園藝學報 2016 43 1 71 79 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2015 0893 http www ahs ac cn 71 番茄抗黃化曲葉病基因在不同溫度下對TYLCV 復(fù)制的影響 李佳蔚 林 銘 胡 鴻 王孝宣 國艷梅 黃澤軍 杜永臣 高建昌 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 北京 100081 摘 要 采用番茄黃化曲葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus TYLCV 侵染克隆接種技術(shù)和實時 熒光定量 PCR 方法 從 TYLCV 在番茄葉片內(nèi)復(fù)制繁殖的角度 系統(tǒng)研究了不同環(huán)境溫度下單個和多個 抗性基因疊加對病毒復(fù)制的影響 以期為合理進行抗病基因整合 選育抗 TYLCV的番茄新品種提供理論 指導 結(jié)果顯示 1 春季溫室栽培環(huán)境下 含 Ty 1 Ty 3 的番茄材料能抑制病毒復(fù)制 接種后 28 d 其體 內(nèi)病毒含量僅是感病材料病毒含量的千分之一 秋季溫室栽培環(huán)境下 這種抑制作用降低 病毒含量與 感病材料相當 精確控溫種植的含 Ty 1 Ty 3 的近等基因系番茄材料中病毒的含量變化趨勢與此相同 2 含 Ty 2 的番茄材料在春秋兩季栽培環(huán)境下 均表現(xiàn)出對病毒復(fù)制的抑制作用 接種后 28 d 其體內(nèi) 病毒含量僅為感病材料病毒含量的萬分之一 3 同時含有 2 個基因 Ty 1 和 Ty 2 和多個基因 Ty 1 Ty 2 和 Ty 3 的番茄材料在抑制病毒復(fù)制方面不存在累加效應(yīng) 關(guān)鍵詞 番茄 番茄黃化曲葉病毒 熒光定量 PCR 中圖分類號 S 641 2 文獻標志碼 A 文章編號 0513 353X 2016 01 0071 09 The Combined Effects of Different TYLCV Resistant Genes and Temperatures on TYLCV Duplication LI Jia wei LIN Ming HU Hong WANG Xiao xuan GUO Yan mei HUANG Ze jun DU Yong chen and GAO Jian chang Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China Abstract Tomato yellow leaf curl disease TYLCD has already been a major constraint to tomato production in China It is caused by Tomato yellow leaf curl virus TYLCV and several other begomoviruses These begomoviruses replicate their genome quickly in tomato plants after infection and transport to whole plant to result in disease Development of TYLCV resistance variety is economic and efficient way to control TYLCD To provide theoretical bases to the breeding for TYLCV resistance we detected the combined effects of different TYLCV resistance genes and temperatures on TYLCV replicate TYLCV in tomato lines with Ty 1 Ty 3 was one thousandth of that in susceptible tomato lines However after infiltration of infectious clone TYLCV IL CN SH2 using real time PCR TYLCV resistance genes 收稿日期 2015 12 07 修回日期 2016 01 04 基金項目 國家自然科學基金項目 31272160 國家 863 計劃項目 2012AA100100 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗 室項目 同等貢獻者 通信作者 Author for correspondence E mail gaojianchang Li Jia wei Lin Ming Hu Hong Wang Xiao xuan Guo Yan mei Huang Ze jun Du