinez Zubiaur 等 2008 在對(duì)古巴當(dāng)?shù)胤腰S化曲葉病調(diào)查時(shí)也發(fā)現(xiàn)存在 ToCV 和 TYLCV 復(fù)合侵染 本研究中對(duì)江蘇南 京采集的番茄病樣檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)這兩種病毒可以復(fù)合侵染番茄 同時(shí)煙粉虱群體中也可以檢測(cè)到 這兩種病毒 暗示了這兩種病毒可以同時(shí)存在煙粉虱群體中 并隨煙粉虱遷飛廣泛地傳播擴(kuò)散 造 成更大范圍的危害 因此生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注這種病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病 很多研究顯示多種病毒的復(fù)合侵染往往具有協(xié)生作用 有助于其突破寄主的抗性 導(dǎo)致新的病 害發(fā)生和流行 Rochow Ross 1955 Va n c e 1991 Harrison et al 1997b 2006 年 Garcia Cano 等 2006 在對(duì) ToCV 和 TSWV 研究時(shí)發(fā)現(xiàn) 二者存在協(xié)生作用 當(dāng) ToCV 與 TSWV 同時(shí)侵染含 有 Sw 5 的抗 TSWV番茄時(shí) ToCV 的侵染會(huì)導(dǎo)致寄主番茄對(duì) TSWV抗性喪失 近年來(lái)隨著番茄黃 化曲葉病在我國(guó)大面積發(fā)生危害 抗番茄黃化曲葉病的番茄品種也在大面積推廣應(yīng)用 并在病害的 防控上取得了較好的效果 趙統(tǒng)敏 等 2011 晉萍 等 2013 但是 TYLCV 的抗性品種對(duì) ToCV 的抗性表現(xiàn)目前尚不明確 而 ToCV 與 TYLCV 的復(fù)合侵染是否也可