Yong chen Gao Jian chang The combined effects of different TYLCV resistant genes and temperatures on TYLCV duplication 72 Ac ta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 71 79 Ty 1 Ty 3 acted inhibitory effect on TYLCV replication in solar greenhouse in spring The amount of TYLCV in tomato lines with Ty 1 Ty 3 was one thousandth of that in susceptible tomato lines However the inhibition of Ty 1 Ty 3 on TYLCV replication was decreased in solar greenhouse in autumn The copy number of TYLCV in tomato materials with Ty 1 Ty 3 and susceptible tomato materials showed a similar trend of variation Similarly under temperature treatments Ty 1 Ty 3 inhibited sharply the replication of TYLCV at low temperature but not at high temperature In contrast to Ty 1 Ty 3 the inhibition of Ty 2 on the replication of TYLCV was more severe and stable The amounts of TYLCV in tomato lines with Ty 2 were one ten thousandth of that in susceptible tomato lines in solar greenhouse both in spring and in autumn Furthermore there were not addictive effect between the two genes Ty 1 and Ty 2 or among the three genes Ty 1 Ty 2 and Ty 3 Key words tomato TYLCV real time PCR 番茄黃化曲葉病 Tomato yellow leaf curl disease TYLCD 是番茄生產(chǎn)上的一種毀滅性病害 首先發(fā)現(xiàn)于以色列約旦河一帶 后在世界各地大面積爆發(fā) 近年來在中國危害日益嚴重 Antignus Cohen 1994 Boulton 2003 國艷梅 等 2009 該病由雙生病毒引起 在中國尤以番茄黃化曲 葉病毒 Tomato yellow leaf curl virus TYLCV 危害最甚 TYLCV 含有一個單鏈的環(huán)狀 DNA分子 其復(fù)制為滾環(huán)復(fù)制過程 Abhary et al 2007 Lefeuvre et al 2010 其轉(zhuǎn)錄為雙向轉(zhuǎn)錄 通過毒粒鏈和互補鏈共同編碼 6 個復(fù)合重疊的開放閱讀框 互補 鏈上有 4 個 ORF C1 C4 負責調(diào)控復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程 毒粒鏈上有 2 個 ORF V1 和 V2 涉及包 衣 移動和轉(zhuǎn)送 其中 C1編碼的復(fù)制相關(guān)蛋白可開啟病毒的滾環(huán)復(fù)制 Dasgupta et al 2004 Selth et al 2004 C2編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白可激活晚期基因表達 Sunter Bisaro 1991 1992 C3 編 碼的復(fù)制增強蛋白可通過與 C1 的互作來增強病毒的復(fù)制效率 Hanley Bowdoin et al 2000 V1 編碼外殼蛋白 同時可能是 RNA silencing途徑的抑制因子 Glick et al 2008 V2基因在病毒運 動和妨礙寄主的免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮作用 Selth et al 2006 同時 V2 與 C4編碼的蛋白產(chǎn)物被認 為均與病毒的致病性和病毒與宿主間互作有關(guān) Bar Ziv et al 2012 抗病育種是防治該病最為有效的措施 已知的抗病基因均來自野生番茄 其中 Ty 1 Ty 3 Ty 4 和 Ty 6 來自于不同的智利番茄 Solanum chiense Ty 2 來源于多毛番茄 Solanum habrochaites 而 ty 5 來源于秘魯番茄 Solanum peruvianum Zamir et al 1994 Hanson et al 2006 Ji et al 2007 2009 Anbinder et al 2009 Hutton et al 2012 Verlaan等 2011 克隆了 Ty 1 基因 該基因和 Ty 3 為等位基因 編碼一個 RNA依賴的 RNA聚合酶 RDR 通過參與病毒基因組胞嘧 啶甲基化過程發(fā)揮功能 Verlaan et al 2013 Butterbach et al 2014 Mej a等 2010 發(fā)現(xiàn) 在危地馬拉 Ty 2 雖然不具有對雙組分菜豆金色花葉病毒屬病毒的抗性 但其與 Ty 3 的疊加可以提 升 Ty 3 對這類病毒的抗性 Segev 等 2004 用含抗病基因 ty 5 的番茄材料 TY 172 進行研究后發(fā) 現(xiàn) ty 5 基因通過影響病毒的積累表現(xiàn)抗性 不影響病毒的長距離移動 上述抗性基因中 Ty 1 Ty 2 和 Ty 3 已成功應(yīng)用于番茄育種中 對防治 TYLCV起到關(guān)鍵作用 但因?qū)Σ煌虻目剐詸C制知之甚少 且所用的研究材料和技術(shù)手段不同 研究結(jié)果亦有矛盾之處 如在 Ty 1 對病毒的抑制作用上 Michelson等 1994 研究發(fā)現(xiàn)在高接種濃度下 Ty 1 基因通過抑制 病毒的長距離移動來發(fā)揮抗性 而 Verlaan 等 2013 研究發(fā)現(xiàn) Ty 1 或 Ty 3 通過 RNA 干擾使感染 TYLCV 的抗病植株中雖然病毒含量較高但不表現(xiàn)病癥 同時 還缺乏對多個抗性基因疊加的抗性李佳蔚 林 銘 胡 鴻 王孝宣 國艷梅 黃澤軍 杜永臣 高建昌 番茄抗黃化曲葉病基因在不同溫度下對 TYLCV復(fù)制的影響 園藝學報 2016 43 1 71 79 73 效果的研究 此外 生產(chǎn)中亦存在溫度對抗性基因抗性效果的影響 基于此 本研究中嘗試從抗性 基因影響病毒復(fù)制的角度 采用侵染性克隆接種和熒光定量檢測技術(shù)研究單個和多個基因疊加和溫 度對 TYLCV 復(fù)制的影響 以期明確不同抗性基因的抗性效果 探討其抗性機制 為抗病育種提供 理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 材料 試驗于 2012 年在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所實驗室和日光溫室中進行 選用 10種不同基 因型的番茄為供試材料 均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供 詳見表 1 表 1 供試材料 Table 1 Tomato materials used for this study 材料來源 Sources of material 編號 Code 番茄材料 Tomato material 抗性基因 Resistance gene 美國番茄遺傳資源中心 Tomato Genetics Resource Center No 1 Money Maker 無 No 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences No 2 桃太郎 Momotaro 無 No No 3 FLA505 Ty 1 亞洲蔬菜研究發(fā)展中心 Asian Vegetable Research and Development Center No 4 TY26 Ty 2 No 5 CLN3022F2 138 6 2 0 Ty 1 Ty 2 No 6 CLN3022F2 37 29 8 0 Ty 1 Ty 3 No 7 CLN3022F2 154 11 11 0 Ty 1 Ty 3 Ty 2 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 No 8 9706TS 無 No Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences No 9 9706TR Ty 1 Ty 3 病毒材料為含 TYLCV基因組的侵染克隆 浙江大學周雪平教授惠贈 以 TYLCV IL CN SH2 分離物的番茄樣品總 DNA為模板 獲得含有 1 4個重復(fù)的 SH2全長基因組的侵染性克隆 pBinPLUS SH2 1 4A 張輝 2009 1 2 材料的處理 1 2 1 溫室 栽培條件下 試驗材料的 處理 選用 No 1 No 7 番茄材料 表 1 作為研究春季和秋季溫室環(huán)境下番茄不同基因型對 TYLCV 復(fù)制影響的試驗材料 于 2012 年 2 月和 8 月各播種 1 次 種子經(jīng) 15 的次氯酸鈉溶液消毒 12 min 無菌水清洗 3 次 28 催芽 48 h 后 播于花盆中 整個試驗過程用 60 目紗網(wǎng)遮蓋以杜絕蚜蟲和煙 粉虱攜帶的外來病毒的干擾 每種番茄材料種植 72 株 其中 36 株接種病毒作為試驗組 余下 36 株不接種病毒作為對照組 幼苗長至 2 4片真葉時接種病毒 接種 24 h后每隔 7 d取樣 共取 6 次 每次每組各取 6 個單株 每株單獨編號 自番茄植株接種 TYLCV開始 用 Onset 公司的 HOBO U10 Temperature Relative Humidity Data Logger U10 003 每隔 30 min 記錄 1 次溫室內(nèi)溫度 4 次重復(fù) 統(tǒng)計每天的平均溫度 1 2 2 光照 培養(yǎng)箱條件 下試驗材料 的處理 為了更加系統(tǒng)地研究溫度對 TYLCV 復(fù)制的影響 排除外界環(huán)境溫度波動對試驗的影響 以近 等基因系 No 8 和 No 9 表 1 研究不同溫度下 Ty 1 Ty 3 對 TYLCV復(fù)制的影響 結(jié)合栽培實際設(shè) Li Jia wei Lin Ming Hu Hong Wang Xiao xuan Guo Yan mei Huang Ze jun Du Yong chen Gao Jian chang The combined effects of different TYLCV resistant genes and temperatures on TYLCV duplication 74 Ac ta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 71 79 置 3 個晝 夜溫度 低溫 23 20 常溫 28 25 和高溫 33 30 于 2012 年 6 月 播種 幼苗接種病毒后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中 每個處理每種番茄材料 20 株 其中 18 株接種 2 株不接 種 空白對照 接種 24 h 后每隔 7 d 取樣 共取 6 次 每次各取 3 株接種植株 單獨編號 為了研究溫度改變對 TYLCV復(fù)制的影響 以 No 8 和 No 9 為試驗材料 接種 28 d 后從低溫和 高溫處理的材料中各取 6 株接種植株進行互換 以后每隔 7 d 各取 3 株取樣 共取 2 次 1 3 幼苗接種處理 接種病毒選在幼苗 2 4 片真葉完全展開后進行 接種前 1 d 澆足水 培養(yǎng)侵染克隆 TYLCV IL CN SH2 的農(nóng)桿菌 當菌液在 600 nm波長處的吸光值達 0 6 0 8時進行注射接種 接 種時用去掉針頭的一次性注射器 1 mL 吸取菌液1 mL 將菌液緩慢注射在番茄葉片背面葉脈之 間的葉肉處 使植株充分吸收菌液 注射后適當澆水 整個試驗期間用 60目紗網(wǎng)遮蓋以杜絕外來病 毒的感染 林銘 等 2013 1 4 熒光定量PCR分析 用常規(guī) CTAB法 Mason et al 2008 提取植株樣品總 DNA 并稀釋至 100 ng L 1 采用林 銘等 2013 設(shè)計的 TYLCV 實時熒光定量 PCR 檢測方法 所用引物采用林銘等 2013 根據(jù) TYLCV IL CN SH2 的全基因組序列 AM282874 1 所設(shè)計的引物 該引物的擴增片段為基因 C2 中的一段序列 同時對含侵染克隆的農(nóng)桿菌菌液提取質(zhì)粒 作為標準樣品 對其以 10倍梯度稀釋進 行熒光定量 PCR 得到不同起始濃度的標準樣品與 Ct 值之間的關(guān)系 制備絕對定量標準曲線 Mason et al 2008 通過對未知樣品進行熒光定量 PCR 獲得其 Ct 值 根據(jù)標準曲線計算該樣品的起始拷 貝數(shù) 試驗數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2007進行計算和做圖 通過 SAS 9 2 軟件進行單因素方差分析及 鄧肯氏新復(fù)極差法檢測 P 0 05 2 結(jié)果與分析 2 1 溫室栽培條件下不同基因型番茄對TYLCV復(fù)制的影響 2 1 1 春季 和秋季溫室 內(nèi)的溫度變 化 溫室內(nèi)春季和秋季的溫度記錄 圖 1 顯示 整個試驗期間 春季最高溫度為 26 8 最低溫 圖 1 春季和秋季日平均溫度變化 Fig 1 The average of daily temperature in spring and autumn 李佳蔚 林 銘 胡 鴻 王孝宣 國艷梅 黃澤軍 杜永臣 高建昌 番茄抗黃化曲葉病基因在不同溫度下對 TYLCV復(fù)制的影響 園藝學報 2016 43 1 71 79 75 度為 13 6 平均溫度為 19 3 秋季最高溫度為 30 8 最低溫度為 21 71 平均溫度為 25 0 一直在 22 以上 該溫度趨勢與生產(chǎn)上基本吻合 2 1 2 春季 和秋季溫室 內(nèi)不同基因 型番茄植株 中 TYLCV 含量的變化 如圖 2 所示 春季接種病毒后 2 份不含抗 TYLCV 基因的 No 1 和 No 2 番茄植株中的病毒含 量持續(xù)增加 No 2 番茄植株中的病毒含量自接種后呈線性增加 到接種 28 d時已達到最大 每 100 ng 總 DNA中約含 1 10 9 個 TYLCV拷貝 No 1 番茄植株中的病毒含量接種后從 14 d 到 21 d增長 了約 100 倍 該病毒拷貝數(shù)維持到接種后 35 d 才又出現(xiàn)增加 至接種 42 d時與 No 2 持平 達到最 大值 5 份抗病番茄材料中有 4 份 No 3 No 4 No 5 和 No 7 盡管所含抗病基因的類型和數(shù)量不 同 但在整個試驗期間植株體內(nèi)的病毒含量均維持在起始接種時的較低水平 僅 No 6 Ty 1 Ty 3 番茄植株在接種 35 d 后病毒拷貝有了近 100 倍的增加 但仍顯著低于不含抗性基因的感病番茄中的 病毒拷貝數(shù) 即含 Ty 1 Ty 3 的番茄材料能抑制病毒復(fù)制 綜合分析 接種 28 d 時所有抗病番茄體 內(nèi)的病毒含量均顯著低于感病番茄 且在 No 3 No 4 No 5 和 No 7 抗病番茄體內(nèi)的病毒含量沒有 顯著差別 均維持在較低水平 即春季環(huán)境下單個基因和多個基因累加對病毒復(fù)制的抑制效果是一 致的 圖 2 春季不同基因型番茄植株中 TYLCV 含量變化 不同小寫字母表示同一時間不同試驗材料在 P 0 05 水平差異顯著 下同 Fig 2 Average TYLCV accumulation in tomato plants in the spring test Different small letters mean different materials at the same time had significant difference at P 0 05 level The same below 如圖 3 所示 在秋季試驗中 對不同基因型番茄植株接種病毒后 植株體內(nèi)病毒含量變化趨勢 可歸納為 3 類 第 1 類為不含抗病基因的 No 2 病毒含量在接種 14 d 后達到最高 每 100 ng 總 DNA 中約含有 1 10 9 的 TYLCV拷貝 之后維持該水平不變 第 2 類為不含抗病基因的 No 1 只含 Ty 1 的 No 3 和含有 Ty 1 Ty 3 的 No 6 病毒含量均在接種后 14 d 才開始迅速增加 接種 21 d后各自達 最大值 每 100 ng 總 DNA中的病毒拷貝數(shù)分別為 1 10 9 1 10 8 6 和 1 10 8 之后維持該水平不 變 其中只含 Ty 1 的 No 3 番茄材料與感病材料中的病毒含量無差異 含 Ty 1 Ty 3 的番茄材料中的 TYLCV 含量顯著低于感病番茄 第 3 類為均含有 Ty 2 的 No 4 No 5 和 No 7 整個試驗期間植株 中的病毒含量均保持在接種 7 d 后的水平 即每 100 ng 總 DNA中約含有 1 10 5 5 個病毒拷貝 比較 發(fā)現(xiàn) 秋季溫度較高的環(huán)境下 只含 Ty 1 的番茄材料和含 Ty 1 Ty 3 的番茄材料對病毒復(fù)制的抑制 作用均降低 而含有單個 Ty 2 以及同時聚合 Ty 1 Ty 3 的番茄材料對病毒復(fù)制的抑制作用強 即 Ty 2 對病毒復(fù)制的抑制作用顯著強于 Ty 1 Ty 3 同時 3 個基因間亦不存在加性效應(yīng) Li Jia wei Lin Ming Hu Hong Wang Xiao xuan Guo Yan mei Huang Ze jun Du Yong chen Gao Jian chang The combined effects of different TYLCV resistant genes and temperatures on TYLCV duplication 76 Ac ta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 71 79 圖 3 秋季各基因型番茄植株中 TYLCV含量變化 Fig 3 Average TYLCV accumulation in tomato plants in the autumn test 2 2 光照培養(yǎng)箱中溫度對TYLCV復(fù)制的影響 2 2 1 不同 溫度下 TYLCV 的復(fù)制情況 為了更加系統(tǒng)地研究環(huán)境溫度對 TYLCV 復(fù)制的影響 選用近等基因系 No 8 和 No 9 番茄為試 驗材料 研究不同溫度下 Ty 1 Ty 3 對病毒復(fù)制影響 在不含抗病基因的感病番茄材料 No 8 中 圖 4 常溫與高溫下 TYLCV 的復(fù)制趨勢類似 在 接種 7 d后病毒含量迅速增加 接病后 14 d達較高水平 每 100 ng 總 DNA中約含 1 10 8 5 個病毒 拷貝 而在低溫下病毒在接種14 d 后才開始增加 接種后21 d才達較高水平 可見低溫可以延緩 TYLCV 拷貝量增加 接種 28 d 后 TYLCV 在這 3 種溫度下的含量達一致 均為每 100 ng 總 DNA 中約含 1 10 9 個 TYLCV拷貝 圖 4 不同溫度下不含抗病基因的 No 8 番茄材料中 TYLCV 含量變化 Fig 4 Average TYLCV accumulation in the No 8 tomato plants with no resistance genes under different temperatures 在含 Ty 1 Ty 3 的 No 9 材料中 圖 5 常溫與高溫下 TYLCV的復(fù)制趨勢類似 在接種后 7 14 d 病毒含量顯著增加 從每 100 ng 總 DNA 中約含 1 10 6 個病毒拷貝增加到 1 10 8 個病毒拷貝 TYLCV 的拷貝數(shù)增加了近 100 倍 而低溫環(huán)境下 TYLCV 的含量一直維持在較低水平 每 100 ng 總 DNA 中約含 1 10 6 個病毒拷貝 含抗病基因 Ty 1 Ty 3 的番茄材料在低溫環(huán)境下對病毒的積累 有抑制作用 但隨著溫度的升高對病毒復(fù)制的抑制力下降 李佳蔚 林 銘 胡 鴻 王孝宣 國艷梅 黃澤軍 杜永臣 高建昌 番茄抗黃化曲葉病基因在不同溫度下對 TYLCV復(fù)制的影響 園藝學報 2016 43 1 71 79 77 圖 5 不同溫度下含抗性基因 Ty 1 Ty 3 的 No 9 番茄材料中 TYLCV含量變化 Fig 5 Average TYLCV accumulation in the No 9 tomato plants with Ty 1 Ty 3 under different temperatures 2 2 2 溫度 變化對 TYLCV 復(fù)制的影響 為了模擬田間環(huán)境溫度的變化 研究環(huán)境溫度改變對 TYLCV 復(fù)制的影響 將不含抗病基因的 No 8 和含 Ty 1 Ty 3 的 No 9 分別作了低溫轉(zhuǎn)高溫和高溫轉(zhuǎn)低溫的處理 圖 6 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在 接 種 28 d 后從低溫環(huán)境轉(zhuǎn)移到高溫環(huán)境 兩種番茄材料中的病毒含量均有所增加 尤其是 No 9 中的 TYLCV 拷貝數(shù)增加顯著 接種后 28 42 d 由每 100 ng 總 DNA中約含 1 10 6 個拷貝迅速增加到 1 10 8 5 個拷貝 而將 No 8 與 No 9 在接種 28 d后由高溫轉(zhuǎn)移到低溫環(huán)境 植株中的病毒含量仍保持在原有 水平 無顯著變化 比較發(fā)現(xiàn) 對于不含抗病基因的感病番茄 No 8 前期高溫導致病毒拷貝數(shù)增加 迅速 即使后期低溫也不能削弱病毒擴增的趨勢 而前期低溫能適當抑制病毒拷貝數(shù)的增加 后期 高溫病毒拷貝數(shù)雖仍持續(xù)增加 但整體上延緩了病毒在植株體內(nèi)的積累 對于含 Ty 1 Ty 3 的 No 9 番茄植株 前期低溫轉(zhuǎn)后期高溫 其抑制病毒復(fù)制的能力顯著強于前期高溫轉(zhuǎn)后期低溫的情況 圖 6 溫度改變對不含抗病基因的 No 8 和 No 9 番茄材料中 TYLCV 含量變化的影響 Fig 6 Average TYLCV accumulation in the No 8 and No 9 tomato plants with no resistance genes under temperatures changed 3 討論 目前從野生番茄中篩選到的抗 TYLCV 的基因主要有 Ty 1 Ty 2 Ty 3 Ty 4 Ty 5 和 Ty 6 而 有報道稱 含有這些抗病基因的番茄植株在接種病毒后均有低拷貝的病毒存在 這與典型的由 R 基 因介導的高敏反應(yīng)不同 Ty 基因表現(xiàn)出了更多的耐病性 Butterbach et al 2014 有研究表明 TYLCV 在抗病番茄植株中的含量低于感病番茄 Abdallat et al 2010 也有研究發(fā)現(xiàn) TYLCV 的含量在一 Li Jia wei Lin Ming Hu Hong Wang Xiao xuan Guo Yan mei Huang Ze jun Du Yong chen Gao Jian chang The combined effects of different TYLCV resistant genes and temperatures on TYLCV duplication 78 Ac ta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 71 79 些抗 感番茄植株間并無差異 張輝 2009 本試驗中研究了番茄不同基因型對 TYLCV 復(fù)制的影 響 結(jié)果表明 Ty 1 Ty 3 對病毒的積累存在一定的抑制作用 但隨著溫度升高這種抑制病毒積累 的作用降低 而含 Ty 2 的番茄材料體內(nèi) TYLCV的含量均維持在較低水平 不受溫度影響 Ty 2 基 因?qū)υ?TYLCV 株系的抑制作用顯著強于 Ty 1 Ty 3 并且在對該 TYLCV 株系的抑制方面 Ty 2 與 Ty 1 Ty 3 不存在加性效應(yīng) 為了培育出適合不同地區(qū)栽培的抗病新品種 應(yīng)對各抗病基因間的互作 做進一步的研究 研究還發(fā)現(xiàn) 在不含任何主效抗病基因的番茄植株中 TYLCV 的復(fù)制情況也不相同 可見除這 些主效基因外 番茄植株中可能還存在一些微效基因影響著 TYLCV 的復(fù)制 而且這些微效基因不 只作用于該 TYLCV 株系 將含這些微效基因的栽培種與含主效抗病基因的育種親本雜交 將垂直 抗性與水平抗性相結(jié)合或許會選育出適應(yīng)性更廣的番茄新品種 溫度和濕度等環(huán)境因素對 TYLCD 的發(fā)病影響較大 田間調(diào)查發(fā)現(xiàn) 隨著溫度的升高 抗病基 因的抗性降低 但無有力的試驗數(shù)據(jù)作支撐 本研究中發(fā)現(xiàn) 在低溫環(huán)境下 Ty 1 Ty 3 對 TYLCV 的積累存在一定抑制作用 與感病番茄相比其病毒含量顯著下降 可以延緩植株發(fā)病 與 Michelson 等 1994 和 Abdallat 等 2010 的研究結(jié)果一致 在常溫和高溫環(huán)境下 含 Ty 1 Ty 3 的 9706TR No 9 在接種 35 d 后體內(nèi) TYLCV 的含量與近等基因系感病材料 9706TS No 8 中無顯著差 異 這與張輝 2009 的研究結(jié)果一致 并與溫室環(huán)境下的結(jié)果相符 通過試驗期間改變環(huán)境溫度 研究各抗病基因的抗病性與溫度的關(guān)系發(fā)現(xiàn) 早期低溫后期高溫 Ty 1 Ty 3 仍具有顯著的抑制 TYLCV復(fù)制的效果 而早期高溫后期低溫 Ty 1 Ty 3 抑制 TYLCV的 效果則不佳 這與生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)的含 Ty 1 Ty 3 的番茄品種高溫抗性減弱 低溫抗性恢復(fù)的現(xiàn)象不符 可能是變溫處理的時間較短所致 在條件許可的情況下 應(yīng)延長變溫處理時間再進行觀察 不同的抗性基因在不同的環(huán)境條件下對 TYLCV 的復(fù)制表現(xiàn)出不同的作用方式 這揭示了 TYLCV 抗性基因復(fù)雜的作用方式 也為番茄栽培和抗 TYLCV 品種的選育提供了參考 References Abdallat A M A Debei H S A Asmar H Misbeh S Quraan A Kvarnheden A 2010 An efficient in vitro inoculation method for Tomato yellow leaf curl virus Virology Journal 7 1 84 92 Abhary M Patil B L Fauquet C 2007 Molecular biodiversity taxonomy and nomenclature of tomato yellow leaf curl like viruses Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease Berlin Springer 85 118 Anbinder I Reuveni M Azari R Paran I Nahon S Shlomo H Chen L Lapidot M Levin I 2009 Molecular dissection of Tomato leaf curl virus resistance in tomato line TY172 derived from Solanum peruvianum Theoratical and Applied Genetics 119 3 519 530 Antignus Y Cohen S 1994 Complete nucleotide sequence of an infectious clone of a mild isolate of Tomato yellow leaf curl virus TYLCV Phytopathology 84 7 707 712 Bar Ziv A Levy Y Hak H Mett A Belausov E Citovsky V 2012 The Tomato yellow leaf curl virus TYLCV V2 protein interacts with the host papain like cysteine protease CYP1 Plant Signaling 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